CN108559770B - 杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性中的应用 - Google Patents
杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性中的应用，属于生物酶技术领域。杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用。4‑磺酸基杯[4]芳烃、4‑磺酸基杯[6]芳烃或4‑磺酸基杯[8]芳烃在抑制菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用。杯[4]芳烃季铵盐在增强菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用。对BM酶活性影响受杯芳烃衍生物浓度影响不大，跟空腔大小和电荷正负有关；对PPO酶活性影响受杯芳烃衍生物浓度影响较大，可以通过控制体系中杯芳烃衍生物浓度，来调控酶活性大小，对酶活性的调控范围较广。
Description
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，具体涉及杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶 和多酚氧化酶活性中的应用。
背景技术
杯芳烃是指由亚甲基桥连苯酚单元所构成的大环化合物，1942年金克 (Zinke，奥地利)首次合成得到，因其结构像一个酒杯而被古奇(C.D.Gutscht， 美国)称为杯芳烃。绝大多数的杯芳烃熔点较高，在250℃以上。在常用的有机 溶剂中的溶解度很小，几乎不溶于水。杯芳烃具有大小可调节的"空腔"，能够 形成主-客复合物，与环糊精、冠醚相比，是一类更具广泛适应性的模拟酶， 被称为继冠醚和环糊精之后的第三代主体化合物。
迄今为止，第三代超分子杯芳烃的应用，主要作为离子载体，作离子交 换剂、相转移催化剂及作为涂料、黏合剂等的组分，同时杯芳烃在蛋白质识 别、蛋白质组装方面的应用越来越有吸引力。如今功能化的杯[4]芳烃已经用 于溶液中固定游离的α-淀粉酶，从而可以更好的对α-淀粉酶活性进行调控，杯 [4]芳烃酰胺衍生物可以识别宫颈癌(HeLa)细胞中蛋白质二硫键异构酶，并 且二者可以发生相互作用，杯[4]芳烃酰胺衍生物可以抑制蛋白质二硫键异构 酶的活性，从而对宫颈癌可以进行靶向的药物治疗。然而由于杯芳烃具有独 特的空穴结构，且具有较大的调节自由度及合成简单易于商品化，同时杯芳 烃易于发生取代或衍化反应，得到的衍生物种类丰富且性质稳定等特点，使 开发挖掘研究杯芳烃的新应用成为一种重要的研究方向。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供杯芳烃衍生物的新应用，具体是杯芳 烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性中的应用，杯芳烃衍生物作为 酶活性调节剂有效调控菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性变化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化酶 (PPO)活性中的应用。
优选的，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[4]芳烃、4-磺酸基杯[6]芳烃或 4-磺酸基杯[8]芳烃。
优选的，所述杯芳烃衍生物在抑制菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的 应用。
优选的，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[4]芳烃时，所述4-磺酸基杯[4] 芳烃在抑制菠萝蛋白酶活性中的有效浓度不低于0.01mg/ml；所述4-磺酸基杯 [4]芳烃在抑制多酚氧化酶活性中的有效浓度不低于0.2mg/ml。
优选的，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[6]芳烃时，所述4-磺酸基杯[6] 芳烃在抑制菠萝蛋白酶活性中的有效浓度不低于0.01mg/ml；所述4-磺酸基杯 [6]芳烃在抑制多酚氧化酶活性中的有效浓度不低于0.1mg/ml。
