CN109349419B - 一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉，该复合牦牛骨胶原蛋白肽粉由牦牛骨胶原蛋白通过酶解法制得，在该酶解法中使用复合酶。还提供了该复合牦牛骨胶原蛋白肽粉的制备方法和用途。所述制备方法具有更有效的脱钙效果，并且制得的复合牦牛骨胶原蛋白肽具有良好的细胞修复效果。

Description

一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉

技术领域

本发明属于食品深加工技术领域，其涉及由牦牛骨制备胶原蛋白肽的方法以及由该方法制得的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉，更具体地，涉及一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉及其制备方法和用途。

背景技术

牦牛是高寒地区的特有牛种，是我国和世界稀有珍贵的地方类半野生特有种群，它生长在高寒缺氧、枯草期和冰封期长达半年左右的严峻自然条件下，生长在无污染的蓝天、碧水和牧草茂盛的青藏高原，牧草中还生长着众多有益的中草药，牦牛自由地生长在海拔3500米以上绿色生态的安多大草原环境中，草场无重金属残留，纯正、自然。在这样的自然环境下生存的牦牛，不仅拥有发达的骨骼与肌腱运动系统，而且是真正无污染的绿色产品，是特别优质的胶原提取宝库。

与一般牛骨相比，因牦牛鲜骨骨骼密度大，骨质优良，骨骼中蕴藏的胶原蛋白小肽量大，氨基酸含量高，是非常适合的小分子骨胶原肽的提取来源。牦牛骨胶原蛋白肽牦牛骨胶原蛋白肽，是从海拔3000米以上、天然牧养的牦牛骨中提取的优质活性骨胶原蛋白肽，是极易被人体吸收的小分子胶原蛋白肽。

胶原蛋白多肽是胶原蛋白或明胶经蛋白酶水解的小分子蛋白质，分子量一般约为10Da-10kDa。从结构上讲，胶原多肽是胶原蛋白的三螺旋结构彻底打开，肽链被降解为短链肽的多肽混合物。胶原蛋白肽一般由数量很少的氨基酸组成，市场上出现的常为寡肽或小肽产品，因其分子量小，具有易吸收的功效。此外，胶原蛋白肽具有一些特殊的活性功能，例如：免疫调节、抗氧化、抑菌、抗高血压、抗衰老、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松等作用。

施用胶原蛋白肽化合物已被证明在吸收循环后能够在软骨积累，该机制有助于饱受关节疾病折磨的关节病患者，其可作为促进骨形成添加剂和骨健康基本补充剂。另外，由于伤口愈合过程中基质金属蛋白酶(MMPs)的蛋白降解活性与肉芽组织合成和沉积胶原蛋白的细胞活性之间的平衡是必要的，因此许多新的基于胶原蛋白的伤口护理产品旨在减少过度的蛋白酶水平并使伤口环境恢复平衡。此外，这些胶原蛋白肽产品有助于促进功能性细胞外基质蛋白来刺激愈合过程，研究显示大甲鲹和红牙鱼或的骨骼中提取的I型胶原蛋白在伤口愈合中的疗效进行了研究，证实施用这些胶原蛋白的膜制剂对Wistar大鼠切除型伤口的愈合起到了促进作用。

CN105385737A公开了一种牦牛骨胶原寡肽的制备工艺，由以下步骤组成：将阴干的牦牛骨粉碎至50目，并用碱、酸处理牦牛骨，除去脂肪和其它杂质，提取获得高纯度的牦牛骨胶原蛋白提取液；然后用两步酶解法酶解胶原蛋白提取液，酶解结束后，采用离心机协同多级膜分离系统纯化酶解液，得到牦牛骨胶原寡肽溶液；然后喷雾干燥牦牛骨胶原寡肽溶液，得到纯度大于90％，分子量小于1000Da的牦牛骨胶原寡肽。

