CN113105541B - 一种胶原蛋白纯化的方法 - Google Patents
一种胶原蛋白纯化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113105541B CN113105541B CN202110442977.9A CN202110442977A CN113105541B CN 113105541 B CN113105541 B CN 113105541B CN 202110442977 A CN202110442977 A CN 202110442977A CN 113105541 B CN113105541 B CN 113105541B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- solution
- mixed solution
- bioflocculant
- filter membrane
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 104
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 44
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 32
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims abstract description 19
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 19
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 18
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 15
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 claims description 15
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 15
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 15
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 claims description 13
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 abstract 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 210000001361 achilles tendon Anatomy 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000003519 biomedical and dental material Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000005003 food packaging material Substances 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种胶原蛋白纯化的方法，涉及蛋白质加工技术领域。本发明采用硅藻土+生物絮凝剂的方式将溶液中的不溶物和非酸溶性蛋白等组分沉淀，然后进行板框过滤将其去除，不仅操作简单，而且可以节约后续超滤时间，提高胶原蛋白的收率和纯度；盐析过程中使用质量分数为15‑25％的氯化铵和质量分数为30‑40％的硫酸铵的混合物，并控制两者的体积比为5‑10:1，可以明显增加胶原蛋白的沉淀量，进而提高胶原蛋白的收率；最后采用超滤膜结合管式超滤膜的方式对混合液进行除盐，能够将盐析过程中的盐全部脱除，保证了得到胶原蛋白的纯度，进而避免了因胶原蛋白中含有盐而造成的稳定性降低。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质加工技术领域，具体涉及一种胶原蛋白纯化的方法。
背景技术
胶原蛋白，是一种产生于动物成纤细胞的天然生物高分子，占哺乳动物蛋白质总量的三分之一。从结构上看，胶原蛋白分子是以超分子构造存在于细胞外基质中的。胶原蛋白最为普遍的一种结构特征是三螺旋构造，是由三条α多肽链构成，而多肽链之间，则是以右手螺旋构型交互缠绕构成超螺旋结构，这使胶原蛋白分子十分稳定。由于其结构和组成上的一系列特点，胶原蛋白具备良好的修复性、生物相容性、机械弹性、低免疫原型等性质，胶原蛋白及相关衍生产品，在食品、美容、医药、生物学等领域应用广泛，发挥着重要作用。
在医学领域胶原蛋白的低抗原性、生物相容性、修复性以及生物可降解性，是胶原蛋白成为优秀的生物医学材料的重要保证，几十年来科研人员利用胶原蛋白制作出多种生物医疗产品，成功应用于临床医学、临床治疗上。例如，在治疗烧伤烫伤上，胶原蛋白常被用作治疗烧伤的敷料，能够促进肉芽组织和上皮细胞的形成，减小伤口的挛缩的抗原反应、止血性能好；在创伤外科中，胶原蛋白除了发挥其低抗原性、生物相容性的特点，还能提供与真皮类似的物理形态结构；在组织工程上，胶原蛋白的重要性更加凸显，在血管膜、人工皮肤、心脏支架、心脏瓣膜、骨骼代用品上发挥重要作用。可以说，胶原带白是临床医学中最为重要的生物材料之一。
在食品领域胶原蛋白由氨基酸构成，具有包括人体必需的7种氨基酸在内的、除色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸之外的18种氨基酸，具备一般蛋白质中少见的焦谷氨酸、羟脯氨酸和羟基赖氨酸。其中，甘氨酸、脯氨酸和羟脯胺酸的含量相当之高，因此，胶原蛋白作为一种高营养价值的保健食品，起到维持肌肤弹性、强化韧性、强筋健骨的作用。另外，胶原蛋白也被广泛用于食品添加剂、调味品、食品包装材料等方面。
