CN101695645B - 逆胶束及其制备方法和其在纤维素酶解中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种逆胶束，该逆胶束是生物表面活性剂在非极性有机溶剂中超过临界胶团浓度时自组装形成的纳米尺寸的聚集体，具体来说该逆胶束是在室温下，将生物表面活性剂溶于助表面活性剂液体中，混合均匀后将所得溶液注入到非极性有机溶剂中得混合液，控制生物表面活性剂在混合液中的浓度为临界胶束浓度的1～1800倍，混合均匀后得到逆胶束。该逆胶束环境友好、污染少、成本低，能够很好地应用于纤维素的酶解。
Description
技术领域
本发明涉及一种有机物聚集体及其制备方法和应用，尤其涉及一种表面活性剂在溶剂中自组装形成的聚集体及其制备方法和应用。
背景技术
20世纪70年代Misiorowski和Wells等人率先提出在逆胶束体系中，大多数酶能够保持较高的活性和稳定性，甚至表现出“超活性(Superactivity)”。这为逆胶束在酶催化反应等领域的应用奠定了重要的理论基础。近年来，逆胶束的理论和应用研究发展迅速，逆胶束体系的多种构建方法及其用于强化酶催化反应过程的优势和作用机理倍受关注。
逆胶束是表面活性剂在非极性有机溶剂中超过临界胶团浓度(CMC)时自组装形成的纳米尺寸的聚集体，具有良好的热力学稳定性。逆胶束体系中，表面活性剂疏水的非极性尾部指向有机溶剂，亲水的极性头部指向聚集体内部形成一个纳米级大小的极性腔(polar core)。此极性腔可容纳一定量的水，其内部接近细胞内环境，酶等生物物质溶解在其中，由于胶团的屏蔽作用，这些生物物质不与有机溶液直接接触，因而逆胶束体系可以有效保持生物物质的活性，从而提高该体系中酶催化反应的效率。
纤维素的有效降解是环境中大量废弃纤维素类生物质资源化利用的重要前提，逆胶束体系中酶活性的有效保持和高效酶催化反应的实现为纤维素的酶法降解开辟了新的技术途径。现有技术中，Chen等人报道了一种用于降解纤维素的逆胶束方法(Chen N，Fan JB，XiangJ，Chen J，Liang Y，2006.Enzymatic hydrolysis of microcrystalline cellulose inreverse micelles.Biochimica et Biophysica Acta 1764：1029-1035)，该方法是以微晶纤维素作为底物，分别采用非离子表面活性剂(Triton X-100)、阴离子表面活性剂(AOT)和阳离子表面活性剂(CTAB)构建三种不同的逆胶束体系，并考察了这三种不同属性的逆胶束体系中纤维素的酶解特性，其结果表明在相同的温度和pH值条件下，纤维素在逆胶束体系中的降解效率显著高于其在水相体系中的降解效率。这为逆胶束在纤维素降解领域中的应用提供了实践依据。
然而，目前用于构建逆胶束体系的表面活性剂仍局限于化学表面活性剂。常用的有琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯化三辛基甲铵(TCMAC)、磷脂酰乙醇胺(PTEA)以及磷脂酸(PTA)等，其中AOT最为常用。表面活性剂对于逆胶束体系的形成及其性能起着关键性作用。表面活性剂的结构，尤其是其疏水部位对于溶入逆胶束中的酶蛋白有着重要影响。常用的化学合成表面活性剂在酶催化反应过程中与酶蛋白表面易产生强烈的静电相互作用，使酶蛋白易变性失活，从而降低酶催化作用的有效性。因此，寻找更好的逆胶束体系是逆胶束用于强化酶催化反应技术的发展方向之一，而开发适用于逆胶束体系的且具有良好环境兼容性的表面活性剂则成为逆胶束应用研究的一个重要内容。