KR20120121076A

KR20120121076A - 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스의 세포외 효소를 이용한 진세노사이드 알지원으로부터 진세노사이드 에프원의 생산방법

Info

Publication number: KR20120121076A
Application number: KR1020110038826A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 유미현; 염명훈; 김덕희; 김한곤
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2011-04-26
Filing date: 2011-04-26
Publication date: 2012-11-05
Also published as: KR101844975B1

Abstract

본 발명은 미생물 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var . subglutinans)의 세포외 효소를 사용하여 희귀 진세노사이드 F1(Ginsenoside F1)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자낭균류 곰팡이인 모닐리포르메 바 써브글루티난스 KCTC 6149의 배양액 중의 상등액의 효소를 사용하여 기질로서 진세노사이드 Rg1(Ginsenoside Rg1)과 반응용매 중에서 반응시켜 진세노사이드 F1을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스의 세포외 효소를 이용한 진세노사이드 알지원으로부터 진세노사이드 에프원의 생산방법 {Method of producing Ginsenoside F1 from the Ginsenoside Rg1 by extracellular enzyme from Fusarium moniliforme var. subglutinans}

본 발명은 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var. subglutinans) KCTC 6149의 세포외 효소를 사용하여 인삼에 존재하지 않는 희귀 진세노사이드(Ginsenoside)에 속하는 진세노사이드 F1(Ginsenoside F1) 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자낭균류 곰팡이인 푸사리움 모닐리포르메의 배양액 중의 상등액의 효소를 사용하여 화학식(1)로 표현되는 기질인 진세노사이드 Rg1(Ginsenoside Rg1)의 6번 탄소의 글루코스만을 선택적으로 가수분해하여 최종적으로 희귀 진세노사이드인 화학식(2)로 나타나는 진세노사이드 F1(Ginsenoside F1)의 제조방법에 관한 것이다.

진세노사이드 F1은 암세포 증식 억제, 항암제의 항암 활성 증대 작용, 알러지 억제 및자외선 B의 조사에 의한 세포사멸(apoptosis)로부터 Bcl-2와 Brn-3a의 발현을 하부-조절(down-regulation)시킴으로써 인간 HaCaT 각질세포를 보호할 수 있음이 알려져 있다(Lee EH, et al., J. Invest. Dermatol. 121:607-13, 2003).

현재까지의 진세노사이드 F1 생산의 기술로는 장내 세균에 의해 생성 방법(Hasegawa, H. et al., Planta Medica, 62:453(1996))이 공지되어 있으나 장내세균을 이용하는 방법은 반응시간이 길며 전환수율이 10% 내외로 낮은 문제점 때문에 최근에는 효소를 이용한 제조방법에 관심을 가지게 되었다. 효소를 이용한 방법으로는 인삼 정제 사포닌을 물이나 완충용액과 같은 수성용매 또는 물이나 완충용액과 같은 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시킨 다음 나린지나제 및 펙티나제 중 적어도 하나 이상을 첨가하여 진세노사이드 F1을 제조하는 방법(대한민국 공개특허공보 제2003-37005호), 박테리오즈 JY6(Bacteriodes JY6)의 베타-글루코시다제를 이용하여 인삼 사포닌으로부터 진세노사이드 F1을 제조하는 방법(대한민국 공개특허공보 제2002-32038호) 및 인삼추출물 또는 트리올계 사포닌을 페니실리움 속(Penicillium sp.) 또는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp.)의 베타-갈락토시다제와 반응하여 진세노사이드 F1을 제조하는 방법으로 약 90%의 전환을 보이며 127 ~ 150 mg/ℓ/h의 생산성을 보이는 방법이 공지되어 있다(대한민국 공개특허공보 제2003-37005호).