CN107630061A公开了一种牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：步骤一：将冷冻牦牛骨原料经过优选和清理后通过硬质骨破碎机破碎制得牦牛骨破碎料；步骤二：将所述牦牛骨破碎料进行清洗去杂；步骤三：将经过清洗去杂的所述牦牛骨破碎料采用乙醚脱脂处理后，再使用EDTA或HCl的方法进行脱钙处理得到脱脂脱钙牦牛骨；步骤四：将脱脂脱钙牦牛骨使用乙酸进行溶解并加入胃蛋白酶进行酶解处理；步骤五：将酶解后所得上清液加入NaCl溶液进行盐析；步骤六：将盐析后产物进行离心得到沉淀物；步骤七：将沉淀物冻干得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白成品。

CN106148466A公开了一种牦牛胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：(1)将牦牛组织粉碎；(2)将经步骤(1)的牦牛组织进行酶解，得到组织液；(3)从所述组织液中分离中胶原蛋白液；(4)将所述胶原蛋白液层析，得到胶原蛋白固体。

CN105753972A公开了一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法，其包括如下步骤：步骤一、从牦牛骨中提取出分子量2KDa-4KDa的胶原多肽和其他胶原多肽；步骤二、将步骤一中得到的分子量2KDa-4KDa的胶原多肽与Ca²⁺进行螯合以得到牦牛骨胶原多肽螯合钙，螯合中，温度为50-55℃，pH值为6.8-7.2，螯合时间为1.5-2小时；和步骤三、将步骤一中得到的其他胶原多肽浓缩得到骨多肽。

CN103783254A公开了一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，工艺过程包括原料前处理，明胶提取，分离胶原蛋白提取液，复合酶解，灭酶灭菌，分离肽液，脱色脱腥，浓缩干燥。其复合酶解时所采用的复合酶是由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶组成。其优点是，明胶提取过程简单，利用混合液的流动，将油脂和明胶完全分离；酶解温度为48-52℃，时间为4-6小时。

CN102229971A公开了一种用牦牛鲜骨制备胶原蛋白肽的方法，所述的方法包括下列步骤：1)酶解：将去髓牦牛鲜骨粗碎，加水分散，再加入相应量的酶和缓冲溶液，恒温搅拌酶解，用纱布过滤，得一次酶解液；2)二次酶解：在一次酶解液中加入另一种酶，恒温搅拌酶解，升温使酶失活，得二次酶解液；3)过滤：在二次酶解液中加絮凝剂，搅拌沉淀杂质，滤布过滤，得滤液；4)超滤：将滤液通过超滤膜除杂，滤液略微浓缩，得浓缩液；5)喷雾干燥：将浓缩液喷雾干燥，即得产品。

CN105018554B公开了一种小分子牛骨胶原肽及其制备方法，所述制备方法依次包括以下步骤：粉碎、提取分离、酶解、复合过滤、浓缩和干燥；所述酶解过程为：在牛骨胶原蛋白提取液中加入骨胶原蛋白酶进行一次酶解；一次酶解后，用混合酸调节一次酶解液的pH值至6-7，然后加入脯氨酸蛋白酶进行二次酶解，二次酶解时间为2h-4h，脯氨酸蛋白酶的加入量为牛骨胶原蛋白质量的0.1％-0.3％。

CN108208851A公开了一种五元复合小分子胶原蛋白肽粉，以重量百分比计，由以下组份制成：牛骨胶原蛋白肽10％-50％，鱼胶原蛋白肽10％-50％，核桃肽10％-30％，小麦肽5％-20％，玉米肽5％-20％，通过采用牛骨胶原蛋白肽、深海鳕鱼皮胶原蛋白肽、核桃肽、小麦肽、玉米肽五种胶原蛋白肽粉，制得五元复合小分子胶原蛋白肽粉。

CN107648205A公开了一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的质量百分比如下所示：牛骨胶原低聚肽50-70％，改性几丁聚糖溶液0.5-5％，海参寡肽或天蚕素B 5-20％或1-5％，人参寡肽1-5％，保湿剂0-20％，余量为溶剂。

