CN104531643A

CN104531643A - 从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法

Info

Publication number: CN104531643A
Application number: CN201510028598.XA
Authority: CN
Inventors: 郭霞; 缪枝彤; 万静
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2015-04-22

Abstract

从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，属于生物工程中反胶束萃取技术领域，也涉及菠萝皮的回收利用技术。本发明采用十二烷基三甲基溴化铵作为反胶束主成分对粗酶液进行前萃取，然后再经后萃取、冷冻干燥，得到纯菠萝蛋白酶，在萃取过程中保持了菠萝蛋白酶的活性，减少了菠萝蛋白酶的损失。萃取条件范围广，操作过程简单，提取工艺易于放大，萃取以后，菠萝蛋白酶的萃取效率达到56%，活性回收率达到95%，纯化倍数达到1.7。

Description

从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法

技术领域

本发明属于生物工程中反胶束萃取技术领域，也涉及菠萝皮的回收利用技术。

背景技术

近年来，科学家们利用表面活性剂在溶液中形成的各种分子有序组合体（如胶束、反胶束、微乳液、液晶以及囊泡等）作为反应介质或模板，有效地对纳米粒子的大小和形貌进行调控，其中作为微反应器的反胶束是在非极性溶剂中形成的，它特殊的纳米空间——“水池”能将一些亲水性的物质，如酶和蛋白质等增溶于其中，为它们提供一个特殊的微环境。

　菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，广泛存在于菠萝的果实、芽、叶、茎中，分子量为33000，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺。它水解蛋白的活性较木瓜蛋白酶高十倍以上，因此可广泛应用于食品、医药和化工领域。譬如在生物化工中可将其用于干酪、明胶、水解蛋白的生产，在食品工业中将其作为一种食品添加剂，可使肉质嫩化、啤酒澄清；在医药工业中，由于它能在生物体内溶解纤维蛋白和血凝块，因此可以治疗水肿及多种炎症，并使患处迅速溶痂，此外，菠萝蛋白酶对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。

目前，用于工业化生产、提取菠萝蛋白酶的方法主要有三种：高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法；但这三种方法不仅生产成本高昂、易造成环境污染、生产工艺和操作复杂，而且所得酶活性也不足以满足医药级别及食品中对酶活性要求较高的应用。

另一方面，我国虽然菠萝资源丰富，年产量在140万吨以上，而在用于加工菠萝罐头、果汁等食品上，采用的完全是菠萝果肉部分，剩下的菠萝皮、菠萝茎等部分就被作为废弃物而扔掉，这样不仅造成了资源的浪费，而且也污染环境。

鉴于反胶束的独特结构及其对酶的功能或者活性影响较小等特点，CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)/异辛烷/正丁醇/正己醇反胶束曾被用来从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶，但表面活性剂CTAB用量较大，为0.055g/mL，可实际应用的萃取条件窄，所得菠萝蛋白酶的萃取效率和活性回收率较低，最佳萃取条件下，萃取效率和活性回收率分别为40%和78%。

发明内容

本发明目的是提出一种从废弃的菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，以提高菠萝产业的增值。

本发明包括以下步骤：

1）制备菠萝蛋白酶粗提液：将干净的菠萝皮与pH值为6.0 的磷酸缓冲溶液混合于粉粹机中粉粹，4℃下离心，取上清液，即粗酶液；

2）前萃取：将NaCl、NaBr或KBr含量为0.05~0.25 M、pH值为8.0～12的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液与粗酶液混合后再与反胶束以等体积比混合振荡后，经离心分离取上层有机相；所述反胶束由十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）、正己烷、正己醇和水混合组成；十二烷基三甲基溴化铵在反胶束中的浓度为0.008g/ml～0.025g/ml；

3）后萃取：将KBr、NaBr或NaCl浓度为0.25~1.5M 、pH值为4.2～6.0的HAC-NaAC缓冲液或pH值为 5.0～8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液与有机相等体积比混合振荡后，经离心分离取下层水相；

4）冷冻干燥：将下层水相在压强为50±2Pa、温度为-60℃～-55℃下冷冻干燥，得到纯菠萝蛋白酶。

本发明前萃取是用反胶束萃取菠萝蛋白酶粗提液，使菠萝蛋白酶进入反胶束中，离心分离后取有机相；后萃取是用后萃液（亦称反提取剂）萃取有机相，使反胶束中的菠萝蛋白酶从反胶束转移到水相中，离心分离后得到菠萝蛋白酶溶液。

本发明充分利用了废弃的菠萝皮，不但可以改善环境，同时也可提高菠萝产业的增值。本发明突破传统提取和分离菠萝蛋白酶的方法，实现从菠萝皮中高效提取菠萝蛋白酶，保持菠萝蛋白酶的活性，减少菠萝蛋白酶的损失，提高菠萝废弃物的综合利用，加快菠萝及其蛋白酶产业的发展。

本发明采用单链的十二烷基三甲基溴化铵作为反胶束主成分，其用量小，十二烷基三甲基溴化铵在反胶束中的浓度只占0.008g/ml～0.025g/ml，不但能减少对菠萝蛋白酶的污染，还可使菠萝蛋白酶的提取效应达到最佳；萃取分离以后，反胶束相与水相分层明显，在萃取过程中保持了菠萝蛋白酶的活性，减少了菠萝蛋白酶的损失。萃取条件范围广，操作过程简单，提取工艺易于放大，萃取以后，菠萝蛋白酶的萃取效率达到56%，活性回收率达到95%，纯化倍数达到1.7。

另外，本发明十二烷基三甲基溴化铵在所述反胶束中的浓度为0.015g/ml～0.025g/ml。在此条件下的菠萝蛋白酶萃取效率、活性回收率和纯化倍数达到实际生产的较佳要求。

本发明反胶束中的助溶剂正己醇的存在一方面是为了配置得到稳定的反胶束，另一方面可调控反胶束的体积和表面活性剂与酶的相互作用，从而促使酶由水相转移至反胶束相。优选的正己醇占正己烷和正己醇混合总体积的9.5～11.1%。

本发明所述pH值为6.0 的磷酸缓冲溶液中包含5 mmol/L 的乙二胺四乙酸二钠（EDTA），磷酸缓冲溶液的浓度为0.04mol/L。乙二胺四乙酸二钠（EDTA）具有活性保护剂和抗氧化剂的作用，可保持菠萝蛋白酶的活性。

为了有利于菠萝蛋白酶从菠萝皮中被浸提出来，并可保持菠萝皮中菠萝蛋白酶的活性，防止菠萝蛋白酶的自身水解作用，通常磷酸缓冲溶液与菠萝皮的混合质量比为1:1。

所述前萃取中甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值为9.0～11。菠萝皮中菠萝蛋白酶的等电点为9.5，当水相pH 值大于酶的等电点时，酶所带电荷与反胶束内表面所带电荷相反。酶和表面活性剂之间的静电吸引作用可使酶萃取到反胶束中。水相pH 值也决定了酶表面可电离基团的离子化程度。水相pH值越高，目标酶所带负电荷越多，它和阳离子表面活性剂之间的静电吸引作用就越强，有利于酶的前萃取。因此为了提高菠萝蛋白酶最佳的萃取效率和活性回收率，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值为9.0～11。

适量盐的存在可减少表面活性剂头基间的静电斥力，增强酶与表面活性剂头基之间的相互作用。但盐的浓度过大，则会屏蔽表面活性剂和酶之间的静电作用，不利于酶的提取。本发明在前萃取中，NaCl、NaBr或KBr在pH值为8.0～12的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的浓度为0.1 M。该离子强度对萃取效率、活性回收率和纯化倍数的提高都具有较好的贡献。

前萃取中，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和粗酶液的混合体积比为24～50:1。待提取粗酶液中酶的含量也是决定反胶束提取效应的一个重要因素。经研究发现在该条件下，菠萝蛋白酶可表现良好的活性回收率和萃取效率。

为了提高萃取效率、活性回收率及纯化倍数，后萃取中，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值优选为 6.0～8.0。后萃取中，当pH值小于酶的等电点时，表面活性剂与酶相互排斥，促使酶从反胶束内核中排出。因此缓冲液的pH值一定要小于菠萝蛋白酶的等电点9.5。并且后萃取中，KBr或NaBr l浓度优选为0.5M。

后萃取中，优选pH值为4.2～5.0的HAC-NaAC缓冲液，其中KBr或NaBr浓度为0.5～1.0M，或采用pH值为4.2～5.0的HAC-NaAC缓冲液中NaCl浓度为0.25M两种方案都利于提高菠萝蛋白酶萃取效率、活性回收率及纯化倍数。

本发明在后萃取中，HAC-NaAC缓冲液的pH值优选为4.2，菠萝蛋白酶萃取效率、活性回收率及纯化倍数可达到最大值。

附图说明

图1为菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率、纯化倍数与表面活性剂DTAB浓度的变化关系图。

图2为菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率、纯化倍数与前萃取时甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH值的变化关系图。

图3为菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率、纯化倍数与后萃取时HAC-NaAC缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值的变化关系图。

图4为菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率、纯化倍数与反胶束中正己醇占正己烷和正己醇混合比的变化关系图。

图5为菠萝蛋白酶萃取效率与前萃取时加入的三种盐浓度的变化关系图。

图6为菠萝蛋白酶活性回收率与前萃取时加入的三种盐浓度的变化关系图。

图7为菠萝蛋白酶纯化倍数与前萃取时加入的三种盐浓度的变化关系图。

图8为菠萝蛋白酶萃取效率与后萃取时加入的三种盐浓度的变化关系图。

图9为菠萝蛋白酶活性回收率与后萃取时加入的三种盐浓度的变化关系图。

图10为菠萝蛋白酶纯化倍数与后萃取时加入的三种盐浓度的变化关系图。

图11为菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率、纯化倍数与菠萝蛋白酶粗提液稀释倍数的变化关系图。

具体实施方式

一、分离纯化工艺：

1、反胶束配制：

称取一定量的十二烷基三甲基溴化铵（DTAB），并加入到按体积比11:1～4:1混合的正己烷和正己醇的混合体系中，按ω₀（表面活性剂分子和水分子的摩尔比）=20:1加入蒸馏水，然后用振荡器充分振荡至得到澄清透明的溶液，此即为反胶束。

以此配成各反胶束中DTAB占比分别为0.003g/ml～0.035g/ml，且，正己醇占正己烷和正己醇混合体积百分数8.3%～20%。

2、酶粗液的提取：

a.预处理：将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于-20℃冷冻保存备用。

b.粗酶液的抽提：解冻原料——菠萝皮后，将菠萝皮与相同质量的0.04mol/L、pH6.0 磷酸（含 5 mmol/L 的乙二胺四乙酸二钠（EDTA））缓冲溶液置于粉粹机中粉粹；之后用四层纱布挤压进行渣汁分离，得到的粗滤液在 4℃下 10000rpm 离心 25min后，取上清液，即粗酶液。

3、前萃取：

按常规方法，用甘氨酸和氢氧化钠配置50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH值范围为8.0～12。再加入NaCl、NaBr或KBr，使甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的NaCl、NaBr或KBr浓度为0～0.35M后，再以体积比10:1～50:1的比例加入粗酶液。

再将上述混合溶液与反胶束等体积混合，充分振荡15min，在25℃，14000rpm下离心45min，得到两相，上层为反胶束相，下层为水相。

4、后萃取：

后萃液配置：按常规方法，用醋酸和醋酸钠配置10mM HAC-NaAC缓冲液，pH值范围为3.6～6.0；或用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配置10mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH值范围为5.0～8.0。或用NaCl、NaBr或KBr使HAC-NaAC缓冲液中的NaCl、NaBr或KBr浓度为0.25～2.0M。或用NaCl、NaBr或KBr使磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中的NaCl、NaBr或KBr浓度为0.25～2.0M。

然后，再将后萃液按体积比为1:1加入步骤3中分离所得的有机相中，充分振荡15min，然后在25℃，14000 rpm下离心35 min，得到两相，取下层水相，即菠萝蛋白酶溶液。

5、冷冻干燥

将步骤4所得的菠萝蛋白酶溶液，在压强为50±2Pa、温度为-60℃～-55℃下冷冻干燥36±2 h，得到纯菠萝蛋白酶。

二、对比实验：

1、反胶束中表面活性剂十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）的浓度对提纯工艺的影响试验：

按以上工艺步骤进行各试验，其中：V正己烷:V正己醇 = 9:1；前萃取水相的pH = 10.5；后萃取水相的pH= 4.2。改变十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）在反胶束中占比，分别为0.003g/ml、0.005g/ml 、0.008g/ml 、0.01g/ml 、0.015g/ml 、0.02g/ml 、0.025g/ml 、0.03g/ml 、0.035g/ml。

从图1可见：当十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）在反胶束中的浓度为0.025g/mL时，菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率达到最大值；当十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）在反胶束中的浓度为0.008g/mL时，菠萝蛋白酶的纯化倍数达到最大值。

2、前萃取时甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值对菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率的影响试验：

按以上工艺步骤进行各试验，其中：V正己烷: V正己醇 = 9:1，后萃取水相pH值取4.2。仅改变前萃取时甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值，分别取8.0、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12。

从图2可见：前萃取时，当甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值为10.5时，菠萝蛋白酶萃取效率、活性回收率及纯化倍数达到最大值。

3、后萃取时HAC-NaAC缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值对菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率的影响试验：

按以上工艺步骤进行各试验，其中：V正己烷:V正己醇 = 9:1，前萃取水相: pH = 10.5。仅改变后萃取时HAC-NaAC缓冲液的pH值，分别取3.6、4.2、5，或改变磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值，分别取6、7、8。

从图3可见：当HAC-NaAC缓冲液的pH值为4.2时，菠萝蛋白酶萃取效率、活性回收率及纯化倍数达到最大值。当磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值为6、7、8时略次。

4、反胶束中正己醇占正己烷和正己醇混合比对菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率的影响试验：

按以上工艺步骤进行各试验，其中：前萃取水相 pH = 10.5；后萃取水相:pH = 4.2。仅改变反胶中正己醇占正己烷和正己醇混合总体积的百分数，分别取8.3%、8.7%、9.1%、9.5%、10%、11.1%、12.5 %、14.3%、16.7%、20%。

从图4可见：当反胶束中正己醇占正己烷和正己醇混合总体积比为10%和11.1%时，菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率达到最大值。

当反胶束中正己醇占正己烷和正己醇混合总体积比为9.5%时，菠萝蛋白酶的纯化倍数达到最大值。

5、前萃取时NaCl、KBr和NaBr在缓冲液中的浓度对萃取效率、活性回收率、纯化倍数的影响试验：

按以上工艺步骤进行各试验，其中：V正己烷: V正己醇 = 9:1，前萃取水相:pH = 10.5，后萃取水相 pH = 4.2。采用加入不同量的NaCl、NaBr或KBr的方法改变甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中NaCl、NaBr或KBr的浓度，分别取0、0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M。

从图5可见：当NaCl、NaBr或KBr在缓冲液中的浓度为0.1M时，菠萝蛋白酶的萃取效率达到最大值；且加入NaCl的萃取效果比加入KBr和NaBr更好。

从图6可见：当NaCl、NaBr或KBr在缓冲液中的浓度为0.1M时，菠萝蛋白酶的活性回收率达到最大值；且加入NaCl后菠萝蛋白酶的活性回收率比加入KBr和NaBr更好。

从图7可见：当NaCl、NaBr或KBr在缓冲液中的浓度为0.1M时，菠萝蛋白酶的纯化倍数达到最大值；且加入NaCl的浓度为0.1、0.15、0.2M的菠萝蛋白酶的纯化倍数比加入KBr和NaBr更好。

6、后萃取时NaCl、KBr和NaBr在HAC-NaAC缓冲液中的浓度对萃取效率、活性回收率、纯化倍数的影响试验：

按以上工艺步骤进行各试验，其中：前萃取水相 pH = 10.5；后萃取水相pH = 4.2。采用加入NaCl、NaBr或KBr的方法改变HAC-NaAC缓冲液中NaCl、KBr和NaBr的浓度，分别取0.25M、0.5M、1.0M、1.5M、2.0M。

从图8可见：当KBr、NaBr在HAC-NaAC缓冲液中的浓度为0.5M时，菠萝蛋白酶萃取效率达到最大值；当NaCl在HAC-NaAC缓冲液中的浓度为0.25M时，菠萝蛋白酶萃取效率达到最大值；且加入KBr、NaBr的萃取效果比加入NaCl更好。

从图9可见：当KBr、NaBr在HAC-NaAC缓冲液中的浓度为0.5M时，菠萝蛋白酶活性回收率达到最大值；当NaCl在HAC-NaAC缓冲液中的浓度为0.25M时，菠萝蛋白酶活性回收率达到最大值；且加入KBr、NaBr的菠萝蛋白酶的活性回收率比加入NaCl更好。

从图10可见：当KBr、NaBr在HAC-NaAC缓冲液中的浓度为0.5M时，菠萝蛋白酶纯化倍数达到最大值；当NaCl在HAC-NaAC缓冲液中的浓度为0.25M时，菠萝蛋白酶纯化倍数达到最大值；且当KBr、NaBr在HAC-NaAC缓冲液中的浓度为0.5、1.0M时，菠萝蛋白酶的纯化倍数比加入NaCl更好。

另外，通过试验，还发现后萃取时，在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值为 6.0～8.0、KBr或NaBrl浓度为0.5M的条件下，萃取效率以及活性回收率、纯化倍数都比较理想。

7、前萃取时甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和粗酶液的混合体积比与萃取效率以及活性回收率、纯化倍数的影响：

按以上工艺步骤进行各试验，其中：前萃取水相 pH = 10.5；后萃取水相 pH = 4.2。

仅改变粗酶液和甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的体积比（即稀释倍数），分别取：10、12、13、15、16、18、19、20、22、24、25、27、30、35、40、45、50。

从图11可见：当菠萝蛋白酶稀释倍数为24～50时，菠萝蛋白酶萃取效率以及活性回收率、纯化倍数达到最大值。

另附，本发明菠萝蛋白酶的萃取效率（EF）、活性回收率（AR）和纯化倍数（PF）计算公式如下；

通过以上试验得到DTAB反胶束萃取菠萝蛋白酶的最佳条件以及最佳萃取效率、活性回收率和纯化倍数，如下表：

表面活性剂名称

表面活性剂浓度

前萃取水相pH值

前萃取水相NaCl浓度

后萃取水相pH值

后萃取水相KBr浓度

萃取效率

活性回收率

纯化倍数

DTAB

0.025g/mL

10.5

0.1M

4.2

0.5M

56%

95%

1.7

Claims

1.从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，包括将干净的菠萝皮与pH值为6.0 的磷酸缓冲溶液混合粉粹后，4℃下离心，取得粗酶液；将粗酶液与甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和反胶束混合进行前萃取，再将前萃取取得的上层有机相与HAC-NaAC缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液混合进行后萃取，最后将后萃取取得的下层水相冷冻干燥，得到纯菠萝蛋白酶；其特征在于：

所述反胶束由十二烷基三甲基溴化铵和正己烷、正己醇、水混合组成，所述十二烷基三甲基溴化铵在反胶束中的浓度为0.008g/ml～0.025g/ml；

所述前萃取是将NaCl、NaBr或KBr浓度为0.05～0.25 M、pH值为8.0～12的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液与粗酶液混合后再与反胶束以等体积比混合振荡后，经离心分离取上层有机相；

所述后萃取是将KBr、NaBr或NaCl浓度为0.25～1.5M 、pH值为4.2～6.0的HAC-NaAC缓冲液或pH值为 5.0～8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液与有机相等体积比混合振荡后，经离心分离取下层水相；

所述冷冻干燥是将下层水相在压强为50±2Pa、温度为-60℃～-55℃下冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于十二烷基三甲基溴化铵在所述反胶束中的浓度为0.015g/ml～0.025g/ml。

3.根据权利要求1所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述反胶束中，正己醇占正己烷和正己醇混合总体积的9.5～11.1%。

4.根据权利要求1所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述pH值为6.0 的磷酸缓冲溶液中包含5 mmol/L 的乙二胺四乙酸二钠，磷酸缓冲溶液的浓度为0.04mol/L。

5.根据权利要求1所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述前萃取中甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值为9.0～11。

6.根据权利要求1或5所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述前萃取中，NaCl、NaBr或KBr含量为0.1 M。

7.根据权利要求1或5所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述前萃取中，所述甘氨酸-氢氧化钠缓冲液和粗酶液的混合体积比为24～50:1。

8.根据权利要求1所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述后萃取中，所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH值为 6.0～8.0，KBr或NaBr浓度为0.5M。

9.根据权利要求1所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述后萃取中，所述HAC-NaAC缓冲液的pH值为4.2～5.0，HAC-NaAC缓冲液中的KBr或NaBr浓度为0.5～1.0M，或所述HAC-NaAC缓冲液中NaCl浓度为0.25M。

10.根据权利要求9所述从菠萝皮中分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于所述后萃取中，HAC-NaAC缓冲液的pH值为4.2。