CN103459603B - 通过一体化酶生产进行的高效木质纤维素水解 - Google Patents

通过一体化酶生产进行的高效木质纤维素水解 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于降解木质纤维素生物质的方法，所述木质纤维素生物质任选地已进行了预处理。其基于在机械或化学处理的能够产生各自水解酶的微生物存在的情况下生物质的水解功效得到增强的发现。本发明从而提供了利用一体化生产的酶混合物降解木质纤维素生物质的方法。本发明还提供了其中任选地将经预处理的木质纤维素生物质的部分掺入真菌的终生长培养基的方法。

Description

通过一体化酶生产进行的高效木质纤维素水解
发明领域
本发明提供了用于从木质纤维素原料生物技术产生单体化合物例如糖和/或乙醇的方法。
发明背景
由于有限的矿物油资源以及对要求减少CO2排放的原因，化学工业寻求更加可持续的生产途径来制造大宗化学产品例如液体燃料和基础化学品(base chemicals)。该策略的一部分关注在木质纤维素生物质至通用化学品或燃料例如乙醇的转化。木质纤维素生物质包含纤维素(～25-40％w/w d.s.)、半纤维素(～15-25％w/w d.s.)和木质素(～15-30％w/w d.s.)(作为主要组分)和少量其它碳水化合物、蜡、蛋白质和无机化合物。可如Sluiter等人，2008所述测定任何原料的具体组成。在植物生物质的形式当中，由于它们可用性、低成本和环境友好的生产，来源于任何林业和农业废物流例如木材残渣和谷草的木质纤维素生物质特别适合用于至大宗化学产品和燃料的转化。此外，利用木质纤维素原料的生产过程的生命周期分析显示相较于基于其它原料的方法减少的温室气体排放。
描述木质纤维素生物质至乙醇和其它基础化学品的转化的各种方法选择已进行了描述(Pejo等人，2008)。为了在工业规模上实现这些方法，特别期望将可再生原料中包含的最大量的能量、碳和物质成分(mass content)转移至终产物。目前已描述的转化方法都未最大限度地实现该期望。
木质纤维素材料(例如稻草)至附加值产品(例如乙醇)的生物技术转化的典型单元操作(unit operations)是：机械退浆(mechanical de-sizing)、物理-化学预处理、酶促水解、发酵和产物回收。
实现工业规模纤维素乙醇生产的关键障碍是对高固相浓度(solidsconcentrations)的预处理的木质纤维素的成本效益的酶促水解。
纤维素级分的水解已被鉴定为木质纤维素至乙醇的转化的主要障碍之一。目前高效生物质水解所需的酶成本和性能是主要瓶颈。
木材或农业木质纤维素材料至糖以及进一步至乙醇的转化是包括多个步骤的复杂过程，其包括机械生物质退浆、水热预处理、酶促或化学生物质水解、生物质水解物的微生物发酵和通过蒸馏或等同技术进行下游的乙醇回收的连续组合。
[机械生物质退浆]
典型退浆步骤包括原料的机械处理例如切割、碾磨或研磨，这通常需要消耗大量能量并且造成显著的操作成本。将原料切割或碾磨成尺寸0.5mm至2cm的颗粒，这使得能够在水相中产生均匀的悬浮物。将原料颗粒悬浮成可被转移至下游单元操作的可泵浆料需要大量的水，这进一步增加了方法的操作成本(Tolan，2002)。
[预处理]
木质纤维素材料至产物例如乙醇的转化通常包括物理-化学预处理步骤。预处理目标在于从纤维素除去和分离半纤维素、破坏和除去木质素鞘、降低纤维素的结晶度、增加纤维素的可触及的表面面积、和/或增加纤维素的孔径，以促进水解试剂的透入(Tolan，2002；Wyman等人，2005)。所述预处理步骤优选动员所述生物质的戊糖级分，同时其增强含固体纤维素级分的消化性(Wyman等人，2005)。
通常使用含水浆料进行预处理步骤。优选这样的浆料具有高固体含量，包含约20至40％(w/w)的原料干物质。所述预处理法通常包括在酸(即H2SO4、HCl、H3PO4)或碱(即NH4OH、NaOH、KOH、石灰)催化剂不存在或存在的情况下生物质的加压水热处理(pressurised hydrothermal treatment)(～100-250℃)，在原料浓度为0.1至15％w/w时添加所述催化剂(Kumar等人，2009a；Kumar等人，2009b；Kumar等人，2009c，Wyman等人，2005)。反应时间从10s变化至2h，以提供生物质组分的高效转化，为生物质水解和发酵作准备。
替代性预处理策略包括与有机溶剂或离子液体的利用组合的温和水热处理以减少生物质的不顺从性和增溶生物质的木质素和纤维素组分。这后一类预处理选择通常具有更高的成本和有限的效率。
Chandra等人(2007)描述了在稀酸不存在或存在的情况下的水热预处理是减小生物质对水解的不顺从性的优选方法，因为其动员半纤维素和部分解聚木质素而无需增溶作用。此外，其导致具有巨大表面积的无定形纤维素，这对于酶促水解是理想的。
取决于催化剂性质和应用的温度特征，预处理还可导致可溶性抑制剂的形成，包括醋酸、糖(例如糠醛、HMF)和木质素降解物，这可降低下游水解和发酵过程的效力(Margeot等人，2009)。为了增加水解和发酵效力，需要弃去预处理上清液或可将其脱毒(Tolan，2002)。
[预处理生物质的水解]
经预处理的生物质浆液至可发酵单体糖的分解可通过酸或酶催化的水解来实现。酶促水解比可比较的化学(例如基于酸的)方法更具选择性并且耗能更少，从而在发酵过程中提供更有利的过程经济学(process economics)和潜在地更高的乙醇产率。
酶系统是超过一种酶促活性的混合物。适当的酶系统在该意义上是将多聚体糖例如纤维素和半纤维素转化成己糖(即葡萄糖)和戊糖(即木糖)单糖的酶系统，其典型地包含纤维素酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶活性。通常在真菌例如木霉属种(Trichoderma sp.)和/或曲霉菌属种(Aspergillus sp.)的深层液体培养中产生包含纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的酶系统。通常将真菌生物质的残渣与发酵液分离并弃去。随后针对待运送的所得的酶产品，浓缩、稳定和调配所述发酵液。
酶促生物质水解通常在其中总的酶配量包含1-5％w/w(10-20FPU/g纤维素)原料的条件下进行。取决于配量方案和所用的酶系统的具体活性组成，将生物质在40-55℃水解1-7天。生物质中包含的高达约80-90％w/w的多聚体糖被转化成它们各自的单体。
根据Kristensen等人(2009)，通常在10-20％w/w的更低的固体含量下进行生物质的酶促水解。高于15％w/w的固体含量通常导致单体糖产率的显著丢失。该效应归因于导致不均匀酶分布的与高固体含量浆料的均匀混合相关的问题。此外，终产物(如在酶促水解过程中释放的纤维二糖和葡萄糖)的积累可导致纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的内在抑制(Xiao等人，2004a)。