이에 본 발명자들은 부산물 없이 고수율로 진세노사이드 F1을 생산할 수 있는 물질을 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var . subglutinans) KCTC 6149의 세포외 효소를 이용하여 기질인 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 F1을 제조하면 진세노사이드 Rg1의 6번 탄소의 글루코스만을 선택적으로 가수분해하는 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var . subglutinans) 균주로부터 유래한 세포외 효소를 사용하여 진세노사이드 F1의 대량 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var . subglutinans) 균주로부터 유래한 세포외 효소를 포함하는 진세노사이드 F1(Ginsenoside F1) 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 세포외 효소를 이용한 진세노사이드 F1 제조방법은 기질인 진세노사이드 Rg1과 완충용액, 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액 중에서 반응시킬 때, 30 ~ 70℃에서 반응하여 진세노사이드 Rg1의 6번 탄소의 글루코스만을 선택적으로 가수분해하여 단시간에 진세노사이드 F1을 100% 전환하여 부산물없이 고수율로 생성하는 작용효과를 나타낸다.

상기 진세노사이드 Rg1은 순수 분리된 진세노사이드 Rg1을 사용하며, Ambo Institute (Daejeon, Korea)에서 구입한 것을 사용하였다.

상기 효소의 반응 용매는 구연산나트륨 완충액, 인산칼륨 완충액과 같은 완충용액을 사용할 수 있다.

상기 완충용액의 구연산나트륨 완충액은 구연산나트륨과 구연산을 각각 50 mM로 만든 후 둘을 섞어가며 pH 적정하여 제조하는 것이 바람직하며 인산칼륨 완충용액은 인산칼륨 monobasic과 dibasic(KH₂PO₄, K₂HPO₄)를 각각 50 mM로 만든 후 둘을 섞어가면서 pH 적정하여 제조하는 것이 바람직하다.

상기 세포외 효소의 수득은 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스를 오트밀 배지(오트밀 55g/ℓ, 한천 7g/ℓ)에서 28℃에서 6일간 평판배양하는 것이 바람직하다. 평판배양된 접시(plate) 당 균사를 회수하여 250㎖의 액상 오트밀 배지(오트밀 55g/ℓ)에서 28℃, 200rpm으로 3일간 성장배양한 후, 성장배양으로 만들어진 성장배양액을 전체 볼륨의 10%가 되게 발현배지로 접종하여 28℃, 200rpm으로 5일간 배양한다. 상기 발현배지의 조성은 carboxymethyl cellulose 10 g/ℓ, (NH₄)SO₄ 10g/ℓ, KH₂PO₄ 7.5g/ℓ, MgSO₄ 2g/ℓ, CaCl₂ 0.2g/ℓ이다.

상기 과정에서의 배양액을 와트만 여과지를 사용하여 여과한 한 후 여과액을 회수하여 황산암모늄을 사용한 염석 방법을 이용하여 세포외 효소를 수득하였다.

상기 효소의 반응 온도는 온도 30℃ 내지 70℃ 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, 열안정성을 고려하여 50℃에서 반응하는 것이 더욱 바람직하다. 50℃에서의 활성을 100%라 할 때, 30℃ 미만에서는 상대적 활성이 20% 미만으로 감소하고, 50℃를 초과하는 온도에서 5시간 이상 기질과 반응할 경우 활성이 70% 미만으로 감소하기 때문이다.

또한 세포외 효소 및 기 질간의 반응은 pH 4.0 내지 pH 7.0 범위에서 이루어지는 것이 바람직하고, pH 6.0에서 반응하는 것이 더욱 바람직하다. pH 6.0에서의 활성을 100%라 할 때, pH4.0 미만인 경우에는 상대적 활성이 40% 미만으로 감소하고, pH 7.0을 초과하는 경우에는 상대적 활성이 60% 미만으로 감소하기 때문이다.

상기 반응에서 2.5 mg/㎖ 또는 5 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1을 사용하여 반응하는 경우에 있어서 세포외 효소의 단위는 1.2 ~ 6.7 단위/㎖이 바람직하고, 6.7 단위/㎖ 에서 반응하는 것이 더욱 바람직하다. 세포외 효소 6.7 단위/㎖를 초과하여도 진세노사이드 Rg이 더 이상 전환되지 않으며, 1.2 단위/㎖ 미만일 때에는 전환율이 20%미만으로 감소하기 때문이다.