“牛骨营养品质评价与牦牛骨胶原蛋白肽功效研究”，贾伟，《甘肃农业大学》，2017，采集我国4个地域牦牛和7个主要地域牛种的肱骨、股骨、脊骨、肋骨四个部位为样本进行营养组分检测,使用主成分、聚类、判别分析方法对牛骨样本进行营养品质评价，以甘南牦牛骨为原料，研究了酸法制备牦牛骨胶原蛋白和酶解制得不同分子量牦牛骨胶原多肽的结构及组成，并以人成骨细胞为体外模型评价了牦牛骨胶原多肽的营养功效。

“胶原蛋白肽含药血清促进成骨细胞增殖和分化”，刘俊丽等，《中国骨质疏松杂志》，2018(6)，阐明了牛骨CP化合物血清对成骨细胞增殖与分化的影响，通过制备牛骨CP化合物大鼠血清，牛骨CP化合物处理的实验组和未经处理的对照组大鼠血清浓度为3％、6％、10％,加到无血清的DMEM溶液中，用MTT法和流式细胞术分别检测牛骨CP血清对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响。

然而，在现有的牦牛骨胶原蛋白肽制备技术中，由牦牛骨制备胶原蛋白肽多是沿用或照搬普通牛骨的提取和酶解方法，忽略了牦牛骨和普通牛骨之间的差异，例如由于牦牛的特殊生长条件，牦牛骨的钙含量要明显高于普通的饲养牛并且骨质结合强度明显较高，用于普通饲养牛的脱矿物剂就难以有效脱除牦牛骨中的钙。

因此，本领域需要一种对于由牦牛骨制备胶原蛋白肽过程中更有效的脱钙方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人在大量试验以及先前基础研究的基础上，经过进一步深入探索，通过合作研发，提供了以下技术方案。

在本发明的一方面，提供了一种修复细胞(特别是人体细胞)的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉，其中该复合牦牛骨胶原蛋白肽粉由牦牛骨胶原蛋白通过酶解法制得，在该酶解法中使用复合酶。

在本发明的另一方面，提供了一种制备所述复合牦牛骨胶原蛋白肽粉的方法，该方法包括以下步骤：(1)将牦牛骨进行预处理；(2)将牦牛骨进行脱脂处理；(3)将牦牛骨进行脱矿物(即脱钙)处理；(4)提取胶原蛋白；(5)纯化胶原蛋白；(6)将胶原蛋白进行酶解；和(7)将胶原蛋白多肽进行纯化。

在现有技术中，在酶解过程中，通常采用单一的酶对胶原蛋白进行酶解，然而当采用单一的酶进行酶解时，获得的小分子肽种类单一，例如通常是分子量相对比较集中的肽，从而使胶原蛋白肽的功能也受到一定限制。

在本发明中，优选地，从众多酶中选择出BSC酶和胰蛋白酶的组合，或者Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的组合。

更选地，BSC酶和胰蛋白酶的用量比例为1:2-2:1(酶单位之比)。Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的用量比例为1:2-2:1(酶单位之比)。所述复合酶可以发挥多酶体系的协同性。在所述复合酶的选择中，并不是简单的组合，这是由于不同的酶其酶解活性条件不同，在选择不同的酶进行复配时，需要考虑到如何兼顾二者活性的最佳发挥。

所述BSC酶可以商购，例如可得自河南科技大学。

或者，可以通过下面方法制得比其纯度更高的BSC酶：(1)将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus MBL13-U)以4mL/100mL的接种量接种于pH 6.4的发酵培养基中，在35℃，160r/min的条件下反应46h，以12000g离心力在4℃下高速离心30min，收集上清液即为BSC的粗酶液；(2)将粗酶液依次通过硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S200 HR凝胶层析，最终得到纯的BSC酶。