Cardona&Sanchez(2007)描述了预处理上清液和/或先前的生物质水解物作为用于真菌酶产生的生长和酶诱导底物的用途。Howard等人(2003)描述了直接使用源自真菌发酵的废液发酵液(spent liquid fermentation broth)用于水解。Rao等人(1985)指出整个真菌发酵浆液用于高效水解纤维素底物的应用。人工培养基用于水解酶产生，其不允许用于特定原料和/或预处理选择的水解酶系统的定制。由Rao等人(1985)公开的方法的另一个缺点是其限于分泌型酶促活性，因为没有采取任何措施来促进非分泌的或细胞表面结合的酶释放。
当木霉属来源的酶系统被用于生物质水解，细胞外β-葡糖苷酶活性通常因它们相当低的特异性活性和该过程中释放的葡萄糖对终产物的显著抑制而成为限速的和限制产率的(Xiao等人，2004a)，Shewale，1982)。因此，纤维素酶制剂或混合物通常被补充以可备选的β-葡糖苷酶(BGL)活性当它们例如通过黑曲霉菌产生(Seidle等人，2004)。BGL制剂的标准配量方案推荐添加0.01至2个纤维二糖酶单位(CBU)/g纤维素以增强水解动力学和单体糖产率(Chauve等人，2010)。
解决在更高的固体浓度上的生物质水解的技术问题的可备选策略包括同时进行酶促水解和发酵(SSF)的方法。
[乙醇发酵]
工业乙醇生产典型地通过酿酒酵母(S.cerevisiae)来进行。最近已工程化新型微生物菌株(酵母或细菌)也来高效地利用来源于木质纤维素原材料的非葡萄糖的糖。戊糖和所有己糖的利用提高了乙醇生产的经济性。
[产物回收]
通常通过已知的蒸馏和/或提纯方法从发酵培养基回收乙醇。
待解决的问题
用于降解生物质的常规技术或是低效的或是依赖于适于降解特定生物质的单独生产的酶或酶混合物的费时且昂贵的添加。因此，本发明的目标是提供改进的用于在避免这些缺点的情况下降解生物质例如木质纤维素生物质的方法。
发明概述
本发明提供用于降解经预处理的木质纤维素生物质的方法，所述方法包括步骤：
c)在生长培养基中培养能够产生至少一种具有分解纤维素和/或分解半纤维素活性的酶的微生物，从而获得包含至少一种酶的富含微生物的悬浮物；
d)处理步骤c的微生物和/或富含微生物的悬浮物；
e)使经预处理的木质纤维素生物质与步骤d)的产物一起添加至反应器以进行生物质水解来获得可溶性糖。
任选地，通过物理-化学处理从木质纤维素生物质获得经预处理的木质纤维素生物质。步骤c)的生长培养基可能包含木质纤维素生物质，其优选地是经预处理的。在上述具体的实施方案中，其中培养微生物的终生长培养基包含经预处理的浆料的部分，从而用于降解木质纤维素生物质的方法包括步骤：
a)物理-化学预处理木质纤维素生物质以获得经预处理的浆料；
b)将步骤a)的经预处理的浆料分成两部分，部分A和部分B；
c)将部分A掺入原始生长培养基以产生终生长培养基，在终生长培养基中培养至少一种能够产生至少一种具有分解纤维素和/或分解半纤维素活性的酶的微生物，从而获得包含所述至少一种酶的富含微生物的悬浮物；
d)处理步骤c的微生物和/或富含微生物的悬浮物；
e)将部分B和步骤d)的产物一起添加至反应器以进行生物质水解来获得可溶性糖。
在步骤c)中真菌是优选的微生物。步骤d)的处理可物理或机械或化学地或通过它们的组合地发生。可任选地将获自步骤e)的可溶性糖经历下游转化过程，例如乙醇产生。为此目的，可进行固/液分离，例如以获得包含可溶性糖的富含糖的液相。
本发明提供了用于水解木质纤维素生物质的改进的方法。本发明描述了用于从木质纤维素生物质残渣(其实例示于图1中)水解和发酵以产生乙醇的方法，该方法整合了一体化酶生产的高效利用。
根据本发明，将水解酶的产生整合入方法，优选紧连着水解过程。随后将包含可溶性酶系统和真菌生物质的整个发酵浆料用于将木质纤维素原料水解成组分糖。使用一部分经预处理的原料作为发酵培养基进行的所述酶系统的一体化生产提供了原料和预处理选项的最佳灵活性。
在本发明的至关重要的方面，令人惊讶地发现在酶水解之前物理地或机械地或化学地处理微生物生物质，特别地机械剪切真菌生物质将导致，相较于使用发酵上清液或培养液而不处理微生物生物质或通过仅使用发酵液的澄清上清液中包含的可溶性水解酶组分，更快的水解动力学和更优的单体糖(例如葡萄糖)产率。
本发明的详细描述
本发明包括用于生物质例如木质纤维素生物质的降解的改进的方法。经历根据本发明的方法的生物质可以是如下描述的任何生物质。本文中包括的是包含大的颗粒或大块的生物质例如木材残渣、玉米秸杆、甘蔗渣、谷草，从而可任选地在进行本发明的实际方法之前进行机械退浆。
可替代的是，大部分生物质颗粒，例如90％或更多的颗粒，小至足以在悬浮物(浆料)中处理，即它们具有不大于2cm，优选不大于0.5cm，更优选不大于2mm的直径，这样就不需要机械退浆了。然而，在进行机械退浆的情况下，如下进行退浆：
[机械退浆]
根据本发明的优选实施方案，将任何木质纤维素生物质经历利用装置例如锤或球磨机或研磨机或任何类型的此类适合用于将生物质残渣切成碎片(其中按质量计90％或更多的颗粒具有不超过2mm的直径，从而导致小颗粒尺寸的生物质)的装置或它们的组合的粗退浆。
[预处理]
预处理的目的是(小颗粒)生物质的聚合结构的去稳定化和/或部分水解。待经历预处理的生物质通常是干燥的，即没悬浮于液相中。随后使用本领域已知的任何转输系统(例如传送带或螺旋式传输机)将该生物质转移至反应容器中。将小颗粒生物质转移至耐压容器并随后经历预处理。
预处理步骤的产物同义地称为“浆料”或“经预处理的生物质”或“经预处理的木质纤维素生物质”或“经预处理的生物质浆料”。
预处理可以是化学预处理，即利用酸或碱的处理。优选，可在酸催化剂存在的情况下进行预处理，在非限定性实例中所述酸催化剂可选自H2SO4、H2NO3、HCl、H3PO4、SO2。在特别优选实施方案中，酸组成是H2SO4。可以0-10％w/w d.s.的原料的浓度使用酸催化剂。在本发明的更优选实施方案中，将酸浓度调整至0.1-3％w/w d.s.的原料。
预处理可备选地是热处理，例如暴露于超过80℃的温度。然而，最优选组合化学与热处理。在本发明的更优选实施方案中，可在大气压下或高于大气压下进行水热预处理。在酸催化剂存在下的预处理还可包括利用热压力蒸汽(hot pressurized steam)产生120-250℃的温度。在这些条件下，可在进一步处理生物质和进行任选的中和步骤之前预处理生物质0.1-60分钟，这可包括石灰或任何其它碱的应用以便反应介质具有3.5-6的pH。
在本发明的另一个方面，可同时进行退浆和预处理：其中，优选将干燥生物质转移至预处理容器并同时与水接触。可将水热预处理与生物质退浆步骤机械地偶联，以便可以以分批或连续操作模式进行预处理。作为连续预处理模式的非限定性实例，可在装配有螺旋式传输机机械装置的密闭耐压容器中进行预处理。