优选的，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[8]芳烃时，所述4-磺酸基杯[8] 芳烃在抑制菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的有效浓度不低于0.01mg/ml。
优选的，所述杯芳烃衍生物为杯[4]芳烃季铵盐。
优选的，所述杯[4]芳烃季铵盐在增强菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中 的应用。
优选的，所述杯[4]芳烃季铵盐的有效浓度不低于0.02mg/ml。
优选的，所述应用为：所述菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶先与杯芳烃衍生 物混合，再催化底物。
本发明提供了杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的 应用。杯芳烃衍生物中存在空腔结构和正负电荷直接导致菠萝蛋白酶和/或多 酚氧化酶的酶活性发生变化。所述杯芳烃衍生物对多酚氧化酶的酶活性抑制 率达到24％以上，所述杯芳烃衍生物对菠萝蛋白酶的酶活性抑制率达到54％ 以上，所述杯芳烃衍生物对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性的增高率达到 31％以上。
进一步的，本发明提供的杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和/或多酚氧化 酶活性中的应用中，具体优选限定了杯芳烃衍生物的调控浓度，使所述4-磺 酸基杯[4]芳烃、4-磺酸基杯[6]芳烃或4-磺酸基杯[8]芳烃对多酚氧化酶的酶活 性抑制率达到100％，所述杯芳烃衍生物对菠萝蛋白酶的酶活性抑制率达到 90％，所述杯[4]芳烃季铵盐对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性的增高率达到 138％。
附图说明
图1为杯芳烃衍生物的浓度对菠萝粗提液中BM和PPO酶活性的影响；
图2为季铵盐杯芳烃的合成线路；
图3为合成的季铵盐杯芳烃的1HNMR谱图。
具体实施方式
本发明提供了杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化酶 (PPO)活性中的应用。
在本发明中，所述应用包括以下步骤：
1)将杯芳烃衍生物与菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化酶混合，得到混 合酶液；
2)将所述步骤2)中混合酶液与相对应的底物混合进行催化反应，得到 催化酶活力；
3)计算酶活力的变化情况。
在本发明中，所述杯芳烃衍生物优选包括4-磺酸基杯[4]芳烃、4-磺酸基 杯[6]芳烃或4-磺酸基杯[8]芳烃。所述杯芳烃衍生物优选在抑制菠萝蛋白酶和 /或多酚氧化酶活性中的应用。本发明对4-磺酸基杯[4]芳烃、4-磺酸基杯[6]芳 烃或4-磺酸基杯[8]芳烃的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的 4-磺酸基杯[4]芳烃、4-磺酸基杯[6]芳烃或4-磺酸基杯[8]芳烃即可。所述在本 发明实施例中，所述4-磺酸基杯[4]芳烃、4-磺酸基杯[6]芳烃或4-磺酸基杯[8] 芳烃的来源购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。
在本发明中，4-磺酸基杯[n]芳烃(n＝4,6,8)的结构如式I所示：
在本发明中，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[4]芳烃(4-SC[4])时，所 述4-磺酸基杯[4]芳烃在抑制菠萝蛋白酶活性中的有效浓度优选不低于 0.01mg/ml，更优选为0.1～0.8mg/ml，最优选为0.2mg/ml。所述4-磺酸基杯[4] 芳烃在抑制多酚氧化酶活性中的有效浓度优选不低于0.2mg/ml，更优选为 0.3～0.8mg/ml，更优选为0.4mg/ml。所述杯芳烃衍生物的溶剂优选为蒸馏水。