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种环境友好、污染少、成本低、纤维素酶解效果好的逆胶束，还提供一种环保安全、操作简便、成本低的该逆胶束的制备方法以及该逆胶束在酶解纤维素中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种逆胶束，其特征在于：所述逆胶束是生物表面活性剂在非极性有机溶剂中超过临界胶团浓度时自组装形成的纳米尺寸的聚集体。所述生物表面活性剂优选包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，可购于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC AB93066)所产生的鼠李糖脂(Rhamnolipid，简称RL)。由铜绿假单胞菌制备鼠李糖脂的方法为公知的培养方法，其他工艺条件下或其他途径制备得到的鼠李糖脂也可用于本发明，但由铜绿假单胞菌所制得的鼠李糖脂效果更好，且污染更少。所述非极性有机溶剂优选包括异辛烷、环己烷或正庚烷。
本发明还提供一种上述的逆胶束的制备方法，包括以下步骤：在室温下，将生物表面活性剂溶于助表面活性剂液体中，混合均匀后将所得溶液注入到非极性有机溶剂中得混合液，控制所述生物表面活性剂在所述混合液中的浓度为临界胶束浓度的1～1800倍，混合均匀后得到逆胶束。
上述的制备方法中，所述助表面活性剂优选包括正己醇或正丁醇，所述助表面活性剂在所述混合液中的浓度为3mol/L～8mol/L。
与上述的逆胶束和逆胶束的制备方法构成一个总的发明构思，本发明还提供一种上述逆胶束在纤维素酶解中的应用。
上述应用具体优选包括以下步骤：
(1)对所述逆胶束先进行电导率特征分析，根据电导率峰值时对应的逆胶束溶液含水率值(即逆胶束溶液中水与表面活性剂的摩尔比值，逆胶束溶液是指包含表面活性剂、助表面活性剂、非极性有机溶剂的逆胶束体系)确定出所述逆胶束溶液的最大增溶水量条件；
(2)在所述逆胶束溶液的最大增溶水量条件下，加入纤维素酶，混合均匀后再加入纤维素作为酶解反应底物，控制该逆胶束溶液在常规酶解反应条件下使所述纤维素充分酶解。
上述的应用过程中，所述纤维素酶的酶负荷优选控制在0.15FPU/g底物～5FPU/g底物。
上述的应用过程中，所述酶解反应底物优选包括羧甲基纤维素或微晶纤维素。
上述的应用过程中，所述酶解反应底物在逆胶束溶液中的浓度优选控制在1mg/mL～10mg/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：首先，本发明的逆胶束是选用生物表面活性剂(Biosurfactant，简称BS)制备得到，而生物表面活性剂作为一种环境友好型的天然表面活性剂，产生于微生物、动物或植物的代谢过程中，具有低毒性、可降解性、生态相容性和高效性等优势，生物表面活性剂取代化学表面活性剂的应用可有效避免环境中化学试剂大量使用所造成的污染累积，使得工艺流程更具安全性和环境可持续性。而本发明方法制备的逆胶束在纤维素酶解中的应用也是本发明的重要创新，通过本发明逆胶束的应用能使得逆胶束中酶催化作用得到更高效地发挥。通过对逆胶束的电导率特征分析，在逆胶束溶液最大增溶水量条件下将其用于纤维素酶解反应，能大大提高逆胶束体系中纤维素酶解的效率。此外，本发明逆胶束的制备方法简易，所制得的逆胶束体系增溶水量较高、稳定性好，将其用于纤维素的酶解可获得较高的酶解效率，且操作过程安全、成本较低，对于促进环境中大量废弃纤维素的资源化利用具有重要意义，同时开辟了生物表面活性剂在逆胶束体系中降解纤维素的应用新途径。
附图说明
图1为实施例1制得的逆胶束的电导率随含水量的变化特征曲线；
图2为实施例2中相同条件下的鼠李糖脂、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)和吐温80(Tween 80)逆胶束溶液中纤维素酶解还原糖产率的比较图；
图3为实施例3中相同条件下的鼠李糖脂、CTAB、SDS和Tween 80逆胶束溶液中纤维素酶解还原糖产率的比较图。