在本发明的另一个优选实施方案中，以蒸汽闪爆(steam explosion)模式进行水热预处理，其中将生物质经历高于大气压的热蒸汽注射。蒸汽诱导的压力优选为1-30个大气压(120-250℃)，将所述生物质暴露于所述压力0.1-60分钟。此后，突然从反应容器释放压力，从而将预处理的生物质转移至第二收集容器。用于进行蒸汽闪爆预处理的反应容器的非限定性实例可以是由蒸汽套管反应器(由两个球阀封闭的哈氏合金管(Hastelloypipe)组成)组成的蒸汽枪反应器(steam gun reactor)(Autoclave Engineers，Erie，Pa)。将相关的电加热器置于反应器的所有暴露的无套管表面上，并且控制至预处理设置点温度。直接蒸汽注射还用于将生物质快速升至预处理温度。调整和控制蒸汽压以维持期望的预处理温度。所有预处理材料通过反应器底部的可置换模具离开并且被收集在于厚壁、加套和冷的自蒸发罐内支撑的尼龙袋中。
优选，以这样的方式选择处理时间和温度，以便以最高效和经济的方式将最大量的生物质组成水解成它们的组分单体，而不产生显著量的降解物例如糠醛。
常见地，经预处理的原料的木质素级分将在10-70％w木质素/w d.s.的经预处理的原料的范围内。经预处理的原料的木质素含量可按照本领域技术人员已知的方法测量，例如但不限于：http://www.nrel.gov/biomass/analytical-procedures.html上公开的那些方法。
在所述预处理选项后，所得的生物质浆料的干燥固体含量为约10-50％w/w d.s.的原料。选择的预处理策略的主要目的是选择最节能和最具成本效益的方法，所述方法将以使大部分戊糖级分溶解并且使纤维素纤维对于下游水解过程中使用的酶系统是可及的方式制备木质纤维素生物质。将生物质转移至特定的单位操作将通过抽泵或仅通过重力流动来实现。
[本发明的核心方法]
本发明提供了用于降解预处理的木质纤维素生物质的方法，其包括步骤：
c)在生长培养基中培养能够产生至少一种具有分解纤维素和/或分解半纤维素活性的酶的微生物，从而获得包含至少一种酶的富含微生物的悬浮物；
d)处理步骤c的微生物和/或富含微生物的悬浮物；
e)使经预处理的木质纤维素生物质与步骤d)的产物一起添加至反应器以进行生物质水解来获得可溶性糖。
优选地，在该方法中通过物理-化学处理例如上述预处理从木质纤维素生物质已获得经预处理的木质纤维素生物质。
在本发明的特别优选实施方案中，步骤c)的生长培养基包含木质纤维素生物质，所述生物质优选已进行了预处理。各种酶促活性例如但不限于分解纤维素和分解半纤维素活性一起形成了酶系统，即酶系统是超过一种酶促活性的混合物。在一些情况下，这些活性的一种以上可被包含在相同多肽分子内，然而，更常见地，酶系统包含数种例如超过2种，即超过3种不同酶促多肽的混合物，其中每一种多肽具有至少一种期望的活性，以便组合活性形成酶系统。
由本发明描述的方法和系统区别于现有技术的教导。本发明提供了一体化酶生产，其中随后将步骤d)中获得的经预处理的生物质和微生物悬浮物用于生物质水解。令人惊讶地显示，预处理上清液的存在不影响下游酶促水解或发酵过程。此外，令人惊讶地显示，包含来自酶生产的菌丝体和上清液的整个发酵浆料的使用相较于从所述酶生产获得的单独的发酵上清液，或相较于可比较的商业酶制剂，在生物质水中显示更优的性能。此外，可显示生理地和/或机械地和/或化学地处理根据步骤d的微生物提供了细胞外和细胞内水解酶系统的最佳活化，所述酶系统在下游水解操作中协同作用，从而导致木质纤维素原料至单体糖组分例如葡萄糖和木糖的最佳降解。
[酶生产(步骤c)]
如下表征根据步骤(c)的酶生产：在第一步骤中利用微生物接种经预处理的木质纤维素生物质，所述微生物可以是细菌、古细菌、酵母或真菌微生物，其能够产生分解纤维素和/或分解半纤维素酶促活性。分解纤维素活性是能够降解例如水解纤维素(例如能够水解其中的一些或全部糖苷键)的活性。分解半纤维素活性是能够降解例如水解半纤维素(例如能够水解其中的一些或全部糖苷键)的活性。半纤维素包括构件块例如木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木糖葡聚糖。
在非限定实施例中，所述酶促活性包括外切型和内切型纤维素酶(即纤维二糖水解酶(CBH)I、II、内切葡聚糖酶(EG)I-IV、β-葡萄糖苷酶(BGL))、外切和内切半纤维素酶(即木聚糖酶、木糖苷酶、β-木糖苷酶(xylobiase)、阿拉伯糖酶、阿拉伯岩藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶)和酯酶(Howard 等人，2003，Lynd等人，2002)。因此，本发明包括优选实施方案，其中至少一种具有分解纤维素和/或分解半纤维素活性的酶具有一种或多种选自下组的活性：I型或II型纤维二糖水解酶(CBH I或CBH II)、I、II、III或IV型内切葡聚糖酶(EGI、EGII、EGIII、EGIV)、β-葡糖苷酶(BGL)、酯酶、外切半纤维素酶和内切半纤维素酶。更优选的是外切半纤维素酶和内切半纤维素酶优选选自木聚糖酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯岩藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶。
产生所述酶活性，从而可优选地按照本发明使用的细菌的非限定性实例包括不动杆菌属种(Actinobacter sp.)、土壤杆菌属种(Agrobacterium sp.)、芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)、伯克霍尔德氏菌属种(Burkholdria sp.)、梭菌属种(Clostridia sp.)、热解纤维素菌属种(Caldicellulosiruptor sp.)、纤维弧菌属种(Cellvibrio sp.)、盐杆菌属种(Halobacterium sp.)、假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)、类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.)、黄单胞菌属种(Xanthomonas sp.)和Thermobifida sp.(Howard等人，2003，Maki等人，2009)。
产生所述酶，从而优选根据本发明使用的古细菌的非限定性实例包括火球菌属种(Pyrochoccus sp.)、Sulphobolus sp.、葡萄嗜热菌属种(Staphylothermus sp.)和热球菌属种(Thermococcus sp.)(Maki等人，2009)。
真菌通常是用于本发明的最优选微生物。可优选进行根据本发明的方法，以便微生物是真菌，所述真菌优选选自：木霉属种(Trichoderma sp.)、曲霉菌属种(Aspergillussp.)、青霉属种(Penicillium sp.)和Talaromyces sp.。产生所述酶活性，从而优选根据本发明使用的真菌的非限定性实例包括曲霉菌属种、毛壳菌属种(Chaetomium sp.)、Chrysosporium sp.、镰孢霉属种(Fusarium sp.)、腐质霉属种(Humicola sp.)、Orpinomyces sp.、青霉属种(Pencillium sp.)、Phanerochaete sp.、Piromyces sp.、Talaromyces sp.、栓菌属种(Trametes sp.)和木霉属种或它们各自的全型(holomorphs)(Howard等人，2003)。特别优选的是选自木霉属种和Talaromyces sp.的真菌。