在本发明中，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[6]芳烃(4-SC[6])时，所 述4-磺酸基杯[6]芳烃在抑制菠萝蛋白酶活性中的有效浓度优选不低于 0.01mg/ml，更优选为0.1～0.8mg/ml，最优选为0.2mg/ml。所述4-磺酸基杯[6] 芳烃在抑制多酚氧化酶活性中的有效浓度优选不低于0.1mg/ml，更优选为 0.2～0.8mg/ml，更优选为0.4mg/ml。
在本发明中，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[8]芳烃(4-SC[8])时，所 述4-磺酸基杯[8]芳烃在抑制菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的有效浓度优 选不低于0.01mg/ml，更优选为0.1～0.8mg/ml，最优选为0.2mg/ml。
对于阴离子型的4-SC[n](n＝4,6或8)而言，在杯芳烃衍生物有效浓度 较低时，随着空腔的增大，对BM和PPO两种酶的酶活性的抑制效果更明显。 这是由于空腔越大，酶分子被包裹进去的部位越多，使得酶跟底物接触的越 少，从而使得酶活性更低。对于BM粗酶而言，4-SC[n](n＝4,6或8)对酶的 抑制程度不受杯芳烃有效浓度增加的影响，4-SC[n](n＝4,6或8)对酶活力的 抑制率变化不大；而杯芳烃有效浓度改变对PPO粗酶活性影响不同，随着浓 度的增加，抑制效果更加明显。
在本发明中，所述杯芳烃衍生物优选为杯[4]芳烃季铵盐。所述杯[4]芳烃 季铵盐按照图2的合成方式进行合成得到。合成的杯[4]芳烃季铵盐的1HNMR 谱图如图3。合成的杯[4]芳烃季铵盐的结构式如式Ⅱ所示：
所述杯芳烃衍生物优选在增强菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应 用。所述杯[4]芳烃季铵盐的浓度优选不低于0.02mg/ml，更优选为 0.04～0.08mg/ml，最优选为0.06mg/ml。本发明对所述杯[4]芳烃季铵盐的来源 没有特殊限制，采用本领域所熟知的杯[4]芳烃季铵盐即可。在本发明中，所 述菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟 知的酶来源即可。在本发明实施例中，所述菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化 酶为从菠萝中提取得到粗酶液。所述提取方法优选包括以下步骤：
A、将菠萝块置于缓冲溶液中，榨汁，得到榨汁浆液；
B、将所述榨汁浆液固液分离，得到的上清液为含有菠萝蛋白酶(BM) 和多酚氧化酶(PPO)的粗酶液。
在本发明中，所述缓冲液为含2.93mg/mL浓度的乙二胺四乙酸二钠 (EDTA·2Na)的磷酸盐缓冲液。所述缓冲液的浓度为40mmol/L，所述缓冲液 的pH值为6.0。
所述菠萝块的质量和缓冲溶液的体积优选为20～25g：24ml，更优选为 24.3g：24ml。
在本发明中，所述固液分离的方法优选现用四层纱布过滤，得到的滤液 经过离心分离，收集上清液。所述离心的速度优选为8000～12000rpm。所述 离心的时间优选为20～30min，更优选为25min。所述离心的温度优选4℃。
在本发明中，对于BM而言，杯芳烃与粗酶液体积比为3.75～300:56.25； 对于PPO而言，杯芳烃与粗酶液体积比为4.69～375:62.5。所述菠萝蛋白酶 (BM)和/或多酚氧化酶的浓度为稀释倍数为25倍的粗酶液。
在本发明中，所述催化反应采用常规的菠萝蛋白酶(BM)和多酚氧化酶 的催化反应进行。所述菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化酶的酶活力的测定采 用常规方法进行测定。
所述抑制率＝1-(添加杯芳烃衍生物得到的酶活力/对照组酶活力)*100％
所述提高率＝(添加杯芳烃衍生物得到的酶活力/对照组酶活力) *100％-100％
下面结合实施例对本发明提供的杯芳烃及其衍生物在调控菠萝蛋白酶和 多酚氧化酶活性中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明 保护范围的限定。
实施例1
(1)粗酶液的制备
将菠萝去皮切块，称取24.3158g，置于24mL含乙二胺四乙酸二钠 (EDTA·2Na)的磷酸盐缓冲溶液(40mM，pH6.0)中，用榨汁机榨汁，之后用四 层纱布挤压过滤，再将滤液离心(离心参数：10000rpm、25min、4℃)，取上 清液备用。