在该改进的层析方法中，通过使用CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析替代常规的DEAE-Sepharose Fas Flow离子交换层析，能够获得较高的酶活性。这是因为CM-Sepharose Fast Flow离子交换剂以羧甲基作为带电基团，在pH 6-13的范围内均处于带电状态。研究发现，离子交换剂的这种特性使得能够有效除去粗酶液中的杂质蛋白，且同时，又能够防止可激活目标蛋白的其它离子、小分子或者蛋白质被过度纯化掉，即防止激活因子在纯过程化中被完全去掉。所述这些有机或者无机激活因子存在可以直接影响目的蛋白质的空间构象或者在溶液中形成某种多酶复合体，因此能够加大酶的活性。在现有的酶纯化步骤中，尚未意识到该问题。

其中硫酸铵分级沉淀可以采取下面方法进行：向粗酶液中缓慢加入(NH₄)₂SO₄，使其溶液饱和度达到30％，4℃静置8h后，在离心力为14800g，4℃条件下高速离心25min，接着向上清液中加入(NH₄)₂SO₄，使其溶液饱和度达到75％，采取同样方法离心，收集沉淀；沉淀用去离子水溶解离心，将上清液移入透析袋内，4℃，2-3h更换一次去离子水，将透析后的去离子水用BaCl₂检测，直到检测不出沉淀，透析结束，将透析后的酶液冷冻干燥得到经硫酸铵分级沉淀处理的样品。

后续层析步骤可以按照本领域的常规洗脱方法进行。在洗脱中，收集酶活较高的部分，干燥后得到BSC酶的纯品。

就本发明而言，优选地，该复合牦牛骨胶原蛋白肽粉中的胶原蛋白肽的分子量呈双峰分布，分别分布在700-1000Da范围内和320-400Da范围内。

优选地，320-400Da范围内的肽与700-1000Da范围内的肽的重量比为5:1-1:2，优选4:1-1:1。

所述两种不同的分子量分布表明其中含有两种(或至少两种)不同类型的胶原蛋白肽。由于胶原蛋白酶解所得各种肽的分子量十分接近，给其分离带来一定困难，因此要想得到理想的目的胶原蛋白肽需要经过多步骤纯化，因此现有的骨胶原蛋白肽很多都是以在某个单一分子量范围内的多种肽成分的组合物形式使用。

在本发明的另一方面，提供了一种制备复合牦牛骨胶原蛋白肽粉的方法，该方法包括以下步骤：(1)将牦牛骨进行预处理；(2)将牦牛骨进行脱脂处理；(3)将牦牛骨进行脱矿物处理；(4)提取胶原蛋白；(5)纯化胶原蛋白；(6)将胶原蛋白水解；和(7)将胶原蛋白多肽进行纯化。

优选地，步骤(1)将牦牛骨进行预处理包括：将新鲜的牦牛骨去除骨膜，剔除残留的残肉、脂肪、筋膜、骨髓和其它非骨骼组织，用0.5-2.0wt.％浓度H₂O₂溶液浸泡(优选1-5h)，再用生理盐水冲洗以洗去残留的杂质，然后锯切成5mm-15mm的小块，优选约1mm的小块。如本领域技术人员所理解，该尺寸主要是指平均长度或平均直径。

本发明人发现，步骤(1)中用H₂O₂溶液进行浸泡处理能够更有效地除去未剔除干净的非骨骼组织中的杂蛋白。研究显示，这些杂蛋白的存在对后续酶解过程中的酶活性有明显的抑制作用。

优选地，步骤(2)将牦牛骨进行脱脂处理包括使用混合有机溶剂对牦牛骨小块进行脱脂。

优选地，混合有机溶剂为石油醚与氯仿的混合物，二者体积比为1:3-3:1。脱脂温度优选为30-50℃，脱脂时间优选为8-24h。牦牛骨与混合有机溶剂的重量比即固液比优选为1:5-1:10(重量比)。在该混合脱脂溶剂中，含有疏水性很好的氯仿，又含有脱脂效果特别好、特别是脱结合脂肪效果特别好的石油醚，且这两种试剂可以互溶，既能够溶出游离脂肪又可以溶出结合脂肪。

优选地，所述脱矿物(即脱钙)处理包括：先用0.5mol/L-1.0mol/L的EDTA溶液对脱脂后的牦牛骨进行处理，在用清水冲洗后，再用0.5mol/L-1.0mol/L的HCl溶液进行处理。