产生酶的生物的选择可通过经预处理的原料浆液的碳水化合物组成、由特定生物产生的酶活性的量和生物物理特征(包括参数例如温度稳定性、底物选择性、比活性和抑制剂耐受性)来确定。
为了诱导酶产生，在适宜的生长温度下温育所述微生物，取决于所使用的微生物，所述温度通常可在14与102℃之间，优选28与102℃之间变化。直至开始产生酶的温育时间可因微生物的类型而变化很大(Lynd等人，2002)，但可利用由Xiao等人(2004b)或Bobey和Ederer(1981)描述的方法测试经预处理的原料。
在本发明的优选方面，酶生产利用丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)(无性态：Hypocrea jecornia)的纤维素酶产生性菌株来实现。这样的微生物的非限定性实例是里氏木霉菌株Rut-C30(Lynd等人，2002，Szijarto等人，2004)。在本发明的另一个优选方面，在经预处理的生物质(作为唯一的重要碳源)上产生真菌酶系统。优选利用真菌例如里氏木霉产生真菌酶系统。可在经预处理的原料浆料上生长里氏木霉的起始培养物直至孢子出现，其可使用方法例如在OD600nm的分光光度计测量来定量。随后真菌在恒定的混合(以50-250rpm)和pH、温度以及氧受控的条件下生长3-7天。在整个发酵过程中，至关重要的是在30℃和pH5下温育真菌以产生最大量的酶和生物质。在第5天，通常实现最大生物质和酶的生产，这使得能够进一步进行处理。
生长培养基通常包括碳源、氮源、任选地维生素和痕量矿物质。以1-30％w/v，更优选1-10％w/v和甚至更优选1-8％w/v给培养基提供碳源。碳源可包括天然或经预处理的木质纤维素生物质例如木材、谷草、甘蔗渣、柳枝稷和纤维素，以及获自浆料和纸生产的粗制纸浆。备选的碳源可包括纯化的纤维素、浆料、乳清、糖蜜或糖例如葡萄糖和乳糖。可使用碳源的组合，其中一种碳源是步骤b)的产物或其等同物，而存在的另外的碳源例如本段中上述的一种碳源。以0.1-10％w/v，更优选0.1-8％w/v和甚至更优选0.1-4％w/v给培养基提供氮源。氮源包括大豆饼(soybean expeller)、玉米浆、酵母提取物、青饲料(磨碎的草)、麦麸、废酒糟和无机铵盐。以0-5％w/v，更优选0.001-1％w/v给培养基提供维生素和痕量矿物质。提供给培养基的痕量矿物质可包括Fe、Mn、Zn和Co盐，而加入培养基的维生素可包括维生素B复合物、生物素、伴白蛋白。
用于纤维素酶生产者的有效生长的确切培养基组成和物理条件对于本领域技术人员来说是已知的。生长培养基的最终选择将取决于所使用的微生物。
在本发明的优选实施方案中，微生物生物质和包含残留木质纤维素生物质以及大部分纤维素酶和半纤维素酶活性的废发酵培养基将用于下游生物质处理步骤。
在本发明中，令人惊讶地发现大部分纤维素酶和半纤维素酶活性保留在残留的经预处理的原料生物质和产生的真菌生物质上。
甚至更有趣地，可显示当使用整个含酶发酵浆料(上清液和菌丝体/生物质)时，与仅使用含酶发酵上清液或商业酶制剂的水解实验相比较，生物质水解更高效。
这可任选地通过将可通过预处理获得的生物质浆料分成两股流(以便一部分经历步骤c)，而另一部分直接经历步骤e))来实现。研究人员已令人惊讶地发现可将部分经预处理的生物质经历微生物的生长培养基。应理解，微生物从而能够产生适合用于降解经预处理的生物质的酶。因此本发明还在优选实施方案内提供了用于降解木质纤维素生物质的方法，所述方法包括步骤：
a)物理-化学预处理木质纤维素生物质以获得经预处理的浆料；
b)将步骤a)的经预处理的浆料分成两部分，部分A和部分B；
c)将部分A掺入原始生长培养基以产生终生长培养基，在终生长培养基中培养至少一种能够产生至少一种具有分解纤维素和/或分解半纤维素活性的酶的微生物，从而获得包含所述至少一种酶的富含微生物的悬浮物；
d)处理步骤c的微生物和/或富含微生物的悬浮物；
e)将部分B和步骤d)的产物一起添加至反应器以进行生物质水解来获得可溶性糖。
方法的流程图示于图1中。
在该方法的优选实施方案中，部分A是少部分步骤a中获得的经预处理的浆料，优选1至20％(干固体重量)，更优选1至5％(干固体重量)以及最优选1至5％(干固体重量)。固体是坚硬颗粒，即在使用的处理条件下不溶于液相的颗粒。
[微生物(步骤(d)的处理]
令人惊讶地发现，在水解步骤e)之前物理地和/或机械地和/或化学地处理步骤d)中的发酵浆料以及将处理的产物经历步骤e)将增强生物质水解动力学，并且导致更高的可溶性糖产率(图2)。更高的可溶性糖的产率可在此理解为，当将步骤c)的产物经历步骤d)时，在实施例4中描述的条件下进行72小时之后可获得的产率比当省略步骤d)时更高。现有技术(Rao等人，1985)没有公开这样的处理。其中在木质纤维素水解之前机械地处理商业纤维素酶(Celluclast，Novozymes，Denkmark)/BGL(Novo188，Novozymes，Denkmark)制剂的对照实验不导致木质纤维素水解动力学的增强或更高的可溶性糖产率。
在一个实施方案中，在培养步骤之后，例如通过离心或本领域公知的其它方法分离通过培养步骤c)获得的微生物。在该实施方案中，将分离的微生物经历步骤d)。然而，在本发明的备选的和甚至更优选实施方案中，整个含微生物的悬浮物，即包含微生物和生长培养基的(c)的培养产物，是在生物质水解之前经物理地和/或机械地和/或化学地处理的。整个含微生物的悬浮物而非仅仅含微生物的悬浮物的上清液用于生物水解的应用允许在下游生物质水解操作中更高效的酶配量，如本发明的研究人员已令人惊讶地发现的。处理可以是物理、机械、化学处理或它们的组合。
在本发明的优选实践中，在发酵容器中，使含微生物悬浮物经历增加转子速度的搅拌。在本发明的另一个优选实践中，抽泵含微生物悬浮物并在含有超大胸廓(ultrathorax)的传输管中进行剪切。如果微生物是真菌，这两个实施方案的任一个可以是特别有用的，这样处理包括真菌菌丝体的处理。
可如下进行机械处理：其可包括使微生物或微生物悬浮物经历1-500kW/m3，更优选1-200kW/m3，更优选1-100kW/m3的比容积功输入(也称为“功率输入”)，进行优选0.1～60分钟，更优选1～30分钟，更优选1～10分钟的持续时间。
机械处理可选自利用混合器的处理、利用匀浆器的处理和利用碾磨机的处理。这样的机械处理可对微生物施加机械切变应力或磨削力，并且可破裂或破坏细胞膜和/或细胞壁或真菌菌丝体或其部分。超过一种这样的处理可彼此组合。细胞结构例如细胞膜和/或细胞壁或真菌菌丝体或其部分的破裂或破坏，可通过本领域技术人员公知的方法例如显微镜法测试。
