CN113350381B - 一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法和处理液 - Google Patents

一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法和处理液 Download PDF

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Abstract

公开了一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法和处理液，由水相、有机相和酶组成，有机相包含异辛烷和长链烷基季铵盐。此外，还公开了提高珍珠水解液蛋白比例的方法，包括：获得纳米珍珠粉；与处理液混合，酶解处理；与KCl水溶液混合静置分层，取下清液。该处理液和方法有利于更多角质蛋白转化为可溶性蛋白，进而提高了珍珠水解液水溶性蛋白比例。

Description

一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法和处理液
技术领域
本发明属于药物制剂领域；涉及一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法和处理液。
背景技术
珍珠粉是珍珠贝科动物（例如马氏珍珠贝和珍珠贝）或者蚌科动物（例如褶纹冠蚌、三角帆蚌）等贝类动物分泌物质包裹体内刺激异物层而形成的含碳酸钙的矿物珠粒。我国药典记载珍珠粉具有安神定惊、明目去翳、解毒生肌等功效，自古就是一味重要的中药。此外，珍珠粉也是医疗、美容、保健领域不可多得的养颜珍品，应用较为广泛。
作为药用成分，珍珠粉不仅含有碳酸钙和锰、铝、铁、锶、铜、钛等微量元素，还含有角质蛋白和多肽类物质。研究表明，角质蛋白是珍珠粉中的主要有机成分，虽然角质蛋白含量不足5%，但却控制着含量高达95%以上碳酸钙晶体的形成、沉积和晶型转变，同时也是珍珠粉产生生物活性和诱导骨骼生长等特性的主要原因。因此，角质蛋白的研究近年来逐渐成为珍珠粉和珍珠水解液的研究热点之一。为了提取珍珠粉中的角质蛋白，需要将角质蛋白从无机碳酸钙中释放出来。主要方法有两种：一种是酸解法；一种是酶解法。
中国专利申请CN88105369A公开了一种将珍珠加工成可溶性珍珠全成分制剂的制备工艺，由珍珠细粉与有机酸进行置换反应，以制得珍珠有机酸盐(I)及珍珠硬蛋白(II)；继而将(II)在酸性条件下，经过酸洗、水解及中和等步骤，转换成多种氨基酸混合液(III)，最后使(I)和(III)混合，经浓缩制得可溶性珍珠全成分制剂。然而，这种工艺导致仅仅能够使大约一半的角质蛋白进入珍珠水解液中。
中国专利CN103393723B公开了一种珍珠粉水解提取液的制备方法，先在98℃保温进行水解，同时采用间歇式超声处理；再经微孔滤膜过滤，得到珍珠粉水解提取液。然而，该方法中水解温度过高，导致角质蛋白变性。
中国专利CN106265412B公开了一种利用益生菌发酵制备珍珠水解液的方法。将珍珠粉碎后加入食用有机酸，搅拌溶解得有机酸珍珠溶解液，加糖分、水后接种益生菌，发酵培养，压滤得到滤液，灭菌，过滤，得珍珠水解液。该方法将有机酸水解、益生菌发酵相结合，能有效地将珍珠成分中的不溶性物质转化成处于游离状态的可溶性物质，水解程度高，珍珠营养成分损失小。然而，该方法中仅能将小部分约8%左右的角质蛋白转化为可溶性蛋白（包括短链多肽和氨基酸等），水解液中水溶性蛋白含量较低。
针对现有技术的上述种种不足，迫切需要寻找一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法和处理液。
发明内容
为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种提高珍珠水解液蛋白比例的处理液，所述处理液由水相、有机相和酶组成，其特征在于，所述有机相包含异辛烷和长链烷基季铵盐。
根据本发明所述的处理液，其中，长链烷基季铵盐包含一个或两个具有10-22个碳原子的烷基。
有利地，长链烷基季铵盐包含一个或两个具有12-20个碳原子的烷基。
在一个具体的实施方式中，长链烷基季铵盐包含一个具有16个碳原子的烷基。
根据本发明所述的处理液，其中，长链烷基季铵盐选自十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵。
根据本发明所述的处理液，其中，水相和有机相的体积比为1：(20-30)。
有利地，水相和有机相的体积比为1：(22-28)。
在一个具体的实施方式中，水相和有机相的体积比为1：25。
根据本发明所述的处理液，其中，所述有机相进一步包含低级醇类溶剂。
有利地，低级醇类溶剂选自具有1-4个碳原子的烷基醇，包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。
在一个具体的实施方式中，低级醇类溶剂选自乙醇。
根据本发明所述的处理液，其中，低级醇类溶剂与异辛烷的体积比为1：(4-8)。
有利地，低级醇类溶剂与异辛烷的体积比为1：(5-7)。
在一个具体的实施方式中，低级醇类溶剂与异辛烷的体积比为1：6。
更有利地，所述有机相由异辛烷、低级醇类溶剂和长链烷基季铵盐组成。
根据本发明所述的处理液，其中，所述水相为含有(0.05-0.20)M KCl的PBS缓冲液。
有利地，所述水相为含有(0.05-0.20)M KCl的PBS缓冲液。
在一个具体的实施方式中，所述水相为含有0.1M KCl的PBS缓冲液。
根据本发明所述的处理液，其中，PBS缓冲液的pH值为7.0-9.0。
有利地，PBS缓冲液的pH值为7.5-8.5。
在一个具体的实施方式中，PBS缓冲液的pH值为8.0。
根据本发明所述的处理液，其中，所述酶选自胰蛋白酶。