(2)底物溶液配制
a.邻苯二酚：
在pH 7.0 100mM磷酸盐缓冲溶液中配制300mM邻苯二酚溶液。
b.酪蛋白
在pH值为8.0，摩尔浓度为60mM Na2HPO4-NaOH缓冲溶液中配制6 mg/mL酪蛋白溶液。
(3)三氯乙酸溶液的配置
将4.4975g三氯乙酸，7.485g无水醋酸钠和4.725mL冰醋酸混合溶解，用 去离子水定容至250mL，得到浓度为17.99mg/mL三氯乙酸溶液。
(4)L-半胱氨酸溶液的配置
将0.26gL-半胱氨酸和0.22g乙二胺四乙酸二钠混合，加热溶解，调节pH 为6.0，用去离子水定容至100mL，得到浓度为2.6mg/mL L-半胱氨酸溶液。
(5)杯芳烃溶液母液的配制
在水中配制2mg/mL 4-SC[n](n＝4,6,8)和4-杯[4]芳烃季铵盐溶液作为母 液，以便在后续试验中进行稀释不同倍数得到工作液。
实施例2
a.SC[4]芳烃对多酚氧化酶的酶活力的影响
实施例1制备的酶粗提液经过25倍稀释，用移液枪量取12.5μL加入到 175μL的蒸馏水溶液，得到稀释粗酶液。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL的4-磺酸基杯[4]芳烃溶液分别与稀释粗酶液 混合，4-磺酸基杯[4]芳烃溶液与稀释粗酶液的体积比分别为3.75:56.25，75: 56.25，150:56.25，225:56.25，300:56.25，平衡1h。向得到的混合液中添加 93.4μL邻苯二酚溶液及81.6μL蒸馏水进行催化反应，反应温度为30℃，溶液 的pH值调整为7，反应8s时间，反应结束后将反应液于420nm处检测吸光度值 随时间的变化。以未与4-磺酸基杯[4]芳烃溶液混合的粗酶液进行催化反应作 为空白对照组。结果见表1。
实施例3
SC[4]芳烃对菠萝蛋白酶的酶活力的影响
粗酶液稀释25倍(120μL酶加入到2880μL的蒸馏水中)后于37.2℃水浴锅 中恒温10min。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、 0.8mg/mL的4-磺酸基杯[4]芳烃溶液分别与稀释粗酶液混合，4-磺酸基杯[4]芳 烃溶液与稀释粗酶液的体积比分别为3.75:56.25，75:56.25，150:56.25，225: 56.25，300:56.25，平衡1h。取等体积的粗酶和L-半胱氨酸溶液混合，向得到 的混合液中加入五倍量三氯乙酸溶液和酪蛋白溶液，准确反应10min后，再分 别加入等体积的酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液进行催化反应，反应温度为37.2℃，溶液的pH为8。反应结束，在37.2℃水浴锅中再恒温30min。于高速 冷冻离心机中离心(离心参数：10000rpm，4℃，25min)，取上层清液， 测定在275nm处的吸光度值。以未与4-磺酸基杯[4]芳烃溶液混合的粗酶液进 行催化反应作为空白对照组。结果见表1。
表1不同浓度的SC[4]芳烃对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
对比例1
按照实施例2的方法进行酶活力测定，区别在于不同浓度的SC[4]芳烃与底 物先混合，再与粗酶液进行混合进行催化反应。结果见表2。
对比例2
按照实施例3的方法进行酶活力测定，区别在于不同浓度的SC[4]芳烃与底 物先混合，再与粗酶液进行混合进行催化反应。结果见表2。
表2不同浓度的SC[4]芳烃对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
实施例4
a.SC[6]芳烃对多酚氧化酶的酶活力的影响
实施例1制备的酶粗提液经过25倍稀释，用移液枪量取12.5μL加入到 175μL的蒸馏水溶液，得到稀释粗酶液。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL的4-磺酸基杯[6]芳烃溶液分别与稀释粗酶液 混合，4-磺酸基杯[6]芳烃溶液与稀释粗酶液的体积比分别为3.75:56.25，75: 56.25，150:56.25，225:56.25，300:56.25，平衡1h。向得到的混合液中添加 93.4μL邻苯二酚溶液及81.6μL蒸馏水进行催化反应，反应温度为30℃，溶液 的pH值调整为7，反应8s时间，反应结束后将反应液于420nm处检测吸光度值 随时间的变化。以未与4-磺酸基杯[6]芳烃溶液混合的粗酶液进行催化反应作 为空白对照组。结果见表3。