在本发明的优选实践中，含微生物的悬浮物经处理，即在发酵酶生产周期结束时通过增加叶轮转速(impellor speed)进行剪切。
在反应容器中，机械过程的功效是通过施用于微生物生物质的相对功率梯度控制的。
备选地，可通过将含微生物的发酵浆料从发酵容器泵至水解容器来引起导致水解酶活性增加的剪切应力。可在传输管中抽泵和剪切含微生物浆料。可籍此剪切微生物。在剪切速率方面，使含微生物浆料经历1600-500001/s，更优选1600-270001/s和甚至更优选1600-100001/s。该处理适合于引起水解酶活性的增加。该处理可进行优选0.01至100s。
备选地，可使含微生物浆料经历高压均质或经历超声处理或本领域技术人员已知的引起高剪切应力的其它设备例如Ultraturax。在本发明的优选实践中，在发酵容器中，使含微生物浆料经历增加转子速度的搅拌。在本发明的另一个优选实践中，在传输管中抽泵含微生物悬浮物。由此可剪切微生物。在剪切速率方面，使含微生物浆料经历1600-500001/s，更优选1600-270001/s，更优选1600-100001/s，以诱导水解酶活性的增加，进行0.01至100s的一段时间。
读者将理解，本发明包括本文中公开的值的任何特定组合。例如，本文中公开的任何特定的剪切速率或剪切速率的范围将被理解为与进行本文中公开的这样的处理的任何指定时间(分钟或秒)的组合的明确公开。同样地，本文中公开的任何比容积功输入或比容积功输入范围还将被理解为与本文中公开的进行这样的输入的任何指定的时间(分钟或秒)的组合的明确公开。本发明的部分也是那些实施方案，其中比容积功输入(kW/m3)与时间(分钟)的乘积等于本文中公开的其任何乘积。本发明的部分也是那些实施方案，其中剪切速率(1/s)与时间(s)的乘积等于本文中公开的其任何乘积。
在本发明的特定实施方案中，组合机械与化学裂解方法，这增强任一方法的功效。
在本发明的特定实践中，将微生物或含微生物的悬浮物以0.01-2％w/w d.s.的菌丝体，更优选0.01-1％w/w d.s.的菌丝体，甚至更优选0.01-0.5％w/w d.s.的菌丝体浓度与表面活性剂，最优选Triton X-100混合。随后，使微生物/表面活性剂混合物优选经历上述剪切过程，这是例如特别有利的如果微生物是真菌，以便可剪切其菌丝体。(表面活性剂或去垢剂不是特别地限制类别的常用有机化合物，其通常包含疏水基团和亲水基团，从而具有两亲性特征)。
在本发明的另一个优选实践中，将微生物或含微生物悬浮物以1-30％w/v，更优选1-20％w/v以及甚至更优选1-5％w/v的浓度与有机溶剂(包括胺、醚或醇例如乙醇)混合。随后，将微生物/表面活性剂混合物经历上述剪切过程，这是例如特别有利的如果微生物是真菌，以便可剪切其菌丝体。
可通过增加发酵容器的叶轮速度，通过将发酵浆料从起源泵至靶容器以及通过在指定的反应容器中进行高压均质来实现输入浆料中的指定功率。化学试剂例如盐、有机溶剂、酶和表面活性的添加显著地减小获得成功菌丝体裂解和细胞内酶组分的释放的必需功率输入。
在本发明的另一个方面，通过化学裂解实现机械处理，所述化学裂解可通过添加无机盐(osmolysis)、酶、有机溶剂和/或表面活性剂来实现。在本发明的一个特定方面，通过添加0.01-10M，更优选0.01-5M，甚至更优选0.1-1M无机盐例如NaCl、KCl或其它化学应力试剂例如(NH2)2CO、CH6ClN3来诱导菌丝体细胞裂解。
在本发明的另一个特定方面，化学裂解试剂可包括带电荷或不带电荷的表面活性剂(Biotechnol Lett.(1980)2，pp.43-48)，例如Tween-80(不带电荷的)、Triton X-100(不带电荷的)、SDS(带负电荷的)或CTAB(带正电荷的)，分别以0.1-3％w/w d.s.微生物生物质，更优选0.1-1％w/w d.s.菌丝，和甚至更优选0.5-1％/w d.s.微生物生物质的浓度施用所述表面活性剂。
在本发明的另一个方面，化学裂解试剂可包含酶或酶系统，例如壳多糖酶(PlantPathol.(200)49，pp.573-589)，可以分别以0.01-10％w/w d.s.微生物生物质，更优选0.01-1％w/w d.s.菌丝，甚至更优选以0.01-0.1％/w d.s.菌丝的浓度施用所述酶或酶系统，随后分别在20-70℃温育0.1-72h。
在本发明的特定实践中，组合机械和化学裂解方法，据信这增强任一方法的功效。
在本发明的特定实践中，将微生物以0.01-5％w/w d.s.微生物生物质，更优选0.01-1％w/w d.s.微生物生物质的浓度与表面活性剂，最优选Triton X-100混合。随后，使微生物/表面活性剂混合物经历1-500kW/m3，更优选1-200kW/m3的比容积功输入，进行0.1-60分钟，以进行有效处理。
在本发明的另一个优选实践中，将微生物生物质以5-40％w/v，更优选20-40％w/v，甚至更优选30-35％w/v的浓度与有机溶剂(包括胺、醚或醇例如乙醇)混合。随后，使微生物/有机溶剂混合物经历1-500kW/m3，更优选1-200kW/m3的比容积功输入，进行0.1-60分钟以进行有效处理。
可通过增加发酵容器的叶轮速度，通过将发酵浆料从起源泵至靶容器以及通过在指定的反应容器中进行高压均质来实现输入浆料中的指定功率。化学试剂例如盐、有机溶剂、酶和表面活性的添加显著地减小获得成功菌丝体裂解和细胞内酶组分的释放的必需功率输入。
已意外地发现细胞内酶活性从产生酶的生物的释放可增强所应用的酶系统的水解性能，这样可应用更低的纤维素和β-葡糖苷酶配量方案。
根据本发明的数据，令人惊讶地显示在水解之前剪切或另外地物理地或机械地或化学地处理菌丝体生物质将释放的β-葡糖苷酶(BGL)，与不这样操作但为获得相同的水解产率而必须外源地提供的β-葡糖苷酶(BGL)一样多。剪切和BG1活性的外源性添加具有累加效应，从而产生更高的糖产率和增强的糖化动力学。
菌丝体结合的酶活性的释放还允许减少纤维素酶配量而不减弱水解动力学或来自木质纤维素生物质的可溶性糖产率。总的来说，本文中公开的教导显示将预处理的原料作为唯一生长培养基允许产生非常适合分解该特定木质纤维素材料的酶系统。因此，本发明中公开的现场酶生产允许木质纤维素原料和预处理选项的选择的最大灵活性。此外，整个废发酵浆料用于下游生物质水解操作的应用允许更高效的配量方案，所述方案增加产物产率和酶的成本效益。
在水解操作中减少酶配量方案还可通过从产生酶的生物体释放细胞内酶活性从而增强细胞外酶系统的性能进行。
如果将真菌用于酶生产，则处理步骤d)的目的是破裂真菌的全部或部分例如真菌菌丝体。
[生物质水解(步骤(e)]
为了实现经预处理的木质纤维素生物质至可发酵的、单体己糖(即葡萄糖)和戊糖(即木糖)的分解，将来自一体化酶生产的废发酵浆料(上清液和菌丝体)与经预处理的生物质一起添加至反应器中以进行生物质水解。如通常已知的，己糖是具有6个碳原子的单糖，戊糖是具有5个碳原子的单糖。
在非限定性实例中，可优选以分批模式水解具有达到30％，优选15-30％(w/w)的固体内容物的经预处理的生物质浆料。