在美容领域胶原蛋白的重要功效之一是维持皮肤的弹性，其中的秘密就源于胶原蛋白的交联。胶原蛋白参与组成人体皮肤的真皮层，它与少量弹性蛋白一起形成规则的、具有高机械强度的纤维网状结构，使皮肤具有一定的弹性和硬度，并为表皮输送水分。最早是美国使用牛胶原注射来修复疤痕和祛除皱纹，在女性美容上起到了不错的效果。在化妆品中，如果添加胶原多肽，能够通过相容性协同吸收，也能填充在皮肤基质之间，使皮肤饱满而富有弹性。
胶原蛋白因其特殊的α肽链三螺旋结构而具有一系列特性，包括低免疫原性、生物相容性、止血性、优良机械弹性、可生物降解性等等，在临床医学、食品行业、化妆护肤等领域发挥重要作用。
胶原的提取主要来自生物体，人工合成还没有进入大规模产业化，因此使用过程中首先对胶原蛋白进行纯化，目前常用的纯化方法有盐析、透析等方法，或者盐析和透析相结合的方法。
中国专利申请201811465406.1中公开了一种胶原蛋白提取方法，包括：①牛跟腱解冻，去血水、表面异物和筋膜，用溶液进行一次预处理；②步骤一处理的牛跟腱去脂肪膜，用溶液进行二次预处理；③步骤二处理完的牛跟腱冷冻后切片，用溶液进行前处理；④将前处理完的牛跟腱切片持续酶解，离心取上清制备胶原粗提液；⑤调节胶原粗提液pH，加入中性盐盐析，离心获得胶原蛋白沉淀；⑥加入磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀，获得特定浓度的胶原蛋白，该申请采用酸-酶-盐相结合的方法，可得到特定浓度范围的胶原蛋白。
中国专利申请201610893949.8中提供了一种高效简便的胶原蛋白超滤纯化方法，主要包括以下步骤：将溶解好的胶原蛋白溶液进行稀释；开启输送泵，胶原蛋白溶液通过纯化系统，进行纯化，通过反复纯化可制得纯化的胶原蛋白，该纯化方法安全有效、低风险、简单易行，节能节电，生产效率高，不污染环境，适宜于工业化生产，但是得到的胶原蛋白的收率和纯度都不能满足要求。
因此，需要开发一种操作简单，且纯化效率高的胶原蛋白纯化的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有胶原蛋白纯化技术中的不足之处，提供了一种胶原蛋白的纯化方法。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种胶原蛋白纯化方法，主要包括以下步骤：
(1)取胶原蛋白粗提取液，加水稀释后，加入硅藻土和生物絮凝剂，吸附后进行板框过滤，得到混合液A；
(2)向混合液A中加入盐进行盐析后得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液使用滤膜过滤，得到混合液C；
(3)将混合液C进行管式超滤膜过滤，得到纯化后的胶原蛋白；
上述步骤(1)中所述的生物絮凝剂选自半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖中的一种或几种；
优选地，所述的生物絮凝剂选自半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖中的一种或几种；
再优选地，所述的生物絮凝剂选自半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖中的一种或几种；
进一步优选地，所述的生物絮凝剂为半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物；
再进一步优选地，所述的生物絮凝剂为质量比4-5:2:4-5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物；
更进一步优选地，所述的生物絮凝剂为质量比4:2:5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物。
所述的硅藻土与生物絮凝剂的质量比为3-6:1；
优选地，所述的硅藻土与生物絮凝剂的质量比为4-5:1；
进一步优选地，所述的硅藻土与生物絮凝剂的质量比为5:1。
所述的硅藻土的加入量与胶原蛋白粗提取液的质量体积比为10-40：1(g/L)。
上述步骤(1)在絮凝过程中还添加了乙酸，调节溶液pH值为2.5-3.5。
本发明在实施过程中意外地发现，在溶液中加入乙酸调节pH值为2.5-3.5能够更好的加速生物絮凝剂的絮凝，提高除杂效率，节约时间。
上述步骤(2)中所述的滤膜过滤的粒径分别为5微米、3微米、0.45微米，即复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C。
上述步骤(2)中所述的盐选自氯化钠、氯化铵、硫酸铵中的一种或几种；
优选地，上述步骤(2)中所使用的的盐为质量分数为15-25％的氯化铵和质量分数为30-40％的硫酸铵的混合物，所述的氯化铵和硫酸铵的体积比为5-10:1；优选为8:1。
所述的混合物A与盐溶液的体积比为1:1。
上述步骤(3)中所述的管式超滤膜过滤的截留分子量100KD。
本发明提供了一种胶原蛋白纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)取胶原蛋白粗提取液，加水稀释后，加入乙酸调节pH值为2.5-3.5，加入质量比为3-6:1硅藻土和生物絮凝剂，吸附后进行板框过滤，得到混合液A；
(2)向混合液A中加入体积比为5-10:1质量分数为15-25％的氯化铵和质量分数为30-40％的硫酸铵混合溶液进行盐析得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；
(3)将混合液C使用截留分子量为100KD的管式超滤膜过滤，得到纯化后的胶原蛋白。
所述的生物絮凝剂为质量比4-5:2:4-5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物；