实施例5
SC[6]芳烃对菠萝蛋白酶的酶活力的影响
粗酶液稀释25倍(120μL酶加入到2880μL的蒸馏水中)后于37.2℃水浴锅 中恒温10min。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、 0.8mg/mL的4-磺酸基杯[6]芳烃溶液分别与稀释粗酶液混合，4-磺酸基杯[6]芳 烃溶液与稀释粗酶液的体积比分别为3.75:56.25，75:56.25，150:56.25，225: 56.25，300:56.25，平衡1h。取等体积的粗酶和L-半胱氨酸溶液混合，向得到 的混合液中加入五倍量三氯乙酸溶液和酪蛋白溶液，准确反应10min后，再分 别加入等体积的酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液进行催化反应，反应温度为37.2℃，溶液的pH为8。反应结束，在37.2℃水浴锅中再恒温30min。于高速 冷冻离心机中离心(离心参数：10000rpm，4℃，25min)，取上层清液， 测定在275nm处的吸光度值。以未与4-磺酸基杯[6]芳烃溶液混合的粗酶液进 行催化反应作为空白对照组。结果见表3。
表3不同浓度的SC[6]芳烃对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
对比例3
按照实施例4的方法进行酶活力测定，区别在于不同浓度的SC[6]芳烃与底 物先混合，再与粗酶液进行混合进行催化反应。结果见表4。
对比例4
按照实施例5的方法进行酶活力测定，区别在于不同浓度的SC[6]芳烃与底 物先混合，再与粗酶液进行混合进行催化反应。结果见表4。
表4不同浓度的SC[6]芳烃对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
实施例6
SC[8]芳烃对多酚氧化酶的酶活力的影响
实施例1制备的酶粗提液经过25倍稀释，用移液枪量取12.5μL加入到 175μL的蒸馏水溶液，得到稀释粗酶液。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL的4-磺酸基杯[8]芳烃溶液分别与稀释粗酶液 混合，4-磺酸基杯[8]芳烃溶液与稀释粗酶液的体积比分别为0.9375:12.5、 18.75:12.5、37.5:12.5、56.25:12.5、75:12.5，平衡1h。向得到的混合液中添加 93.4μL邻苯二酚溶液及81.6μL蒸馏水进行催化反应，反应温度为30℃，溶液 的pH值调整为7，反应8s时间，反应结束后将反应液于420nm处检测吸光度值随时间的变化。以未与4-磺酸基杯[8]芳烃溶液混合的粗酶液进行催化反应作 为空白对照组。结果见表5。
实施例7
SC[8]芳烃对菠萝蛋白酶的酶活力的影响
粗酶液稀释25倍(120μL酶加入到2880μL的蒸馏水中)后于37.2℃水浴锅 中恒温10min。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、 0.8mg/mL的4-磺酸基杯[8]芳烃溶液分别与稀释粗酶液混合，4-磺酸基杯[8]芳 烃溶液与稀释粗酶液的体积比分别为0.9375:12.5，18.75:12.5，37.5:12.5， 56.25:12.5，75:12.5，平衡1h。取等体积的粗酶和L-半胱氨酸溶液混合，向得 到的混合液中加入五倍量三氯乙酸溶液和酪蛋白溶液，准确反应10min后，再 分别加入等体积的酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液进行催化反应，反应温度为37.2℃，溶液的pH为8。反应结束，在37.2℃水浴锅中再恒温30min。于高速 冷冻离心机中离心(离心参数：10000rpm，4℃，25min)，取上层清液， 测定在275nm处的吸光度值。以未与4-磺酸基杯[8]芳烃溶液混合的粗酶液进 行催化反应作为空白对照组。结果见表5。
表5不同浓度的SC[8]芳烃对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
对比例5
按照实施例6的方法进行酶活力测定，区别在于不同浓度的SC[8]芳烃与底 物先混合，再与粗酶液进行混合进行催化反应。结果见表6。