본 발명의 세포외 효소를 이용한 진세노사이드 F1 제조방법에 따르면 세포외 효소를 이용하여 진세노사이드 Rg1을 사용하였을 시 진세노사이드 F1 생산에 관하여 기질과 효소 농도의 최적화를 통해 기질인 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 F1을 선택적으로 생산하여 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 시험예 및 실시예를 들어 구체적으로 설명하지만, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 시험예 1> 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스의 생장조건과 세포외 효소 수득

세포외 효소를 제조하기 위하여 먼저 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스 KCTC 6149 균주를 고체 오트밀 배지(오트밀 55 g/ℓ, 한천 7 g/ℓ)에서 28℃로 6일동안 평판배양을 한 후 균사를 회수하여 액상 오트밀 배지(오트밀 55 g/ℓ)로 계대하여 28℃에서 200 rpm으로 1 ~ 8일간 배양하였다.

각 날짜의 배양여액에 기질로서 1 mM의 4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside를 최종농도 0.3 mg/㎖가 되도록 첨가하여 37℃에서 10분간 반응 후 최종농도 20 mg/㎖이 되도록 Na₂CO₃ 첨가 후 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 배양여액의 활성을 측정하였다. 또한 각 날의 건조 세포 중량(dry cell weight)을 측정하여 건조 세포 중량 당 활성(단위/mg DCW)을 측정하였다(도 2). 결과적으로 기울기가 5일까지 꾸준하게 증가하기 때문에 5일을 배양날짜로 선정하였다. 이때 배양여액의 단위(unit)는 1분당 1 나노몰(nmole)의 4-Nitrophenol을 생산하는 양으로 산정하였다.

5일동안 배양된 배양여액 1L당 561g의 황산암모늄을 첨가하여 12시간 용출시킨 후, 13,000× g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다.

원심분리하여 얻어진 침전물을 각각 50mM구연산나트륨 완충용액 및 인산칼륨 완충용액에 용해하고, 탈염과정을 통해 황산암모늄을 제거하여 세포외 효소를 1L배양액 당 15mg 얻어냈다.

< 참고예 1> 세포외 효소 활성 측정 방법

본 발명에서 제시된 희귀 진세노사이드의 생산에 관한 조성물에 제공되는 세포외 효소의 활성 측정에는 순수 분리된 진세노사이드 Rg1(Ambo Institute 제조, Daejeon, Korea에서 구입)을 사용하였다. 구체적으로 상기 반응에는 진세노사이드Rg1과 세포외 효소는 모두 50 mM의 버퍼에 녹아있는 상태로 0.6 mg/㎖ 의 진세노사이드 Rg1 0.6㎖와 세포외 효소 2 단위/㎖ 0.5㎖ 및 50 mM pH 6.0 구연산나트륨 완충용액을 섞어 진세노사이드 Rg1의 최종농도가 0.3 mg/㎖, 세포외 효소의 최종농도가 1 단위/㎖가 되게 하고, 진세노사이드 Rg1, 구연산나트륨 완충용액 및 세포외 효소의 총 합이 1 ㎖가 되도록 섞은 후 60℃에서 30분 동안 반응을 진행시켰다. 또한 1 ㎖ n-butanol의 첨가로 상기 반응을 정지시켰다. 이때 사용된 진세노사이드 Rg1과 효소반응으로 인하여 생성된 진세노사이드 F1의 양은 VWD 검출기 및 YMC-Pack^TM Pro C₁₈ ^TM (YMC, Kyoto, Japan)의 칼럼이 장착된 고압 액체 크로마토그래피를 실시하여 산정하였고, YMC-Pack^TM Pro C₁₈ ^TM 칼럼은 37℃에서 1 ㎖/분 속도로 0%에서 80%까지 아세토니트릴을 통과시키도록 하였다. 이때 세포외 효소의 단위(Unit)는 1 나노몰(nmole)의 진세노사이드 F1을 생산하는 세포외 효소의 양으로 산정하였다. 또한 효소 단백질의 양으로는 소혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 기준으로 한 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 산정하였다.

