CN102533688B

CN102533688B - 反胶束萃取纯化木质素过氧化物酶的方法

Info

Publication number: CN102533688B
Application number: CN201210058193.7A
Authority: CN
Inventors: 袁兴中; 彭馨; 黄华军; 郭灵芝; 曾光明
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2012-03-07
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2032-03-07
Also published as: CN102533688A

Abstract

本发明公开了一种反胶束萃取纯化木质素过氧化物酶的方法，包括以下步骤：配制包括生物表面活性剂、异辛烷和正己醇的反胶束溶液，其中生物表面活性剂为鼠李糖脂；将配制好的木质素过氧化物酶粗酶液与所述反胶束溶液混合，搅拌，离心后静置分相，留取上层有机相；将所述上层有机相与缓冲液混合，搅拌，离心后静置分相，留取下层水相，得到纯化后的木质素过氧化物酶溶液。本发明的方法环保安全、操作简便且成本低。

Description

反胶束萃取纯化木质素过氧化物酶的方法

技术领域

本发明涉及一种萃取纯化酶的方法，尤其涉及一种反胶束萃取提纯木质素过氧化物酶的方法。

背景技术

木质素是由苯丙烷结构单元组成的复杂的近似球状的芳香族高聚体，其降解难度减缓了地球上碳循环的速度。木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase，LiP)、锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)和漆酶(Laccase)构成木质素降解体系，研究表明，LiP在木素降解中起关键作用。此酶具有广泛的底物范围和极强的氧化能力，利用该酶降解各种污染物已成为当今世界环境污染治理的研究热点。目前，LiP的纯化方法多采用盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析，这些方法存在操作时间长，不易放大等缺点。反胶束纯化技术弥补了这些缺点，且具有成本低，可以重复利用等优点，有广阔的工业应用前景。

反胶束是溶解在有机溶剂中的表面活性剂在超过临界胶束浓度时自发形成的聚集体。当含反胶束的有机溶剂和蛋白质水溶液接触时，蛋白质在静电作用和疏水作用下进入有机相，然后再调节适当的条件，使蛋白质从有机相重新反萃取到水相中，以达到纯化的目的。在萃取过程中，可以通过改变pH、离子强度、表面活性剂种类和浓度等因素实现对目标酶的选择性萃取。因此，萃取条件对纯化效果有着至关重要的作用。目前，反胶束萃取技术局限于应用化学表面活性剂，常用的化学合成表面活性剂在酶催化反应过程中与酶蛋白表面易产生强烈的静电相互作用，使酶蛋白易变性失活，从而降低酶催化作用的有效性，阻碍了反胶束萃取纯化酶的进展。因此，开发一种更好的萃取纯化酶的方法成为蛋白质及酶制备的一个重要内容。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种环保安全、操作简便且成本低的反胶束萃取纯化木素过氧化物酶（LiP）的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种反胶束萃取纯化木素过氧化物酶的方法，包括以下步骤：

（1）配制反胶束溶液：配制包括生物表面活性剂、异辛烷和正己醇的反胶束溶液，其中所述生物表面活性剂为鼠李糖脂；

（2）前萃过程：将配制好的木质素过氧化物酶粗酶液与所述反胶束溶液混合，（磁力）搅拌，离心后静置分相，留取上层有机相；

（3）后萃过程：将所述上层有机相与缓冲液混合，（磁力）搅拌，离心后静置分相，留取下层水相，得到纯化后的木质素过氧化物酶溶液。

分别测定所述下层水相中的蛋白质萃取率（EE%）和LiP酶活回收率（AR%），并分析所述下层水相及所述下层水相中粗酶液的成分。

上述的技术方案中，反胶束溶液中生物表面活性剂的浓度优选为2.75 mmol/L～3.0mmol/L；所述反胶束溶液中正己醇与异辛烷的体积比优选为1∶1～1∶1.2。

上述的技术方案中，所述木质素过氧化物酶粗酶液优选是由黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）经培养发酵后制备得到。更优选的，所述培养发酵的过程具体包括：在高压灭菌后的液体发酵培养基中接种黄孢原毛平革菌孢子，每升所述液体发酵培养基中接种的孢子数为4×10⁸～5×10⁸个，37℃～38℃温度、150r/min～180r/min转速下摇床培养6～8天，除去所得培养液中的孢子和菌丝，离心处理后即得木质素过氧化物酶粗酶液。