对于本领域技术人员来说很明显的是，水解酶系统的配量、温育时间、停留时间、用于生物质水解的任选补料方案和水解效率与应用的特定酶系统和原料内在关联。
在本发明的特定实施方案中，经预处理的生物质浆料的水解将通过由所述丝状真菌里氏木霉产生的酶系统来实现。
在该情况下，将经预处理的原料浆料与含有水解酶系统的废的和任选地剪切的发酵浆料混合。在此类条件下用于木质纤维素原料的优选配量方案在0.1-1％w的酶/w的原料或1-20FPU/g在原料中包含的纤维素的范围内变化(Zu等人，2009)。
在18-72h的停留时间上在45-55℃的温度实现经预处理的生物质的水解。在本发明的特别优选实施方案中，以0.25-0.8％w的酶/d.s的经预处理的原料(补充或未补充另外的β-葡糖苷酶)的酶配量和在50-53℃的温度于72小时内实现经预处理的谷草的分批水解。令人惊讶地，即使利用低酶配量方案，仍然可获得相对于所述原料中包含的总糖高出50％w/w的水解产率。这些在低酶配量方案下产生的高糖产率的实现可归因于高效酶系统的一体化产生，如上文中已描述的。
本发明任选地包括在方法的步骤e)中添加β-葡糖苷酶。
优选，水解反应的特征在于步骤e)中获得的可溶性糖包括单体C5糖和/或C6糖，优选葡萄糖和/或木糖。
在本发明的优选实施方案中，将包含富含糖的上清液和富含固体木质素的残渣的生物质水解物经历固体/液体分离法，所述方法这可通过例如离心、过滤或简单的重力倾析来实现。应理解，可溶性糖是当进行固体/液体分离(如对于本领域技术人员来说是已知的)时可主要见于液相中的所有糖。
[生物质水解物的发酵]
本发明的任选其它方面是在步骤e)中获得的生物质水解物的发酵。因此，本发明还包括上述方法，其进一步特征在于进一步加工富含糖的相。在特定的实施方案中，将富含糖的液相进一步加工成乙醇。可在本发明的意义内将微生物用于将含戊糖和己糖的生物质水解物转化成乙醇。
优选地，在该步骤中，使用可从步骤e)获得的富含糖的液相，其包含高可发酵的糖含量，优选为约15-50％w/v。在本说明书中糖含量是所有戊糖和己糖的含量。在本发明的优选实施方案中，该生物质水解物具有16-25％w/v的糖含量。在本发明的更优选实施方案中，生物质水解物还包含从一体化酶生产方法留传的另外的营养物(即蛋白质、盐和糖)。
可利用显示过程稳固性(process robustness)、高抑制剂/乙醇耐受性、在高和低糖浓度下的可靠的产物产率的微生物菌株实现生物质水解物至乙醇的发酵。可将糖转化成乙醇的此类微生物的非限定性实例包括面包酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)、运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)、大肠杆菌(E.coli)、产酸克雷伯式菌(Klebsiella oxytoca)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)。
用于方法选择和生物体的选择的选择标准是过程稳固性、产物/抑制剂/温度耐受性以及恒定的高乙醇产率(Fischer等人，2008；Matsushika等人，2009)。
可在28-70℃的温度进行乙醇发酵，取决于所用微生物的最适温度和发酵效率，进行10-48小时(Matsushika等人，2009)。
现有技术的教导显示己糖至乙醇的理论转化极限对于酵母可以为51％w/w(即1g葡萄糖对0.51g乙醇)(Matsushika等人，2009)。
在本文中描述的公开内容中，令人惊讶地发现所述预处理不影响生物质水解或发酵操作的性能。
利用酵母菌株的己糖发酵可在28-35℃的温度、pH4-6进行，并可在10-48h内完成。作为发酵的结果，获得包含酵母生物质和约0.5-25％w/v的乙醇(这取决于生物质水解物的初始糖浓度以及戊糖和己糖的转化效率)的浆料。
[乙醇回收]
可通过本领域技术人员已知的各种方法来实现从发酵液体回收乙醇。一个这样的方法是依赖于酿造和化学工业中使用的设备例如蒸馏柱(distillation column)的常规蒸馏和提纯法。这些技术在工业中已良好建立，且可备选装置本身是已知的(Leland，2008，Cardona和Sanchez，2007)。在本发明的可选择实施方案中，通过汽提技术(strippingtechnology)回收乙醇，这样的技术的非限定性实例是真空汽提、气提、喷淋蒸发(sprayevaporation)。
本发明的实践可导致90-100％v/v的乙醇产物。可将该产物任选地与添加剂混合或可选择地加工以配制可运送至最终消费者的产品。
术语的定义：
在本发明中，使用许多术语，在下文中定义所述术语。
术语“生物质”和“木质纤维素生物质”是指任何纤维素或木质纤维素材料，包括包含纤维素和任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、多糖、寡糖和/或单糖的材料。生物质还可包含另外的组分，例如蛋白质、脂质、蜡、酚和类固醇。生物质通常可来源于单个来源，或包括来源于超过一个来源的混合物；例如，生物质可包含小麦spelts与小麦秸杆的混合物、或草与叶的混合物。生物质的非限定性实例是生物能农作物、农业废物、大都市固体废物(municipal solid waste)、工业固体废弃物(industrial solid waste)、造纸污泥(sludge from paper manufacture)、庭院废弃物(yard waste)、木材和林业废物。纯生物质的具体地非限定性实例包括燕麦spelts、玉米穗轴(corn cobs)、农作物残渣例如玉蜀黍的包皮(corn husks)、玉米秸秆(corn stover)、草、小麦、小麦秸杆、大麦、大麦秸杆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、获自谷物的碾磨的组分、树、枝条、根、叶、木屑、锯屑、灌木和矮树丛、蔬菜、水果、花和动物畜粪。
术语“机械退浆”是指用于减少生物质的颗粒尺寸的任何机械方法。退浆应用的非限定性实例是锤子碾磨或破碎。
术语“经预处理的生物质”意指在糖化之前已经历物化处理的生物质。在本文中进一步描述处理例如预处理。
术语“木质纤维素(的)”是指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维素材料还可包含半纤维素。
术语“纤维素(的)”是指包含纤维素的组合物。
术语“糖化”或“生物质水解”是指从多糖产生可发酵糖。
术语“可发酵糖”是指可被微生物在发酵过程中用作碳源来产生产物例如乙醇的寡糖和单糖。
术语“水解物”是指糖化的产物，其包含在糖化过程中产生的糖，剩余的未水解的生物质以及用于生物质水解的酶。
术语“浆料”是指不溶性材料和液体的混合物。
术语“可混合的浆料”是指在其经历的搅拌系统的作用下变成大体上均匀的浆料。“混合程度”是指浆料的该性质。
术语“充分混合的浆料”是指其中浆料的组分大体上均等地分布在(匀匀的)整个浆料中的状态。