脱钙温度优选为20-50℃，脱钙时间优选为2-6h，固液比优选为1:3-1:6。

在一个特别优选的实施方案中，所述脱矿物(即脱钙)处理包括：先用0.5mol/L-1.0mol/L的EDTA溶液对脱脂后的牦牛骨进行处理后，再用0.01-0.2mol/L的下式(I)所示的脱钙剂溶液对牦牛骨进行处理，然后在用清水冲洗后，再用0.5mol/L-1.0mol/L的HCl溶液进行处理：

式(I)所示的脱钙剂(二乙烯三胺五乙酸)具有较高的安全性，适合于本发明的脱钙工艺。在本发明中，加入式(I)所示脱钙剂的目的是考虑到该脱钙剂与常规的EDTA相比，对H₂O₂的氧化能力具有高的耐受性，以及对Ca的更强的螯合能力。如果仅使用EDTA，则由于预处理步骤中使用的H₂O₂会残留在牦牛骨中，会在一定程度上导致EDTA螯合性能显著降低。另外，式(I)所示脱钙剂对钙的螯合能力明显强于EDTA，当与EDTA配合使用时，能够以较低的浓度将EDTA不能螯合的缔合钙给脱除，从而使脱钙更充分，提高后续胶原蛋白粉的提取率。在现有技术中尚未见将式(I)所示脱钙剂用于骨脱钙的报导。

由于钙质附着于骨质上面，若不进行脱除钙质，在提取胶原的过程中很难溶出，所以有必要提前脱钙处理。对于牦牛骨而言，与一般牛骨相比，钙质含量高，且更麻烦的是，钙质在骨质上的附着力更强，一般的脱钙方法例如常规的盐酸脱钙法难以非常有效地脱除钙质。参考图1，在采用式(I)所示脱钙剂时，能够有效除去骨质上的钙质，具有特别好的脱钙效果。

步骤(4)提取胶原蛋白和(5)纯化胶原蛋白可以按照常规方法进行。或者，也可以优选按照如下优选的方法进行：

优选地，步骤(4)和(5)可以按如下方法进行：用10倍体积的胃蛋白酶的0.5mol/L乙酸的溶液(蛋白酶浓度为0.2％(w/w))将脱钙骨进行消解，4℃下搅拌24h，12000g离心30min，收集上清液；沉淀再加5倍体积的上述胃蛋白酶溶液消解一次，收集上清液，将两次的上清液合并，即得提取得到胶原蛋白(即蛋白酶促溶性胶原蛋白粗液)。然后，用0.5mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH值至7.0-7.5，加入2mol/L的氯化钠溶液搅拌均匀进行盐析处理，4℃盐析过夜，12000g离心30min，收集沉淀，用0.5mol/L的乙酸溶液溶解后调节pH值至7.0-7.5，用Tris-HCl(优选pH＝7.5)透析1-2天，蒸馏水透析1-2天，以纯化提取的胶原蛋白，经透析平衡、浓缩后即得胶原蛋白溶液，最后将其冷冻干燥处理得经纯化的胶原蛋白成品。

优选地，在步骤(6)将胶原蛋白酶解过程中，将步骤(5)纯化胶原蛋白的一部分(纯化胶原蛋白的50-75％)进行酶解，其余部分不进行酶解或进行轻度酶解(在相同的水解条件下，其酶解时间优选为前者酶解时间的1/5-1/10)，然后将酶解产物与未水解或轻度酶解的纯化胶原蛋白合并。合并后的产物用于步骤(7)的处理。