优选地，所述的生物絮凝剂为质量比4:2:5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物。
所述的硅藻土的加入量与胶原蛋白粗提取液的质量体积比为30:1(g/L)。
所述的混合物A与盐溶液的体积比为1:1。
本发明中纯化得到的胶原蛋白的分子量为100-300KD。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明在胶原蛋白纯化过程中首先采用絮凝剂对混合液进行絮凝，将大分子杂质除去，本发明采用硅藻土+生物絮凝剂的方式将溶液中的不溶物和非酸溶性蛋白等组分沉淀，然后进行板框过滤将其去除，不仅操作简单，而且可以节约后续超滤时间，提高胶原蛋白的收率和纯度；
(2)盐析过程中常用的盐为氯化钠，不仅能够有效的纯化胶原蛋白，而且相对其他纯化方法费用很低，但是盐析后得到的胶原蛋白收率不高，且影响胶原蛋白的纯度，本发明在实施过程中意外地发现是使用质量分数为15-25％的氯化铵和质量分数为30-40％的硫酸铵的混合物，并控制两者的体积比为5-10:1，可以明显增加胶原蛋白的沉淀量，进而提高胶原蛋白的收率，结合分级过滤的方式，可以明显提高胶原蛋白的纯度；
(3)本发明采用超滤膜结合管式超滤膜的方式对混合液进行除盐，能够将盐析过程中的盐全部脱除，保证了得到胶原蛋白的纯度，进而避免了因胶原蛋白中含有盐而造成的稳定性降低。
附图说明
图1为实施例1-3纯化得到的胶原蛋白的电泳图；
标准品为未纯化前的胶原蛋白粗提取液，纯化1为实施例1纯化后的胶原蛋白，纯化2为实施例1纯化后的胶原蛋白，纯化3为实施例3纯化后的胶原蛋白；每组测试两次。
具体实施方式
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1一种胶原蛋白纯化方法
具体包括以下步骤：
(1)取胶原蛋白粗提取液(210L，约含胶原蛋白400g)，加水稀释后，加入乙酸调节pH值为2.5，加入质量比为3:1硅藻土(2.1kg)和生物絮凝剂(0.7kg)，搅拌30min吸附后进行板框过滤，得到混合液A；
(2)向混合液A中加入等体积且体积比为5:1质量分数为15％的氯化铵和质量分数为30％的硫酸铵混合溶液进行盐析2h后得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；
(3)将混合液C进行管式滤膜过滤(截留分子量100KD)，得到纯化后的胶原蛋白(343.2g)。
步骤(1)所述的生物絮凝剂为质量比4:2:4半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物。
实施例2一种胶原蛋白纯化方法
具体包括以下步骤：
(1)取胶原蛋白粗提取液(210L，约含胶原蛋白400g)，加水稀释后，加入乙酸调节pH值为3.5，加入质量比为6:1硅藻土(8.4kg)和生物絮凝剂(1.4kg)，吸附后进行板框过滤，然后再进行0.1μm滤膜过滤，得到混合液A；
(2)向混合液A中加入等体积且体积比为10:1质量分数为25％的氯化铵和质量分数为40％的硫酸铵混合溶液进行盐析得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；
(3)将混合液C进行管式滤膜过滤(截留分子量100KD)，得到纯化后的胶原蛋白(339.6g)。
所述的生物絮凝剂为质量比5:2:4半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物。
实施例3一种胶原蛋白纯化方法
具体包括以下步骤：
(1)取胶原蛋白粗提取液(210L，约含胶原蛋白400g)，加水稀释后，加入乙酸调节pH值为3.0，加入质量比为5:1硅藻土(6.3kg)和生物絮凝剂(1.26kg)，吸附后进行板框过滤，然后再进行0.1μm滤膜过滤，得到混合液A；
(2)向混合液A中加入体积比为8:1质量分数为20％的氯化铵和质量分数为35％的硫酸铵混合溶液进行盐析后得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；
(3)将混合液C进行管式滤膜过滤(截留分子量100KD)，得到纯化后的胶原蛋白(354.4g)。
所述的生物絮凝剂为质量比4:2:5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物。
对比例1
与实施例3的区别在于：只添加了硅藻土作为絮凝剂，其他步骤和操作与实施例3相同，得到纯化后的胶原蛋白(328.8g)。
对比例2
与实施例3的区别在于：只添加了生物絮凝剂作为絮凝剂，其他步骤和操作与实施例3相同，得到纯化后的胶原蛋白(329.2g)。
对比例3
与实施例3的区别在于：所述的生物絮凝剂为质量比2:5的鼠李糖和葡萄糖的混合物，其他步骤和操作与实施例3相同，得到纯化后的胶原蛋白(324g)。
对比例4
与实施例3的区别在于：步骤(2)中加入了氯化钠进行盐析，即(2)向混合液A中加入等体积0.04mol/L的氯化钠溶液进行盐析得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；其他步骤和操作与实施例3相同，得到纯化后的胶原蛋白(329.6g)。
对比例5
与实施例3的区别在于：步骤(2)向混合液A中加入等体积质量分数为25％的氯化铵溶液进行盐析后得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液使用3微米的滤膜过滤，所得滤液a再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；其他步骤和操作与实施例3相同，得到纯化后的胶原蛋白(330.4g)。
对比例6
与实施例3的区别在于：步骤(2)向混合液A中加入等体积质量分数为40％的硫酸铵溶液进行盐析后得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；其他步骤和操作与实施例3相同，得到纯化后的胶原蛋白(331.2g)。