< 시험예 2> 세포외 효소의 활성에 미치는 최적온도 조사

먼저 세포외 효소의 활성에 대한 온도의 효과를 조사하기 위하여, 효소반응은 진세노사이드 Rg1과 세포외 효소 모두 50 mM 구연산 나트륨 용액에 녹아있는 상태로 0.6 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1 0.5 ㎖과 2 단위/㎖의 세포외효소 0.5 ㎖을 섞어 최종농도 진세노사이드 Rg1 0.3 mg/㎖, 세포외 효소는 1 단위/㎖ 이 되게 한다. 1 단위/㎖ 효소와 0.3 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1이 포함된 50 mM pH 6.0 구연산 나트륨 완충용액을 사용하여 30 ~ 70℃에서 5℃ 간격으로 30분간 반응을 수행하였다. 3회 동일 실험을 반복하여 평균치를 도 3a에 나타내었다. 그 다음 1 ㎖ n-butanol의 첨가로 상기 반응을 정지시키고 참고예 1에서의 고압 액체 크로마토그래피로 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, 최적 온도는 60℃인 것을 확인하였다. (도 3a).

< 시험예 3> 세포외 효소의 활성에 미치는 최적 pH 효과 조사

또한 세포외 효소의 활성의 pH에 대한 효과를 조사하기 위하여, 효소반응은 진세노사이드 Rg1과 세포외 효소 모두 50 mM 구연산나트륨 완충용액에 녹아있는 상태로 0.6 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1 0.5 ㎖과 2 단위/㎖의 세포외 효소 0.5 ㎖을 섞어 최종농도 진세노사이드 Rg1 0.3 mg/㎖, 세포외 효소는 1 단위/㎖ 이 되게 한다. 1 단위/㎖ 효소와 0.3 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1이 포함된 50 mM pH 5.5 구연산나트륨 완충용액을 사용하여 pH 4.0 에서부터 6.0까지 pH 0.5 간격으로 실시하고(시험예 3-1),

진세노사이드 Rg1과 세포외 효소 모두 50 mM 인산칼륨 완충용액에 녹아있는 상태로 0.6 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1 0.5 ㎖과 2 단위/㎖의 세포외 효소 0.5 ㎖을 섞어 최종농도 진세노사이드 Rg1 0.3 mg/㎖, 세포외 효소는 1 단위/㎖ 이 되게 한다. 1 단위/㎖ 효소와 0.3 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1이 포함된 50 mM pH 5.5 인삼칼륨 완충용액을 사용하여 pH 6.0 에서부터 7.0까지 pH 0.5 간격으로 실시하여 60℃에서 30분 동안 반응하였다(시험예 3-2).

그 다음 시험예 4-1 및 시험예 4-2에 1 ㎖ n-butanol의 첨가하여 상기 반응을 정지시키고 참고예 1에서의 고압 액체 크로마토그래피로 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, 최적pH는 pH6.0 인 것을 확인하였다(도 3b). 도 3b 에서의 pH 에 따른 세포외 효소의 활성도에서 ●는 구연산나트륨 완충용액(시험예 3-1), ○는 인산 완충용액(시험예 3-2)을 나타낸 것이다.

< 시험예 4> 세포외 효소 활성의 온도안정성에 있어서의 최적온도 조사

세포외 효소 활성의 온도안정성을 측정하기 위해 50 mM 구연산나트륨 완충용액에 녹아있는 2 단위/㎖ 세포외 효소 0.5㎖를 각각 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65℃에서 5시간 방치시킨 후, 이들 각각을 0.6 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1 0.5 ㎖과 섞어 최종농도 진세노사이드 Rg1 0.3 mg/㎖, 세포외 효소 1 단위/㎖이 되게 하여 이를 60℃에서 30분 동안 반응하였다. 그 다음 1 ㎖ n-butanol의 첨가하여 상기 반응을 정지시키고 참고예 1에서의 고압 액체 크로마토그래피로 효소의 활성을 측정하였다. 3회 동일 실험을 반복하여 평큔치를 도 4에 나타내었다.

그 결과 가장 활성이 높았던 60℃에서는 5시간 후 활성이 23%로 급격히 떨어졌으며, 50℃에서 5시간 방치한 효소의 잔존활성 정도는 70%로 활성이 최대한 유지되어 50℃를 온도안정성을 고려한 최적온도로 결정하였으며, 진세노사이드 F1 생산실험 적용온도로 선정하였다(도 4).