优选的，所述步骤（2）的前萃过程中，所述木质素过氧化物酶粗酶液的pH值为3.0～3.5，所述木质素过氧化物酶粗酶液中还含有浓度为0.04mol/L～0.045mol/L的KCl溶液。

所述步骤（2）的前萃过程中，所述木质素过氧化物酶粗酶液与所述反胶束溶液是按1∶1～1∶1.2的优选体积比混合。

优选的，所述步骤（3）的后萃过程中，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为6.0～6.5，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中还含有浓度为0.5mol/L～0.55mol/L的KCl溶液。

所述步骤（3）的后萃过程中，所述上层有机相与所述缓冲液是按1∶1～1∶1.2的优选体积比混合。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

（1）采用反胶束技术只需前萃和后萃两步就可以达到萃取纯化的目的，步骤简单，操作方便。

（2）萃取纯化LiP酶活回收率高，纯化程度高。

（3）纯化结果可以通过有效测定和分析得到证实。

（4）具有提取时间短，可在室温下进行，实验容易放大等优点，可应用于工业上粗酶液的初步提纯。

附图说明

图1为实施例1中KCl浓度对蛋白质萃取率和LiP酶活回收率的影响。

图2为实施例2中后萃过程中混合液pH值对蛋白质萃取率和LiP酶活回收率的影响。

图3为本发明具体实施方式中聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种本发明的反胶束萃取纯化木素过氧化物酶的方法，具体包括以下步骤：

（1）配制反胶束溶液：本实施例的反胶束溶液包括生物表面活性剂、异辛烷和正己醇，其中表面活性剂为鼠李糖脂；配制时将鼠李糖脂经超声振荡培养后溶于体积比为1∶1的异辛烷和正己醇混合液中，配制成40mL、浓度为2.75mmol/L的反胶束溶液（即鼠李糖脂-正己醇-异辛烷溶液）。

（2）前萃过程：在500mL锥形瓶中装高压灭菌后的常规液体发酵培养基100mL，接种4×10⁸个黄孢原毛平革菌BKM-F-1767（不限于此菌株，其他的黄孢原毛平革菌菌株均可）孢子到该液体发酵培养基中，37℃温度、150r/min转速下摇床培养6天，用纱布除去所得培养液中的孢子和菌丝，10000rpm/min离心处理10min后即得LiP粗酶液；在LiP粗酶液中加入KCl，分别配制成KCl浓度为0.01mol/L、0.02 mol/L、0.03 mol/L、0.04 mol/L、0.05 mol/L和0.06 mol/L的LiP粗酶液各5mL，LiP粗酶液的pH值均为3.0；将含有不同KCl浓度的各LiP粗酶液与本实施例步骤（1）中配制的反胶束溶液按1∶1的体积比混合，磁力搅拌30min，10000rpm/min离心10min后静置分相，留取上层有机相。

（3）后萃过程：将前萃过程中留取的上层有机相与含0.5mol/L KCl， pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按1∶1的体积比混合，磁力搅拌30min，10000rpm/min离心10min后静置分相，留取下层水相，得到纯化后的木质素过氧化物酶溶液。

采用紫外分光光度法分别测定所得下层水相中的蛋白质含量和LiP酶活，测量结果如图1所示，测量结果显示，前萃过程中KCl浓度较低时，蛋白质萃取率和LiP酶活回收率都较低，随着离子浓度的增大开始呈增长趋势，但当KCl浓度高于0.04mol/L时，萃取效率又有所下降。本实施例最佳条件下的测量结果如下表1所示。

表1：实施例1中最佳条件下的纯化结果

KCl浓度（mol/L）	酶活回收率（AR%）	酶活回收率误差（%）	蛋白质萃取率（EE%）	蛋白质萃取率误差（%）	纯化倍数（PF）	纯化倍数误差（%）
							0.0400	93	2.3459	32.7263	4.5110	2.9	0.0329

由本实施例可见，本发明在萃取纯化木质素过氧化物酶的前萃过程中，LiP粗酶液中的KCl的浓度对萃取纯化效果具有很大影响。

实施例2：

（1）配制反胶束溶液：本实施例的反胶束溶液包括生物表面活性剂、异辛烷和正己醇，其中表面活性剂为鼠李糖脂；配制时将鼠李糖脂经超声振荡培养后溶于体积比为1∶1.2的异辛烷和正己醇混合液中，配制成40mL、浓度为3.0mmol/L的反胶束溶液（即鼠李糖脂-正己醇-异辛烷溶液）。