生物质的“干重”或“d.w.”意指除去了全部水或基本上除去了全部水的生物质的重量。通常根据美国材料与试验协会(American Society for Testing and Materials)(ASTM)标准E1756-01(用于测定生物质中的总固体的标准测试法)或纸浆和造纸工业技术协会(Technical Association of the Pulp and Paper Industry)，Inc.(TAPPI)标准T-412om-02(纸浆、纸和纸板中的水份)测量干重。
术语“干重”(d.w.)或“干物质”(d.s.)是指添加至每一批次或批次补料系统反应器的生物质干重的总量，在添加的时刻计算，作为运行结束时反应器中反应组合物的总重量的百分比。
术语“糖化酶“或“水解酶”可以指包含一种或多种用于水解聚合生物质，从而将寡糖和/或单糖释放至水解物中的酶(其中超过一种酶是优选的)的糖化酶系统。糖化酶系统包含一种或多种选自“糖苷酶”类的酶，其水解二糖、寡糖和多糖的醚键，并且见于“水解酶”大类(EC3.)的酶分类EC3.2.1.x。此外，可存在可以属于或可以不属于该类的其它酶。可根据它们水解的生物质组分分类用于本方法的糖苷酶。用于本方法的糖苷酶包括水解纤维素的糖苷酶(例如，纤维素酶、内纤维素酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、水解半纤维素的糖苷酶，称为半纤维素酶(例如，木聚糖酶、木聚糖内切酶、木聚糖外切酶、β-木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶(arabinoxylanases)、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶和水解淀粉的糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶类、β-淀粉酶类、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶)。此外，可有用地将其它添加剂添加至糖化酶系统例如肽酶(EC3.4.x.y)、脂酶(EC3.1.1.x和3.1.4.x)、木质素酶(EC1.11.1.x)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)以帮助从生物质的其它组分释放多糖。在本领域众所周知的是产生水解多糖的酶的微生物通常显示活性例如纤维素降解，所述活性由具有不同底物特异性的几种酶或一组酶催化的。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包含一组酶，其全部或一些可促成纤维素降解活性。商业或非商业酶制剂例如纤维素酶可包含许多酶，这取决于用于获得酶的纯化方案。因此，本方法中使用的糖化酶包括至少一种“纤维素酶”，该活性可通过超过一种酶来催化。任选地，本方法中使用的糖化酶可包括至少一种半纤维素酶，这通常取决于本方法中使用的预处理的生物质的类型。例如，当糖化利用酸预处理的生物质时通常不需要半纤维素酶，当糖化在中性或碱性条件下预处理的生物质时通常包括半纤维素酶。糖化酶可商购获得，例如CP纤维素酶(Genencor International，Rochester，N.Y.)和木聚糖酶(Genencor)。此外，可生物地(包括使用重组微生物地)产生糖化酶。可开发可用于本发明的新型糖化酶。
SSF代表同时糖和发酵。
实施例
使用下列术语：
“HPLC”是高效液相色谱，“C”是摄氏度，“kPa”千帕斯卡，“m”是米，“mm”是毫米，“kW”是千瓦，“μm”是微米，“μL”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩尔，“cm”是厘米，“g”是克，“kg”是千克，“wt”是重量，“hr”是小时，“temp”或“T”是温度，“theoret”是理论的，“pretreat”是预处理，“DWB”是生物质的干重，“ASME”是美国机械工程师学会，“s.s.”是不锈钢，“in”是英尺，“PSD”是颗粒大小分布，“d-50”是其中颗粒累加体积达50％的颗粒低于该尺寸的颗粒直径，“d-95”是指其中颗粒累加体积达95％的颗粒低于该尺寸的颗粒直径，“rpm”是每分钟的转数。
硫酸、氢氧化铵、醋酸、乙酰胺、酵母提取物、葡萄糖、木糖、山梨醇、MgSO4·7H2O、磷酸和柠檬酸获自Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)。
生物质的组成通过本领域公知的标准方法的任一种(例如ASTM E1758-01“用于通过HPLC测定碳水化合的标准方法”)来测量。
实施例1：单体糖的测量
为了测定秸杆水解的进展，以适当的时间间隔采集样品，利用HPLC测定可溶性糖含量。
利用HPLC(Agilent Technologies，Palo Alto，Calif.)测量糖化液中的可溶性糖(例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木二糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖)。
直接测量水解物中的单糖。通过离心从水解物除去不溶性物质。调整分离的液体的pH，必要时利用硫酸。必要时，稀释分离的液体，随后通过0.2μm注射器式滤器直接过滤至HPLC小瓶中。
为了分析总的溶解的糖，将10ml稀释样品置于压力小瓶(pressure vial)中，加入349μl75％的H2SO4。将小瓶盖上盖，置于高压釜中进行1小时以将所有糖水解成单糖。冷却样品，利用碳酸钠将它们的pH调整至必需pH，随后将样品过滤至HPLC小瓶中，利用HPLC进行分析。在运行后，根据每一种化合物的标准曲线测定样品中的浓度。
实施例2：小麦秸杆的物理-化学预处理
将小麦秸杆磨碎成小于2cm的颗粒尺寸。随后，将磨碎的秸杆与水混合，添加H2SO4作为预处理催化剂，随后在高压下进行水热处理。
随后将所得的经预处理的原料的悬浮物用于产生水解酶和用于下游操作中的糖化过程。
实施例3：使用经预处理的原料产生水解酶
在丝状真菌里氏木霉的液体深层培养中产生用于将木质纤维素材料转化成组分糖的水解酶(即纤维素酶和半纤维素酶)。
在初始培养步骤中，将种子培养物生长在2升只装有400ml补充有2％w/v的经预处理生物质(参见实施例2)和0.5％v/v的玉米浆的培养液的摇瓶中。利用在600nm具有为10的光密度(OD)的真菌孢子的制剂接种培养基。将摇瓶培养物在250rpm的恒定搅拌下在30℃和pH5生长48小时。
在具有5升的工作容积的生物反应器中进行种子培养物的增大。培养基组成与初始种子培养物设置相同。利用10％v/v的初始种子培养物接种每一种生物反应器。在350rpm的恒定搅拌的条件下，将培养物在30℃(pH5)生长48小时。
在具有100升的工作容积的150升生物反应器中进行主要酶生产。培养基与先前的种子培养相同。然而，为了生产水解酶，添加8％w/v的经预处理生物质和2％v/v的玉米浆。利用5％v/v的第二种子培养物接种培养液。随后在350rpm的恒定搅拌下于30℃生长产生酶的真菌里氏木霉。推荐在25％的恒定pO2下生长5天，以确保在好气条件下进行最佳酶生产。在5天的培养条件后，收获包含预处理的生物质的残渣、废发酵培养液(培养基)和真菌菌丝体的整个含酶发酵浆料。