< 시험예 5> 세포외 효소를 이용한 진세노사이드 F1 생산의 최적 효소 단위/㎖

상기 과정을 거쳐서 얻어진 세포외 효소가 기질로서 진세노사이드 Rg1을 사용 할 경우 진세노사이드 F1의 생산에 있어 최적 효소 단위를 조사하였다.

50 mM 구연산나트륨 완충용액(pH 6)에 녹아있는 10 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1 0.5 ㎖를 50mM 구연산나트륨 완충용액(pH 6)에 녹아있는 13.4 단위/㎖의 세포외 효소 0.5를 섞어 50℃에서 24시간 동안 반응하였다.

상기 반응 결과 세포외 효소 6.7 단위/㎖에서 약 4mg의 진세노사이드 F1을 수득하였다. 이는 반응에 사용된 5mg 진세노사이드 Rg1이 6.24mM이고, 100% 가수분해 시 진세노사이드 F1 6.24mM(약 3.99mg)을 얻게 됨을 고려할때 100%의 전환율을 보임을 알 수 있었다.

효소 6.7 단위/㎖에서 진세노사이드 F1으로의100% 전환을 보였고 생산성 167 mg/ℓ/h이었으므로 진세노사이드 F1 생산에 있어서 세포외 효소의 최적 단위/㎖는 6.7 단위/㎖임을 확인할 수 있었다(도 5). 도 5에서의 세포외 효소의 최적 효소 단위/㎖ 조사에서 ■는 진세노사이드 F1의 mg/㎖, ●는 전환율을 나타낸 것이다(도 5).

< 실시예 1> 진세노사이드 Rg1 2.5 mg /㎖의 시간에 따른 진세노사이드 F1의 생산

상기 세포외 효소를 이용하여 시간에 따른 진세노사이드 F1의 생산방법을 개발하기 위하여 세포외 효소의 최적 pH 및 온도안정성을 고려한 최적 온도인 pH 6.0, 50℃에서 반응하였다.

구체적으로 효소반응은 진세노사이드 Rg1과 세포외 효소 모두 50 mM 구연산나트륨 완충용액(pH 6.0)에 녹아있는 상태로 5mg/㎖ 진세노사이드 Rg1 0.5㎖와 13.4 단위/㎖의 세포외 효소 0.5 ㎖를 섞어, 최종농도 진세노사이드 Rg1 2.5mg/㎖, 세포외 효소 6.7단위/㎖가 되게 하여 50℃에서 24시간 동안 반응하였다. 그 다음 1㎖ n-butanol을 첨가한 후 1분간 voltex하여 반응을 정지했다. 이를 13000× g에서 1분간 원심분리하여 분리된 상층의 유기층을 회수하여 증발시킨 후 1㎖ 메탄올을 첨가하여 voltex한 후 참고예 1에서의 고압 액체 크로마토그래피로 측정하였다.

상기 실험으로 구해진 최적 효소 단위/㎖인 6.7 단위/㎖과 2.5 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1을 반응하였을 경우 시간별 생산량을 측정한 결과 9시간 째 100% 전환되어 진세노사이드 F1 2 mg/㎖를 생산하여 222 mg/ℓ/h의 생산성을 나타낸다(도 6a).

< 실시예 2> 진세노사이드 Rg1 5.0 mg /㎖의 시간에 따른 진세노사이드 F1의 생산

구체적으로 효소반응은 진세노사이드 Rg1과 세포외 효소 모두 50 mM 구연산나트륨 완충용액(pH 6.0)에 녹아있는 상태로 10mg/㎖ 진세노사이드 Rg1 0.5㎖와 13.4 단위/㎖의 세포외 효소 0.5 ㎖를 섞어, 최종농도 진세노사이드 Rg1 5.0mg/㎖, 세포외 효소 6.7단위/㎖가 되게 하여 50℃에서 24시간 동안 반응하였다. 그 다음 1㎖ n-butanol을 첨가한 후 1분간 voltex하여 반응을 정지했다. 이를 13000× g에서 1분간 원심분리하여 분리된 상층의 유기층을 회수하여 증발시킨 후 1㎖ 메탄올을 첨가하여 voltex한 후 참고예 1에서의 고압 액체 크로마토그래피로 측정하였다.