更优选地，步骤(6)可以按如下方法进行：将冷冻干燥后的胶原蛋白分为两部分即第1部分和第2部分，第1部分与第2部分的重量比为3:1:-1:1，其中：将第1部分溶于0.5mol/L乙酸溶液中配成2mg/mL的胶原蛋白溶液，在50-60温度℃下加入前述复合酶(优选为BSC酶和胰蛋白酶的组合，或者Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶的组合，进一步优选地，1.0％(体积分数)酶总添加量)进行水解，时间为0.5-2.0h，优选1.5h，将水解后的胶原蛋白进行透析和浓缩，得浓缩液，然后进行冻干，得到水解后的短肽；将第2部分溶解后进行喷雾干燥(即不进行酶解)，得到白色粉末状粗肽(优选地，喷雾干燥设置进风温度110-120℃，出风温度60-80℃，进料温度为20-40℃，进样速度10-20r/min)，或者将第2部分按照与第1部分相同的酶解方式，区别仅在于酶解时间为前者的1/5，得到轻度水解后的粗肽。

在步骤(7)中，可以所述水解的短肽和粗肽合并，然后使用SepHadex G-50层析柱，用纯净水作为流动相洗脱，以0.5ml/min的流速在室温条件下对合并后的样品进行分离纯化，检测洗脱成分的分子量，收集具有所需组分的洗脱液，合并后冷冻干燥，即得本发明的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉。

本领域技术人员能够意识到，在酶解后可进行灭酶处理。灭酶处理可以采取常规方法进行，例如在80-90℃水浴加热5-20min。

与现有技术的骨胶原蛋白肽相比，本发明的胶原蛋白肽具有特别高的纯度，其纯度为95wt％以上，优选98wt％以上，更99wt％以上，最优选99.5wt％以上。

在本发明的又一方面，提供了上述胶原蛋白肽粉的用途，其用于制备可修复人体细胞的制剂。

优选地，修复人体细胞包括促进人成骨细胞增殖和/或促进皮肤损伤组织愈合。

就本发明而言，可修复的细胞是指哺乳动物细胞，特别是指人体细胞，更特别地是指人成骨细胞和皮肤成纤维细胞。

就本发明而言，复合牦牛骨胶原蛋白肽中的“复合”以宽泛的含义理解，牦牛骨胶原蛋白肽包含不同类型(如不同分子量)的蛋白肽，都可以称为复合。

更优选地，本发明的胶原蛋白肽粉由于含有两种分子量分布的胶原蛋白肽，从而兼具有促进人成骨细胞增殖和促进皮肤损伤组织愈合的功能。对于骨创伤而言，通常还伴随有皮肤创伤，因此本发明的复合牦牛骨胶原蛋白肽可以同时改善骨创伤和皮肤创伤，特别具有意义。

附图说明

图1是根据本发明的牦牛骨在脱钙处理后的横截面的显微图；

图2是根据本发明实施例3的7d成骨细胞的荧光显微镜图像，其中细胞用AO荧光染料染色，在该图中A为空白对照组，B对应0.1mg/mL蛋白肽浓度，C对应0.2mg/mL蛋白肽浓度。