实施例1-3以及对比例1-6纯化所得到的胶原蛋白的收率和纯度
| 收率％ | 纯度％ | |
| 实施例1 | 85.8 | 99.7 |
| 实施例2 | 84.9 | 99.6 |
| 实施例3 | 88.6 | 99.7 |
| 对比例1 | 82.2 | 99.1 |
| 对比例2 | 82.3 | 98.9 |
| 对比例3 | 81.0 | 99.0 |
| 对比例4 | 82.4 | 98.7 |
| 对比例5 | 82.6 | 99.0 |
| 对比例6 | 82.8 | 99.1 |
根据上表的检测数据可以看出，本发明提供的纯化方法能够在保证胶原蛋白较高收率的基础上提高胶原蛋白的纯度，使胶原蛋白的收率可以达到85％左右，纯度最高可达到99.7％，尤其是实施例3中加入质量比为5:1硅藻土和生物絮凝剂作为絮凝剂，并控制生物絮凝剂为质量比4:2:5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物，能够使胶原蛋白溶液中的杂质沉积，进而除去，提高了胶原蛋白的纯度，盐析过程中使用体积比为8:1质量分数为20％的氯化铵和质量分数为35％的硫酸铵混合溶液进行盐析，能够使溶液中的胶原蛋白沉积，并采用滤膜过滤和管式滤膜过滤，将盐全部脱除，保证了得到胶原蛋白的纯度，使得到的胶原蛋白纯度达到99.7％，收率达到88.6％。
应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (3)
1.一种胶原蛋白纯化方法，其特征在于：主要包括以下步骤：
(1)取胶原蛋白粗提取液，加水稀释后，加入硅藻土和生物絮凝剂，吸附后进行板框过滤，得到混合液A；
(2)向混合液A中加入盐进行盐析后得固体B，将固体B复溶后，得到的复溶液使用滤膜过滤，得到混合液C；
(3)将混合液C进行管式超滤膜过滤，得到纯化后的胶原蛋白；
步骤(2)中所述的滤膜过滤的粒径分别为5微米、3微米、0.45微米，即复溶液先使用5微米的滤膜过滤，所得滤液a再使用3微米的滤膜过滤，所得滤液b再用0.45微米的滤膜过滤，得混合液C；
步骤(1)在絮凝过程中还添加了乙酸，调节溶液pH值为2.5-3.5；
步骤(2)中所使用的的盐为质量分数为15-25％的氯化铵和质量分数为30-40％的硫酸铵的混合物；
所述的氯化铵和硫酸铵的体积比为8:1；
所述的生物絮凝剂为质量比4-5:2:4-5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物；
所述的硅藻土与生物絮凝剂的质量比为3-6:1。
2.根据权利要求1所述的胶原蛋白纯化方法，其特征在于：所述的生物絮凝剂为质量比4:2:5半乳糖葡糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物。
3.根据权利要求1所述的胶原蛋白纯化方法，其特征在于：所述的硅藻土与生物絮凝剂的质量比为5:1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110442977.9A CN113105541B (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 一种胶原蛋白纯化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110442977.9A CN113105541B (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 一种胶原蛋白纯化的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113105541A CN113105541A (zh) | 2021-07-13 |
| CN113105541B true CN113105541B (zh) | 2022-03-11 |
Family
ID=76719646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110442977.9A Active CN113105541B (zh) | 2021-04-23 | 2021-04-23 | 一种胶原蛋白纯化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113105541B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1749296A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-03-22 | 大连轻工业学院 | 一种酸溶性鱼皮胶原蛋白及其制备方法 |
| CN101289507A (zh) * | 2007-04-17 | 2008-10-22 | 史宗洁 | 一种胶原蛋白及胶原多肽及其制备方法和应用 |
| CN101898821A (zh) * | 2010-04-20 | 2010-12-01 | 南京农业大学 | 一种生物-硅藻土复合絮凝剂 |
| CN104531817A (zh) * | 2015-01-07 | 2015-04-22 | 吴凌天 | 一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法 |
| CN108892358A (zh) * | 2018-09-11 | 2018-11-27 | 青岛博尔优生物科技有限公司 | 一种用于污泥处理的高效复合生物絮凝剂及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11051532B2 (en) * | 2017-09-22 | 2021-07-06 | Impossible Foods Inc. | Methods for purifying protein |