根据本发明所述的处理液，其中，胰蛋白酶的酶活为140000-220000U/g。
有利地，胰蛋白酶的酶活为160000-200000U/g。
在一个具体的实施方式中，胰蛋白酶的酶活为180000U/g。
根据本发明所述的处理液，其中，所述酶与（水相+有机相）的重量体积比为(0.50-0.80)mg/mL。
有利地，所述酶与（水相+有机相）的重量体积比为(0.60-0.70)mg/mL。
在一个具体的实施方式中，所述酶与（水相+有机相）的重量体积比为0.64mg/mL。
另一方面，本发明还提供了一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法，所述方法包括：
获得纳米珍珠粉；
纳米珍珠粉与处理液混合并振荡均匀，酶解处理，离心，静置分层，取上清液；
将上清液与等体积的KCl水溶液混合并振荡均匀，离心，静置分层，取下清液。
根据本发明的方法，其中，纳米珍珠粉的平均粒径为20-60nm。
有利地，纳米珍珠粉的平均粒径为30-50nm。
在一个具体的实施方式中，纳米珍珠粉的平均粒径为40nm。
在本发明中，纳米珍珠粉的制备方法是现有技术中已知的。
在一个具体实施方式中，纳米珍珠粉的制备方法按照毛秋华（《中国组织工程研究》，22，3510）所记载的方法进行。
根据本发明的方法，其中，酶解温度为40-50℃；酶解处理时间为2-4h。
根据本发明的方法，其中，纳米珍珠粉与处理液中酶的重量比为 (22-28)：1。
在一个具体的实施方式中，纳米珍珠粉与处理液中酶的重量比为 25：1。
根据本发明的方法，其中，KCl水溶液的浓度为1-2M。
发明人发现，本发明的方法和处理液能够形成微米尺度的细小液池，与更小尺度的纳米珍珠粉进行限域酶解，有利于更多角质蛋白转化为可溶性蛋白，进而提高了珍珠水解液水溶性蛋白比例。
具体实施方式
应理解，本发明的具体实施方式仅用于阐释本发明的精神和原则，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明的技术方案作出各种改动、替换、删减、修正或调整，这些等价技术方案同样落于本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1
将125mL异辛烷和25mL无水乙醇混合均匀，向其中加入12g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），超声使其充分溶解，得到150mL有机相。配制含有0.1M KCl的pH=8.0的PBS缓冲液作为水相。然后将6mL水相和150mL有机相混合在一起，再加入100mg胰蛋白酶（酶活180000U/g（采用福林法测定）；购自阿拉丁试剂（上海）有限公司），超声使其混合均匀，得到珍珠粉处理液。
将微米珍珠粉与无水乙醇以1g/15 mL的比例在砂磨机中研磨2h，干燥，得到平均粒径为40nm的纳米珍珠粉。研磨工艺参数为：主机转速1800rpm，进料压力0.35kPa；氧化锆球直径0.1mm。
将2.5g纳米珍珠粉与上述珍珠粉处理液混合并振荡均匀，在45℃的水浴中酶解处理3h，8000rpm离心10min，静置分层，取上清液。
将上清液与等体积的1.5M KCl水溶液混合并振荡均匀，8000rpm离心10min，静置分层，取下清液，即珍珠水解液。
比较例1
在珍珠粉处理液制备时，将25mL无水乙醇替换为25mL异辛烷，即有机相全部由异辛烷组成；其余条件同实施例1。
比较例2
将琥珀酸二异辛酯磺酸钠替换为相同重量的琥珀酸二异辛酯磺酸钠，其余条件同实施例1。
珍珠水解液蛋白比例测试
采用全自动凯氏定氮仪测定珍珠水解液和微米珍珠粉原料中各自的总氮含量。按照珍珠水解液中总氮含量除以微米珍珠粉原料中总氮含量乘以100%作为珍珠水解液蛋白比例，计算实施例1和比较例1-2的珍珠水解液蛋白比例。
结果参见表1。
表1：
珍珠水解液蛋白比例
实施例1 76.5
比较例1 53.9
比较例2 48.2
从表1可以看出，使用本发明实施例1的方法和处理液有效提高了珍珠水解液水溶性蛋白比例。
不希望局限于任何理论，本发明的处理液和方法能够形成微米尺度的细小液池，与更小尺度的纳米珍珠粉进行限域酶解，有利于更多角质蛋白转化为可溶性蛋白，进而提高了珍珠水解液水溶性蛋白比例。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种提高珍珠水解液蛋白比例的处理液，所述处理液由水相、有机相和酶组成，其特征在于，所述有机相包含异辛烷和长链烷基季铵盐；
所述长链烷基季铵盐选自十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵；
水相和有机相的体积比为1：20~30；所述有机相进一步包含低级醇类溶剂；低级醇类溶剂与异辛烷的体积比为1：4~8；
所述水相为含有0.05~0.20M KCl的PBS缓冲液；PBS缓冲液的pH值为7.0~9.0；
所述酶选自胰蛋白酶；胰蛋白酶的酶活为140000~220000U/g；所述酶与水相+有机相的重量体积比为0.50~0.80mg/mL。
2.一种提高珍珠水解液蛋白比例的方法，所述方法包括：
获得纳米珍珠粉；
纳米珍珠粉与权利要求1所述的处理液混合并振荡均匀，酶解处理，离心，静置分层，取上清液；
将上清液与等体积的KCl水溶液混合并振荡均匀，离心，静置分层，取下清液。
3.根据权利要求2的方法，其中，纳米珍珠粉的平均粒径为20~60nm。
4.根据权利要求2的方法，其中，酶解温度为40~50℃；酶解处理时间为2~4h。
5.根据权利要求2的方法，其中，纳米珍珠粉与处理液中酶的重量比为22~28：1。
6.根据权利要求2的方法，其中，KCl水溶液的浓度为1~2M。
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