具体实施方式

以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此。

实施例1

取牦牛骨(得自西藏藏北牦牛肉制品有限公司)，将牦牛骨进行预处理包括：将新鲜的牦牛骨去除骨膜，剔除残留的残肉、脂肪、筋膜、骨髓和其它非骨骼组织，用0.8wt.％浓度H₂O₂溶液浸泡1h，再用生理盐水冲洗以洗去残留的杂质，然后锯切成约10mm的小块；使用混合有机溶剂对牦牛骨小块进行脱脂，混合有机溶剂为石油醚与氯仿的混合物，二者体积比为1:1，脱脂温度为40℃，脱脂时间为12h，固液比为1:8；然后进行脱钙处理，先用0.5mol/LEDTA溶液对脱脂后的牦牛骨进行处理，在用清水冲洗后，再用0.5mol/L-1.0mol/L的HCl溶液进行处理；将脱钙后的牦牛骨用5倍体积胃蛋白酶1％(w/w)的0.3mol/L乙酸溶液消解，4℃下搅拌24h，12000g离心30min，收集上清液；沉淀再加5倍体积的复合酶消解一次，收集上清液，将两次的上清液合并，即得提取得到胶原蛋白，然后，用1mol/L的NaOH溶液迅速调节溶液的pH值至7.0-7.5，加入2mol/L的氯化钠颗粒搅拌均匀后进行盐析处理，4℃盐析过夜，14000g离心30min，收集沉淀，用0.5mol/L的乙酸溶液溶解后调节pH值至7.0-7.5，分别用Tris-HCl(pH＝7.5)透析1-2天，蒸馏水透析1-2天以纯化提取的胶原蛋白，经透析平衡、浓缩后即得胶原蛋白溶液，最后将其冷冻干燥处理得经纯化的胶原蛋白成品；将冷冻干燥后的胶原蛋白分为两部分即第1部分和第2部分，第1部分与第2部分的重量比为3:1，其中：将第1部分溶于0.5mol/L乙酸溶液中配成2mg/mL的胶原蛋白溶液，在60温度℃下加入BSC酶和胰蛋白酶的复合酶，底物浓度为2mg/mL、1.0％(体积分数)酶总添加量，进行水解，时间为1.5h，将水解后的胶原蛋白进行透析和浓缩，得浓缩液，然后进行冻干，得到水解后的短肽；将第2部分按照与第1部分相同的酶解方式，区别仅在于酶解时间为0.3h，得到轻度水解后的粗肽；将所述水解的短肽和粗肽合并，然后使用SepHadex G-50层析柱，用纯净水作为流动相洗脱，以0.5ml/min的流速在室温条件下对合并后的样品进行分离纯化，检测洗脱成分的分子量，收集具有所需组分的洗脱液(肽分子量分布为700-1000Da范围内和320-400Da范围内)，合并后冷冻干燥，即得本发明的复合牦牛骨胶原蛋白肽。

实施例2

重复实施例1，区别仅在于所述脱钙处理包括：先用EDTA溶液对脱脂后的牦牛骨进行处理后，再用0.02mol/L的前文所述式(I)所示的脱钙剂溶液对牦牛骨进行处理，然后在用清水冲洗后，再用HCl溶液进行处理。

采取重量差值法测试脱钙率，实施例1的脱钙率为51.23％，而实施例2的脱钙率高达79.67％，显示出更好的脱钙效果。

实施例3

采用标准MTT法检测实施例1的胶原蛋白肽粉对人成骨细胞增殖的促进效应，具体如下：将复合牦牛骨胶原蛋白肽配制成0.1mg/mL和0.2mg/mL的浓度，并设空白对照组，将第3次传代的人成骨细胞(得自武警总医院病理实验科)分为3组，空白对照组仅加入含PBS的10％胎牛血清的DMEM培养基，将传代细胞按每孔4000个/100μL分别接种于3个96孔细胞培养板中，按上述分组方案分组，24h细胞贴壁后换液，分别加入上述相应蛋白肽置于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件恒温培养箱内培养，培养结束后，在所需检测的培养孔中分别每孔加入10μL浓度为5mg/m1的MTT溶液，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸取孔内培养上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡10min，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。

MTT检测结果显示，7d后，与空白对照组相比，0.1mg/mL和0.2mg/ml的胶原蛋白肽均能显著促进细胞的增殖活动(P<0.05)，即显示出明显地细胞修复作用。另外，由图2可以看出，实验组的细胞生长较密并且细胞丰满，表明出较好的促进细胞的增殖活动的作用。

实施例4

创伤愈合作用测试：36只SPF级BALB/c 18-22g雄性昆明种小白鼠(得自广东省医学实验动物中心)，适应性喂养2周后随机分为3组，每组12只，共包括1个对照组和2个蛋白肽(实施例1的蛋白肽)剂量组(剂量1：0.80g·kg^-1·bw^-1，和剂量2：1.6g·kg^-1·bw^-1)。小鼠经乙醚麻醉，用剃毛刀将背部鼠毛剃净，用70％乙醇消毒，在脊柱左右两侧相同位置于无菌条件下用直径1cm的皮肤活检打孔器制造一个全层皮肤伤口，让伤口暴露，单笼饲养，将致伤当天记为第0天，每日除了饲喂各组小鼠2g基础饲料，还在上午11:00灌胃相应的药物，灌胃体积为200μL·10g^-1·bw^-1，对照组给予等体积生理盐水灌胃，测试不同天数的伤口愈合率，具体如下表1所示：