利用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford法测定发酵液(上清液)中的总的可溶性酶(蛋白质)的浓度(Bradford，M.，1976)。
在下游水解实验中，利用含酶上清液或整个发酵浆料(上清液+经预处理的生物质+真菌菌丝体)。
实施例4：秸杆水解
利用纤维素酶系统水解经预处理的小麦秸杆，所述纤维素酶系统包含(i)实施例3中描述的上清液、(ii)全部真菌悬浮物(真菌菌丝体+生物质+上清液)或(iii)其中已在真菌秸杆水解之前真菌菌丝体被剪切的全部真菌悬浮物。任选地还在外源添加的β-葡糖苷酶(BGL)存在的情况下进行水解实验。
在被调整至pH5的培养基中，在50℃于1升具有20％w/w d.s.的经预处理的秸杆的反应体积中进行水解反应72小时。水解酶配量方案是0.5％w的纤维素酶/w经预处理的秸杆。酶的配量参考实施例2中测定的废发酵液中的总蛋白质浓度。任选地，利用额外的BGL活性(Novo188，Novozymes，Denkmark)进行反应。以2个纤维二糖单位(CBU)/mg纤维素酶进行BGL活性配量。如由Prior等人(2008)所述，测定CBU。
在恒定搅拌(50rpm)下于生物反应器系统中进行糖化反应，以确保等同的反应条件。在特定的实验中，通过在下游木质纤维素水解过程之前，将叶轮(L5M，SilversonMachines Ltd.)速度增加至8000rpm进行30分钟来剪切含水解酶的发酵浆料。为了测定水解动力学和葡萄糖产率，在第3、7、24和48h采集样品。通过上述HPLC法测量表观葡萄糖释放。不同水解设置的结果示于图2中。
图2中的数据显示如果将含酶的木霉属真菌悬浮物(参见实施例3)用于在BGL补充不存在的情况下水解经预处理的秸杆，在水解之前剪切真菌生物质增强水解动力学和终末葡萄糖产率。
仅利用BGL补充的发酵液(上清液)进行经预处理的秸杆的水解实验，显示与在BGL不存在的情况下利用整个剪切的发酵浆料进行的反应相似的水解动力学和终葡萄糖产率。
利用额外地补充有BGL的剪切的整个发酵浆料(即真菌菌丝体、生物质和上清液)的水解反应，显示相较于所有其它检查的水解方法最有利的水解动力学和糖产率。该令人惊讶的作用可归因于细胞内和/或表面结合至微生物的酶活性释放，该作用与发酵液中的可溶性纤维素酶系统协同作用。
附图概述：
图1：包括来自现场酶生产留传的菌丝体的生物质转化成乙醇的方法。L＝木质素，P＝戊糖，H＝己糖。图1是通常举例说明用于通过根据本发明的发酵途径将木质纤维素转化成乙醇的生物精炼法(biorefining process)方框图。
图.2：葡萄糖从预处理的秸杆释放。水解条件：20％w/w d.s.的经预处理的生物质，纤维素酶配量：0.5％w可溶性酶/w的经预处理的生物质，任选的BGL配量：2CBU/mg纤维素酶，在第3、7、24、48、72h小时取样。在额外的BGL活性不存在和存在的情况下，利用含酶发酵液体培养基或剪切的/未剪切的整个发酵浆料(液体培养基上清液+生物质+真菌菌丝体)进行生物质水解。
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Claims (17)

1.一种用于降解木质纤维素生物质的方法，其包括步骤：
a)物理－化学预处理木质纤维素生物质以获得经预处理的浆料；
b)将步骤a)的经预处理的浆料分成两部分，部分A和部分B；
c)将部分A掺入原始生长培养基以产生终生长培养基，并且在终生长培养基中培养至少一种能够产生至少一种具有分解纤维素和/或分解半纤维素活性的酶的微生物，从而获得包含所述至少一种酶的富含微生物的悬浮物；
d)处理步骤c)的微生物和/或富含微生物的悬浮物，其中所述处理包括下列机械处理的一种或多种；
(i)机械处理，包括经历1-500kW/m3的比容积功输入，和/或
(ii)机械处理，其选自利用混合器的处理、利用匀浆器的处理和利用碾磨机的处理，
e)将部分B和步骤d)的产物一起添加至反应器以进行生物质水解来获得可溶性糖；
其中，所述步骤d)包括将含微生物的发酵浆料从发酵容器泵至水解容器，微生物和/或富含微生物的混悬液所承受的剪切速率在1600-50000 1/s的范围内。
2.权利要求1的方法，其中步骤d)中的机械处理包括选自利用混合器的处理、利用匀浆器的处理和利用碾磨机的处理的机械处理，其中所述机械处理能够对微生物施加机械剪切应力或磨削力，并且可破裂或破坏细胞膜和/或细胞壁结构。
3.权利要求1或2的方法，其中部分A是步骤a)中获得的经预处理的浆料的少数部分，其中所述少数部分是1至20％干固体重量。
4.权利要求3的方法，其中所述少数部分是1至5％干固体重量。
5.权利要求1的方法，其中所承受的剪切速率在1600-270001/s的范围内。
6.权利要求1或2的方法，其中将所述抽泵进行0.01至100s的一段时间。
7.权利要求1或2的方法，其中步骤d)包括利用超声波的处理。
8.权利要求1或2的方法，其中所述步骤d)包括化学处理，所述化学处理是利用一种或多种化学试剂的处理。
9.权利要求8的方法，其中所述一种或多种化学试剂选自下组：盐、有机溶剂、表面活性剂和酶。
10.权利要求1的方法，其中步骤d)包括权利要求2的机械处理和利用根据权利要求8或9的一种或多种化学试剂的处理。
11.权利要求1或2的方法，其中所述微生物是真菌。
12.权利要求11的方法，其中所述真菌选自下组：木霉属种(Trichoderma sp.)、曲霉菌属种(Aspergillus sp.)、青霉属种(Penicillium sp.)和Talaromyces sp.。
13.权利要求12的方法，其中所述真菌选自下组：木霉属种和Talaromyces sp.。
14.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种具有分解纤维素和/或分解半纤维素活性的酶具有一个或多个选自下组的活性：I型或II型纤维二糖水解酶(CBH I或CBH II)、I、II、III或IV型内纤维素酶(EG)、β-葡糖苷酶(BGL)、酯酶、外切半纤维素酶和内切半纤维素酶。
15.权利要求14的方法，其中外切半纤维素酶和内切半纤维素酶选自下组：木聚糖酶、木糖苷酶、β-木糖苷酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯岩藻糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、半乳糖酶和半乳糖苷酶。
16.权利要求1或2的方法，其中在步骤e)中添加β-葡糖苷酶。
17.权利要求1或2的方法，其中将步骤e)的所述可溶性糖进一步加工成乙醇。
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