-
2021
- 2021-04-23 CN CN202110442977.9A patent/CN113105541B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1749296A (zh) * | 2005-10-11 | 2006-03-22 | 大连轻工业学院 | 一种酸溶性鱼皮胶原蛋白及其制备方法 |
| CN101289507A (zh) * | 2007-04-17 | 2008-10-22 | 史宗洁 | 一种胶原蛋白及胶原多肽及其制备方法和应用 |
| CN101898821A (zh) * | 2010-04-20 | 2010-12-01 | 南京农业大学 | 一种生物-硅藻土复合絮凝剂 |
| CN104531817A (zh) * | 2015-01-07 | 2015-04-22 | 吴凌天 | 一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法 |
| CN108892358A (zh) * | 2018-09-11 | 2018-11-27 | 青岛博尔优生物科技有限公司 | 一种用于污泥处理的高效复合生物絮凝剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Identification of key constituents and structure of the extracellular polymeric substances excreted by Bacillus megaterium TF10 for their flocculation capacity;Shi-Jie Yuan等;《Environ. Sci. Technol.》;20101221;第45卷(第3期);第1152-1157页 * |
| 微生物发酵透明质酸的制备及测定;吕磊等;《药物生物技术》;20090415;第16卷(第2期);第162-165页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113105541A (zh) | 2021-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10421777B2 (en) | Process for extraction of fish collagen and formulations of 3D matrices of collagen for biomedical and therapeutic applications thereof | |
| ES2811101T3 (es) | Procedimiento para la preparación y purificación de la sal de sodio de ácido hialurónico | |
| CN109349419B (zh) | 一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉 | |
| CN101381411B (zh) | 星虫胶原蛋白及其制备方法 | |
| CN109806182B (zh) | 一种含透明质酸和氨基酸的组合物及其制备方法和应用 | |
| Valenzuela-Rojo et al. | Tilapia (Oreochromis aureus) collagen for medical biomaterials | |
| CN105451786B (zh) | 交联的透明质酸、用于其制备的工艺及其在美学领域中的用途 | |
| CN112778412B (zh) | 一种低内毒素胶原蛋白的制备方法 | |
| CN111393521A (zh) | 一种水母胶原蛋白的提取方法 | |
| CN105131109A (zh) | 一种胶原蛋白的提取方法 | |
| WO2023040083A1 (zh) | 海鲷鱼胶原蛋白肽的制备方法 | |
| KR101916759B1 (ko) | 고농도, 고순도의 동종 콜라겐 제조 방법 및 동종 콜라겐 지지체의 제조방법 | |
| CN112501229B (zh) | 一种牛骨胶原肽的生产工艺 | |
| CN104548201A (zh) | 一种角膜组织修复材料及其制备方法 | |
| CN113105541B (zh) | 一种胶原蛋白纯化的方法 | |
| CN109700998A (zh) | 一种复方肌肤损伤再生修复剂及其制备方法 | |
| WO2021005491A1 (en) | Eco-friendly gels from marine biopolymers, products and uses thereof | |
| CN1333082C (zh) | 一种碱溶胀－酸酶解高效提取胶原的方法 | |
| CN104017073A (zh) | 一种胶原蛋白的制备方法 | |
| Silva et al. | Biomaterials from marine-origin biopolymers | |
| CN113143789B (zh) | 组合物及其在皮肤护理中的应用 | |
| CN110950976B (zh) | 一种氨基葡萄糖透明质酸盐及应用 | |
| JPH0450293B2 (zh) | ||
| Maistrenko et al. | Collagen matrices from leather industry wastes for biomedical application | |
| CN114774501B (zh) | 鱼皮胶原蛋白海绵材料及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |