CN105734025A - 利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法，属于生物工程中酶催化剂的制备技术领域。本发明包括多酚氧化酶（PPO）粗酶液的提取，其特征在于：在十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）存在的条件下，以多酚氧化酶为催化剂进行催化反应。本发明利用十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基溴化铵来提高苹果中PPO的活性。

Description

利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法
技术领域
本发明属于生物工程中酶催化剂的制备技术领域。
背景技术
近年来，研究人员通过酶催化反应探究各种酶作用机理，不仅能揭开生物催化过程的奥秒，也能为人类利用其中某些原理来研究开发新型高效催化剂奠定科学基础。
多酚氧化酶是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物中，能够将酚或多酚氧化成对应的醌。其在食品、医药及环保行业有着广泛应用，研究其活性可以更好地解决食物储存、植物抵抗病原体及病毒侵害、含酚类有机物工业废水的生物降解等问题
目前，研究人员多数研究提纯后的多酚氧化酶，包括探究酶的最佳活性条件，表面活性剂（十二烷基硫酸钠（SDS））对酶活性的激发，达到酶活性提高至最高的目的。但是提纯后，酚类化合物含量减少以及多酚氧化酶（PPO）处于束缚状态可能会对酶活性有影响。
PPO大量存在于植物中，其中苹果中含量丰富，我国苹果种植面积和产量均占世界总量的40%以上，但从苹果中提取的PPO活性较低。
发明内容
本发明目的是提出一种以提高PPO活性为目的，利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法。
本发明包括多酚氧化酶（PPO）粗酶液的提取，其特征在于：在十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）存在的条件下，以多酚氧化酶为催化剂进行催化反应。
本发明利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）来提高苹果中PPO的活性。
进一步地，所述CTAB在混合体系中的浓度为0.3mM、溶解邻苯二酚的磷酸盐缓冲溶液pH为7时，或在所述DTAB在混合体系中的浓度为15mM、溶解邻苯二酚的磷酸盐缓冲溶液pH为8.0时，PPO的活性最强。
所述酶催化反应在温度为30℃～50℃条件下进行。
使用CTAB时，当CTAB浓度为0.3mM、溶解邻苯二酚的磷酸盐缓冲溶液pH为7时，PPO酶活性可提高75%左右。使用DTAB时，当DTAB浓度为15mM、粗酶活性可提高40%。
附图说明
图1为不同浓度的CTAB与PPO活性的关系图。
图2为不同浓度的DTAB与PPO活性的关系图。
图3为在不同pH值下不同表面活性剂与PPO活性的对比关系图。
图4为在不同温度下不同表面活性剂与PPO活性的关系图。
图5为在不同离子强度下不同表面活性剂与PPO活性的关系图。
图6为不同浓度的CTAB与酶促反应最大反应速率的关系图。
图7为不同浓度的CTAB与酶促反应米氏常数的关系图。
图8为不同浓度的CTAB与酶促反应最大反应速率的关系图。
图9为不同浓度的CTAB与酶促反应米氏常数的关系图。
具体实施方式
一、多酚氧化酶粗酶液的制取：
1、预处理：将苹果在蒸馏水中洗净，擦干，置于-20℃冷冻保存（大于12h）。
2、粗酶液的抽提：称取58.82g经过处理的苹果，置于100mL磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH6.5)中，用搅拌机打浆，之后用四层纱布挤压进行过滤，得到的粗滤液在4℃下10000rpm离心10min，取上清液，即PPO粗酶液，备用。
二、邻苯二酚溶液配制：在磷酸盐缓冲溶液（0.1M，pH7）中配制300mM邻苯二酚溶液。
三、表面活性剂溶液的配制：
在去离子水中分别配制25mMCTAB和60mMDTAB溶液。
四、以邻苯二酚为底物进行酶催化反应试验，并以紫外分光光度计分别测定PPO酶的活性：
无CTAB或DTAB的对比试验一：用移液枪量取12.5μL蒸馏水稀释25倍粗酶后，与93.4μL邻苯二酚溶液及81.6μL蒸馏水混合，使邻苯二酚氧化成醌类化合物，于420nm处检测吸光度值随时间的变化。