对比例6
按照实施例7的方法进行酶活力测定，区别在于不同浓度的SC[8]芳烃与底 物先混合，再与粗酶液进行混合进行催化反应。结果见表6。
表6不同浓度的SC[8]芳烃对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
实施例8
杯[4]芳烃季铵盐对多酚氧化酶的酶活力的影响
实施例1制备的酶粗提液经过25倍稀释，用移液枪量取12.5μL加入到 175μL的蒸馏水溶液，得到稀释粗酶液。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL的杯[4]芳烃季铵盐溶液分别与稀释粗酶液混 合，杯[4]芳烃季铵盐溶液与稀释粗酶液的体积比分别为0.9375:12.5、 18.75:12.5、37.5:12.5、56.25:12.5、75:12.5，平衡1h。向得到的混合液中添加93.4μL邻苯二酚溶液及81.6μL蒸馏水进行催化反应，反应温度为30℃，溶液 的pH值调整为7，反应8s时间，反应结束后将反应液于420nm处检测吸光度值 随时间的变化。以未与杯[4]芳烃季铵盐溶液混合的粗酶液进行催化反应作为 空白对照组。结果见表7。
实施例9
杯[4]芳烃季铵盐对菠萝蛋白酶的酶活力的影响
粗酶液稀释25倍(120μL酶加入到2880μL的蒸馏水中)后于37.2℃水 浴锅中恒温10min。将浓度为0.01mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、 0.8mg/mL的杯[4]芳烃季铵盐溶液分别与稀释粗酶液混合，杯[4]芳烃季铵盐溶 液与稀释粗酶液的体积比分别为3.75:56.25、75:56.25、150:56.25、225: 56.25、300:56.25，平衡1h。取等体积的粗酶和L-半胱氨酸溶液混合，向得 到的混合液中加入五倍量三氯乙酸溶液和酪蛋白溶液，准确反应10min后， 再分别加入等体积的酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液进行催化反应，反应温度为 37.2℃，溶液的pH为8。反应结束，在37.2℃水浴锅中再恒温30min。于高 速冷冻离心机中离心(离心参数：10000rpm，4℃，25min)，取上层清液， 测定在275nm处的吸光度值。以未与杯[4]芳烃季铵盐溶液混合的粗酶液进行 催化反应作为空白对照组。结果见表7。
表7不同浓度的杯[4]芳烃季铵盐对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
对比例7
按照实施例9的方法进行酶活力测定，区别在于不同浓度的杯[4]芳烃季铵 盐与底物先混合，再与粗酶液进行混合进行催化反应。结果见表8。
表8不同浓度的杯[4]芳烃季铵盐对菠萝粗提液中BM和PPO活性的影响
将实施例1～9的实验数据做成图，结果见图1。
由上述实施例1～9和对比例1～7可知，菠萝蛋白酶粗酶：杯芳烃与粗酶先 混合时，阴离子型4-SC[4]为0.01-0.8mg/mL，可将酶活性降低至40％左右，并 保持稳定；4-SC[6]为0.01-0.8mg/mL，可将酶活性降低至30％左右，并保持稳 定；4-SC[8]为0.01-0.08mg/mL，可将酶活性降低至20％，并保持稳定；阳离子 型杯[4]芳烃季铵盐为0.02-0.08mg/mL，可将酶活性提高至140％左右，保持稳 定。杯芳烃与底物先混合时，对酶活性的影响都不大。
多酚氧化酶方面：杯芳烃与粗酶先混合时，4-SC[n]浓度在0.01mg/mL时， 对于4-SC[4]而言，酶活性基本保持不变；对于4-SC[6]和4-SC[8]而言，酶活性 降低至80％；4-SC[n]浓度在0.2mg/mL时，对于4-SC[4]而言，酶活性降低至60％； 对于4-SC[6]而言，酶活性降低至40％；所以相比于4-SC[4]，在浓度较低时， 4-SC[6]对酶活性的抑制效果更为明显。当4-SC[8]浓度为0.08mg/mL时，将酶 活性降低至58％，而相比于0.1mg/mL的4-SC[6]，只能将酶活性降低至70％， 所以4-SC[8]对酶的抑制效果更为明显；阳离子型杯[4]芳烃季铵盐为 0.02mg/mL，可将酶活性提高至140％左右，杯[4]芳烃季铵盐为0.08mg/mL，可 将酶活性提高至230％左右。杯芳烃与底物先混合时，4-SC[4]对酶活性不影响， 4-SC[6]、4-SC[8]以及杯[4]芳烃季铵盐的加入对酶活性稍有提高，但影响不大。