（2）前萃过程：在500mL锥形瓶中装高压灭菌后的常规液体发酵培养基100mL，接种5×10⁸个黄孢原毛平革菌BKM-F-1767（不限于此菌株，其他的黄孢原毛平革菌菌株均可）孢子到该液体发酵培养基中，38℃温度、180r/min转速下摇床培养8天，用纱布除去所得培养液中的孢子和菌丝，10000rpm/min离心处理10min后即得LiP粗酶液，调节LiP粗酶液的pH值至3.5；取含0.04 mol/L 的KCl溶液的LiP粗酶液5mL与本实施例步骤（1）中配制的反胶束溶液按1∶1.2的体积比混合，磁力搅拌30min，10000rpm/min离心10min后静置分相，留取上层有机相。

（3）后萃过程：将前萃过程中留取的上层有机相与含0.55mol/L KCl溶液的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按1∶1.2的体积比混合，将柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值分别调至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，磁力搅拌30min，10000rpm/min离心10min后静置分相，留取下层水相，得到纯化后的木质素过氧化物酶溶液。

采用紫外分光光度法分别测定所得下层水相中的蛋白质含量和LiP酶活，测量结果如图2所示，测量结果表明，后萃过程中缓冲液的pH值对蛋白质萃取率和LiP酶活回收率的影响非常明显，综合考虑萃取率和纯化倍数，确定最佳pH为6.0。本实施例最佳条件下的测量结果如下表2所示。

表2 ：实施例2中最佳条件下的纯化结果

pH值	酶活回收率（AR%）	酶活回收率误差（%）	蛋白质萃取率（EE%）	蛋白质萃取率误差（%）	纯化倍数（PF）	纯化倍数误差（%）
							6.0	93	1.4255	32.8	2.4840	2.9	0.0101

由本实施例可见，本发明在萃取纯化木质素过氧化物酶的后萃过程中，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值对萃取纯化效果具有很大影响。

聚丙烯酰胺凝胶电泳实验分析测试：

根据实施例1和实施例2中确定的最佳萃取条件进行前萃和后萃实验之后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE电泳）对后萃后所得水相和粗酶液成分进行分析。图3为聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析结果。不连续电泳中分离胶和浓缩胶的质量分数分别为12.5％和5％。第一条为mark，第二条为粗酶液的电泳图谱，第三条为反胶束萃取后水相的电泳图谱。从图3中可以看出，粗酶液的条带分子量有两条，通过反胶束萃取后水相的电泳图谱主要集中在40kDa左右，其中包含了所需要萃取的LiP和少量的杂蛋白。综上我们可以得知，反胶束萃取技术对LiP粗酶液进行了初步的提纯，取得了一定的效果。

以上实施仅用来说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照较佳实施对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种反胶束萃取纯化木质素过氧化物酶的方法，包括以下步骤：

（1）配制反胶束溶液：配制包括生物表面活性剂、异辛烷和正己醇的反胶束溶液，其中所述生物表面活性剂为鼠李糖脂；所述反胶束溶液中鼠李糖脂的浓度为2.75mmol/L～3.0mmol/L；所述反胶束溶液中正己醇与异辛烷的体积比为1∶1～1∶1.2；

（2）前萃过程：将已备好的木质素过氧化物酶粗酶液与所述反胶束溶液混合，搅拌，离心后静置分相，留取上层有机相；前萃过程中，所述木质素过氧化物酶粗酶液的pH值为3.0～3.5，所述木质素过氧化物酶粗酶液中含有浓度为0.04mol/L～0.045mol/L的KCl溶液；所述木质素过氧化物酶粗酶液与所述反胶束溶液是按1∶1～1∶1.2的体积比混合；所述木质素过氧化物酶粗酶液是由黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）经培养发酵后制备得到；

（3）后萃过程：将所述上层有机相与缓冲液混合，搅拌，离心后静置分相，留取下层水相，得到纯化后的木质素过氧化物酶溶液；所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的pH值为6.0～6.5，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中含有浓度为0.5mol/L～0.55mol/L的KCl溶液；所述上层有机相与所述缓冲液是按1∶1～1∶1.2的体积比混合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养发酵的过程具体包括：在高压灭菌后的液体发酵培养基中接种黄孢原毛平革菌孢子，每升所述液体发酵培养基中接种的孢子数为4×10⁸～5×10⁸个，37℃～38℃温度、150r/min～180r/min转速下摇床培养6～8天，除去所得培养液中的孢子和菌丝，离心处理后即得木质素过氧化物酶粗酶液。