采用CTAB或DTAB的平行试验二：用移液枪量取12.5μL蒸馏水稀释25倍粗酶后，与93.4μL邻苯二酚溶液及不同浓度的表面活性剂溶液混合，使邻苯二酚氧化成醌类化合物，于420nm处检测吸光度值随时间的变化。
五、实验结果分析：
1、表面活性剂浓度对PPO粗酶活性的影响：
（1）不同浓度的CTAB对PPO粗酶活性的影响：
在T=303.15K、50mM磷酸盐缓冲溶液、pH为7的条件下，分别采用浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.4、0.7、0.8、0.9和1.0mM的CTAB为表面活性剂，进行多组平行试验，分别测得CTAB的浓度对PPO活性的影响。
如图1所示，当CTAB的浓度为0.3mM的条件下，PPO活性最强。
（2）不同浓度的DTAB对PPO粗酶活性的影响：
在T=303.15K、50mM磷酸盐缓冲溶液、pH为7的条件下，分别采用浓度为0、2、13、14、15、16、18和20mM的DTAB为表面活性剂，进行多组平行试验，分别测得DTAB的浓度对PPO活性的影响。
结果如图2所示，DTAB最佳浓度为15mM。
2、pH值对PPO活性的影响：
在T=303.15K、50mM磷酸盐缓冲溶液不变的条件下，不采用表面活性剂、分别采用浓度为0.3mM的CTAB和浓度为15mM的DTAB，测试粗酶及存在两种不同的表面活性剂在不同pH值下对PPO活性的影响。
如图3所示，pH为7的条件下CTAB对PPO活性的影响最大；pH值为8.0的条件下DTAB对PPO活性的影响最大。
3、温度对PPO活性的影响：
在T=303.15K、50mM磷酸盐缓冲溶液、pH为7的条件下，粗酶及分别加入浓度为0.3mM的CTAB和浓度为15mM的DTAB，在不同温度条件下进行平行试验，分别测得温度对PPO活性的影响。
如图4所示，粗酶活性最佳温度为30℃和50℃，加入DTAB及CTAB后，酶活显著提升且在高温处也能保持较好活性。
4、离子强度对PPO活性的影响：
在T=303.15K、50mM磷酸盐缓冲溶液、pH为7的条件下，粗酶及分别加入浓度为0.3mM的CTAB和浓度为15mM的DTAB，在不同NaCl离子强度条件下进行平行试验，分别试得NaCl离子强度对PPO活性的影响。
从如图5可见：随着离子强度的增加，酶活越高，接着达到一个平台，当处于一定离子强度时，CTAB对酶活有较高提升，而DTAB对酶活改变不大。
5、表面活性剂对PPO动力学参数的影响：
在T=303.15K、50mM磷酸盐缓冲溶液、pH为7、NaCl离子强度为1.5M的条件下，采用不同的CTAB浓度，测得不同浓度的CTAB对PPO反应动力学参数的影响。
如图6、7所示，加入不同浓度的CTAB对PPO的米氏常数改变不大，而最大反应速度有一定改变。
在T=303.15K、50mM磷酸盐缓冲溶液、pH为7、NaCl离子强度为1.5M的条件下，采用不同的DTAB浓度，测得不同浓度的DTAB对PPO反应动力学参数的影响。
如图8、9所示，不同浓度的DTAB对最大反应速率改变不大，而2mM处米氏常数有很大的改变。

Claims (4)

1.利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法，包括多酚氧化酶粗酶液的提取，其特征在于：在十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基三甲基溴化铵存在的条件下，以多酚氧化酶为催化剂进行催化反应。
2.根据权利要求1所述利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法，其特征在于：所述十六烷基三甲基溴化铵在混合体系中的浓度为0.3mM、溶解邻苯二酚的磷酸盐缓冲溶液pH为7。
3.根据权利要求1所述利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法，其特征在于：所述十二烷基三甲基溴化铵在混合体系中的浓度为15mM、溶解邻苯二酚的磷酸盐缓冲溶液pH为8.0。
4.根据权利要求1或2或3所述利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法，其特征在于：所述催化反应在温度为30℃～50℃条件下进行。
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