由表1、3、5、7可知，对于阴离子型的4-SC[n](n＝4,6,8)而言，在杯芳 烃浓度较低时，随着空腔的增大，对菠萝粗提液中存在的BM和PPO两种酶的 酶活性的抑制效果更明显。这可能是由于空腔越大，酶分子被包裹进去的部 位越多，使得酶跟底物接触的越少，从而使得酶活性更低。对于BM粗酶而言，4-SC[n](n＝4,6,8)对酶的抑制程度不随杯芳烃浓度的影响，而杯芳烃浓度改 变对PPO粗酶活性影响不同，随着浓度的增加，抑制效果更加明显。
由表2、4、6、8可知，杯芳烃跟底物先混合时，对酶活性影响不 大。由此可知，杯芳烃与菠萝粗提液发生相互作用时，两者光谱行为 的影响跟空腔大小以及电荷正负有关。对于，阴离子型4-SC[n](n＝4, 6,8)而言，随着空腔的增大，混合体系的吸光度值与两者物质的物 理加和值之间的差值逐渐增大，即两者相互更加明显。
实施例10
将实施例1制备的粗酶液稀释25倍(120μL酶加入到2880μL的蒸馏水中) 后于37.2℃水浴锅中恒温10min。将浓度为0.1mg/mL的4-SC[n](n为4，6或8) 溶液和浓度为0.1mg/mL的杯[4]芳烃季铵盐溶液分别与菠萝粗酶液混合，体积 比为25:20，室温30℃条件下平衡1h。将得到的4组混合液进行光谱检测，采用 岛津紫外可见分光光度计UV-1780在光谱模式下275nm处的吸光度值。杯芳烃 与粗酶液的混合溶液出峰值处理的为混合物组，杯芳烃和粗酶液紫外分别的 出峰值的物理加和值处理为添加组。光谱结果见表9。
表9菠萝粗提液与4种杯芳烃溶液之间光谱结果
| 杯芳烃种类 | 4-SC[4] | 4-SC[6] | 4-SC[8] | 杯[4]芳烃季铵盐 |
| 混合组 | 1.3415 | 1.2375 | 1.2135 | 1.374 |
| 添加组 | 1.3785 | 1.2965 | 1.2945 | 1.3555 |
由表9所知，对于阴离子型4-SC[n](n为4，6或8)而言，与菠萝粗酶 液混合后，混合物的出峰值小于物理加和值，说明两者物质之间存在相互作 用，并且随着空腔的增大，相互作用越强，与活性实验相对应。对于阳离子 型杯[4]芳烃季铵盐而言，混合物的出峰值大于物理加和值，与阴离子的相反， 也与提高酶活性结果相吻合。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.杯芳烃衍生物在抑制菠萝蛋白酶和/或源于菠萝的多酚氧化酶活性中的应用；
所述应用为将菠萝蛋白酶和/或源于菠萝的多酚氧化酶先与杯芳烃衍生物混合，得到的混合酶液再催化底物；
所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[4]芳烃、4-磺酸基杯[6]芳烃和/或4-磺酸基杯[8]芳烃。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[4]芳烃时，所述4-磺酸基杯[4]芳烃在抑制菠萝蛋白酶活性中的有效浓度不低于0.01mg/ml；所述4-磺酸基杯[4]芳烃在抑制源于菠萝的多酚氧化酶活性中的有效浓度不低于0.2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[6]芳烃时，所述4-磺酸基杯[6]芳烃在抑制菠萝蛋白酶活性中的有效浓度不低于0.01mg/ml；所述4-磺酸基杯[6]芳烃在抑制源于菠萝的多酚氧化酶活性中的有效浓度不低于0.1mg/ml。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杯芳烃衍生物为4-磺酸基杯[8]芳烃时，所述4-磺酸基杯[8]芳烃在抑制菠萝蛋白酶和/或源于菠萝的多酚氧化酶活性中的有效浓度不低于0.01mg/ml。
5.杯[4]芳烃季铵盐在增强菠萝蛋白酶和/或源于菠萝的多酚氧化酶活性中的应用；
所述应用为将菠萝蛋白酶和/或源于菠萝的多酚氧化酶先与杯[4]芳烃季铵盐混合，得到的混合酶液再催化底物；
所述杯[4]芳烃季铵盐为结构式如式II所示的化合物；
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述杯[4]芳烃季铵盐的有效浓度不低于0.02mg/ml。
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