表1

伤口愈合率＝(原伤口面积-未愈合伤口面积)/原伤口面积×100％

上述试验结果清楚地显示，本发明的复合牦牛骨胶原蛋白肽可以加速伤口愈合，当施用本发明的蛋白肽时，可以在10d时伤口基本痊愈。在病理学上，其表现为可以促进成纤维细胞增殖、胶原纤维增生、血管生成和表皮形成。

对于骨创伤而言，由于往往还伴随有皮肤创伤，因此本发明的复合牦牛骨胶原蛋白肽可以同时改善骨创伤和皮肤创伤，特别具有临床意义。

本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，且还使本领域技术人员能够制造和使用本发明。本发明的可授予专利的范围由权利要求书限定，且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这种其它实例具有不异于权利要求书的字面语言的结构元素，或者如果这种其它实例包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等效结构元素，则这种其它实例意图处于权利要求书的范围之内。在不会造成不一致的程度下，通过参考将本文中参考的所有引用之处并入本文中。

Claims (4)

1.一种制备复合牦牛骨胶原蛋白肽粉的方法，该方法包括以下步骤：(1)将牦牛骨进行预处理；(2)将牦牛骨进行脱脂处理；(3)将牦牛骨进行脱矿物处理；(4)提取胶原蛋白；(5)纯化胶原蛋白；(6)将胶原蛋白进行酶解；和(7)将胶原蛋白多肽进行纯化；

步骤（1）将牦牛骨进行预处理包括：将新鲜的牦牛骨去除骨膜，剔除残留的残肉、脂肪、筋膜、骨髓和其它非骨骼组织，用0.5-2.0wt%浓度H₂O₂溶液浸泡1-5h，再用生理盐水冲洗以洗去残留的杂质，然后锯切成5mm-15mm的小块；

酶解时，酶为BSC酶和胰蛋白酶的组合，BSC酶和胰蛋白酶的用量比例为1:2-2:1，以酶单位之比计，所述BSC酶通过以下方法制得：(a)将蜡样芽孢杆菌即Bacillus cereusMBL13-U以4mL/100mL的接种量接种于pH 6.4的发酵培养基中，在35℃，160r/min的条件下反应46h，以12000g离心力在4℃下高速离心30min，收集上清液即为BSC的粗酶液；(b)将粗酶液依次通过硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S200HR凝胶层析，最终得到纯的BSC酶；

步骤（6）按如下方法进行：将冷冻干燥后的胶原蛋白分为两部分即第1部分和第2部分，第1部分与第2部分的重量比为3:1-1:1，其中：将第1部分溶于0.5mol/L乙酸溶液中配成2mg/mL的胶原蛋白溶液，在50-60℃下加入复合酶，复合酶为BSC酶和胰蛋白酶的组合， 以1.0%体积分数酶总添加量进行水解，时间为0.5-2.0h，将水解后的胶原蛋白进行透析和浓缩，得浓缩液，然后进行冻干，得到水解后的短肽；将第2部分按照与第1部分相同的酶解方式，区别仅在于酶解时间为前者的1/5，得到轻度水解后的粗肽；

其中该复合牦牛骨胶原蛋白肽粉中的胶原蛋白肽的分子量呈双峰分布，分别分布在700-1000Da范围内和320-400Da范围内。

2.根权利要求1所述的方法，其中将牦牛骨进行脱脂处理包括使用混合有机溶剂对牦牛骨小块进行脱脂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中混合有机溶剂为石油醚与氯仿的混合物，二者体积比为1:3-3:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱矿物处理包括：先用0.5mol/L-1.0mol/L的EDTA溶液对脱脂后的牦牛骨进行处理，在用清水冲洗后，再用0.5mol/L-1.0mol/L的HCl溶液进行处理。

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