具体实施方式
实施例1：
一种本发明的逆胶束，其是鼠李糖脂(铜绿假单胞菌产生)在非极性有机溶剂异辛烷中超过临界胶团浓度时自组装形成的纳米尺寸的聚集体。
上述逆胶束的制备方法包括以下步骤：在室温下，将2g生物表面活性剂鼠李糖脂溶于10mL助表面活性剂正己醇液体中，混合均匀后将所得的含表面活性剂的溶液注入到10mL非极性有机相异辛烷中，混合均匀后得到逆胶束(含溶剂)。
实施例2：
向实施例1制得的逆胶束中分别加入不同体积的水(水的添加量分别设为0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、1.0mL、1.4mL、1.5mL、1.6mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL)配制成一系列含水率不同的逆胶束混合液，再将各逆胶束混合液进行超声波震荡90min使其中的表面活性剂鼠李糖脂完全溶解，各相混合均匀呈现出均一透明溶液后，即得到一系列含水率不同的逆胶束溶液。
对以上这一系列的逆胶束分别进行电导率特征分析，分析结果如图1所示，由图1可知，当向实施例1制得的逆胶束中加入2.5mL的水量时，逆胶束的电导率随含水量的变化曲线出现最高峰值，根据胶束渗滤理论，该条件下的逆胶束溶液具有最大增溶水量，此时计算出的逆胶束溶液的含水率(即水与鼠李糖脂的摩尔比)为40.3。
再另取0.0014g的鼠李糖脂溶于10mL助表面活性剂正己醇液体中，混合均匀后将所得的含表面活性剂的溶液注入10mL非极性有机相异辛烷中，将此混合液于超声波震荡30min使其中的表面活性剂完全溶解，各相均一透明后得到逆胶束(含溶剂)。向该逆胶束溶液中注入1.75μL含纤维素酶的水溶液，控制逆胶束在最佳含水率40.3的条件下，再加入60mg羧甲基纤维素作为酶解反应底物，该酶解反应底物在逆胶束溶液中的浓度为3mg/mL，鼠李糖脂相对于异辛烷和正己醇混合液的浓度为1倍CMC值(0.07g/L)，纤维素酶的酶负荷为0.15FPU/g底物。
将上述逆胶束溶液置于35℃温度的恒温摇床中，在150r/min震荡条件下连续反应12h。反应结束后，取上述反应液于5000rpm的转速下离心5min，分离剩余固体底物，然后采用等体积的氯仿对液相产物进行萃取，剧烈震荡后以8000rpm的转速高速离心5min，使溶液分层，取上层清液即为纤维素酶解产物还原糖溶液。
用蒽铜-硫酸法测定产物还原糖的浓度，得到体系中还原糖产率。
同理，在相同逆胶束最佳增溶水量条件(10mL异辛烷，10mL正己醇，1倍CMC浓度的表面活性剂的最佳含水率)下，分别以阳离子表面活性剂CTAB、阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂吐温80作为对比，采用相同的酶解反应条件(底物浓度为3mg/mL，纤维素酶的酶负荷为0.15FPU/g底物，反应温度为35℃)，几种不同类型表面活性剂所构建的逆胶束体系中纤维素酶解的效率如图2所示。由图2可知，在生物表面活性剂鼠李糖脂逆胶束溶液中进行的纤维素酶解效率显著高于其余三种化学表面活性剂逆胶束溶液中的纤维素酶解反应效率，具体的试验数据见下表1。
表1：实施例1中不同表面活性剂逆胶束酶解体系的还原糖产率
| 逆胶束反应体系 | 鼠李糖脂 | CTAB | SDS | Tween80 |
| 还原糖产率(mg/g底物) | 198.03 | 178.57 | 151.06 | 136.29 |
其中，CTAB、SDS和Tween 80的最大增溶水量条件分别为含水率：15.2、20.1和2.3，CMC浓度分别为：3.4g/L、2.1g/L和80.0g/L。
实施例3：
根据实施例2中确定的最佳含水率数据(40.3)，另取0.0028g的鼠李糖脂溶于10mL助表面活性剂正己醇液体中，混合均匀后将所得的含表面活性剂的溶液注入10mL非极性有机相异辛烷中，将此混合液于超声波震荡30min使其中的表面活性剂完全溶解，各相均一透明后得到逆胶束(含溶剂)。向逆胶束溶液中注入3.5μL含纤维素酶的水溶液，控制逆胶束在最佳含水率40.3的条件下，再加入60mg羧甲基纤维素作为酶解反应底物，该酶解反应底物在逆胶束溶液中的浓度为3mg/mL，鼠李糖脂相对于异辛烷和正己醇混合液的浓度为2倍CMC值(0.14g/L)，纤维素酶的酶负荷为0.15FPU/g底物。
将上述混合液至于35℃温度的恒温摇床中，在150r/min震荡条件下连续反应12h。反应结束后，取上述反应液于5000rpm的转速下离心5min，分离剩余固体底物，然后采用等体积的氯仿对液相产物进行萃取，剧烈震荡后以8000rpm的转速高速离心5min，使溶液分层，取上层清液即为纤维素酶解产物还原糖溶液。
用蒽铜-硫酸法测定产物还原糖的浓度，得到体系中还原糖产率。
同理，在相同逆胶束最佳增溶水量条件(10mL异辛烷，10mL正己醇，2倍CMC浓度的表面活性剂的最佳含水率)下，分别以阳离子表面活性剂CTAB、阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂吐温80作为对比，采用相同的酶解反应条件(底物浓度为3mg/mL，纤维素酶的酶负荷为0.15FPU/g底物，反应温度为35℃)，几种不同类型表面活性剂所构建的逆胶束体系中纤维素酶解的效率如图3所示。由图3可知，在生物表面活性剂鼠李糖脂逆胶束体系中进行的纤维素酶解效率显著高于其余三种化学表面活性剂逆胶束中的纤维素酶解反应效率，具体的试验数据见下表2。
表2：实施例2中不同表面活性剂逆胶束酶解体系的还原糖产率
| 逆胶束反应体系 | 鼠李糖脂 | CTAB | SDS | Tween80 |
| 还原糖产率(mg/g底物) | 169.71 | 145.82 | 129.05 | 118.85 |
其中，CTAB、SDS和Tween 80的最大增溶水量条件分别为含水率：15.2、20.1和2.3，CMC浓度分别为：3.4g/L、2.1g/L和80.0g/L。
Claims (4)
1.一种逆胶束在纤维素酶解中的应用，所述逆胶束是生物表面活性剂在非极性有机溶剂中超过临界胶团浓度时自组装形成的纳米尺寸的聚集体；所述生物表面活性剂是指铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CCTCC AB93066所产生的鼠李糖脂；所述非极性有机溶剂是指异辛烷；所述逆胶束的制备方法包括以下步骤：在室温下，将所述生物表面活性剂溶于助表面活性剂液体中，混合均匀后将所得溶液注入到非极性有机溶剂中得混合液，控制所述生物表面活性剂在所述混合液中的浓度为临界胶束浓度的1～1800倍，混合均匀后得到逆胶束；所述应用具体包括以下步骤：
（1）对所述逆胶束先进行电导率特征分析，根据电导率峰值时对应的逆胶束溶液含水率值确定出所述逆胶束溶液的最大增溶水量条件；
（2）在所述逆胶束溶液的最大增溶水量条件下，加入纤维素酶，混合均匀后再加入纤维素作为酶解反应底物，控制该逆胶束溶液在常规酶解反应条件下使所述纤维素充分酶解。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述纤维素酶的酶负荷控制在0.15FPU/g底物～5FPU/g底物。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述酶解反应底物包括羧甲基纤维素或微晶纤维素。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述酶解反应底物在逆胶束溶液中的浓度控制在1mg/mL～10mg/mL。
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