상기 실험으로 구해진 최적 효소 단위/㎖인 6.7 단위/㎖과 5.0 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1을 반응하였을 경우 시간별 생산량을 측정한 결과 24시간 째 100% 전환되어 진세노사이드 F1 4 mg/㎖를 생산하여 167 mg/ℓ/h의 생산성을 나타낸다(도 6b).

도 6a와 도 6b 에서의 진세노사이드 F1 생산에 있어 ●는 진세노사이드 Rg1, ○는 진세노사이드 F1을 나타낸 것이다.

상기 세포외 효소와 2.5 또는 5 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1을 사용한 최적의 반응조건에서 반응할 경우 최종적으로 진세노사이드 F1을 2 또는 4 mg/㎖ 생산하여 167 ~ 222 mg/ℓ/h의 생산성을 나타내며, 100% 전환으로 가장 높은 전환수율을 나타내며, 기존 보고된 가장 높은 진세노사이드 F1 생산성보다 약 1.5배 정도 높아 가장 높은 수치를 보인다.

본 발명은 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var. subglutinans) 균주로부터 유래한 세포외 효소를 사용하여 진세노사이드 Rg1를 기질로 하여 진세노사이드 F1을 제조하는 방법에 관한 것이다.

푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스 KCTC 6149 균주로부터 유래한 세포외 효소는 암세포 증식 억제, 항암제의 항암 활성 증대 작용, 알러지 억제 및 각질세포를 보호할 수 있는 진세노사이드 F1을 진세노사이드 Rg1의 6번 탄소의 글루코스에 대한 높은 기질특이성으로 인하여 100%의 고수율로 전환할 수 있다.

또한 온도 및 pH, 기질과 효소 농도의 최적화를 통해 고수율로 진세노사이드 F1을 생산하여 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 진세노사이드 Rg1으로 반응한 결과로서 전환된 진세노사이드 F1을 확인할 수 있다.
도 2는 건조 세포 중량 당 4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside에 대한 활성을 측정하여 배양날짜를 조사하여 나타낸 것이다.
도 3a는 세포외 효소의 온도에 따른 효소활성도를 조사하여 나타낸 것이다.
도 3b는 세포외 효소의 pH에 따른 효소활성도를 조사하여 나타낸 것이다.
도 4는 세포외 효소의 각 온도에서의 온도안정성을 나타낸 것이다.
도 5는 진세노사이드 F1 생산에 있어 세포외 효소의 최적 단위/㎖를 조사하여 나타낸 것이다.
도 6은 진세노사이드 F1 생산에 있어 도 5의 최적 효소 단위/㎖을 적용하여 시간별 생산을 본 것이다. (a)는 2.5mg/㎖의 진세노사이드 Rg1과 세포외 효소 6.7 단위/㎖를, (b)는 5.0 mg/㎖의 진세노사이드 Rg1과 세포외 효소 6.7 단위/㎖를 사용하여 진세노사이드 F1 생산을 본 것이다.

Claims

자낭균 곰팡이인 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var . subglutinans) 균주로부터 유래한 세포외 효소를 포함하는 진세노사이드 F1(Ginsenoside F1) 제조용 조성물.
제 1항에 있어서 상기 세포외 효소는 최적 활성온도가 30℃내지 70℃인 진세노사이드 F1 제조용 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서 상기 세포외 효소는 최적 활성 pH가 pH 4.0 내지 pH 7.0인 진세노사이드 F1 제조용 조성물.
자낭균 곰팡이인 푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var . subglutinans) 균주로부터 유래한 세포외 효소를 진세노사이드 Rg1과 반응시킴을 포함하는 진세노사이드 F1의 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 진세노사이드 F1의 제조방법은
푸사리움 모닐리포르메 바 써브글루티난스(Fusarium moniliforme var . subglutinans) 균주를 배양하는 단계;
상기 배양된 균주로부터 세포외 효소를 제조하는 단계;
상기 세포외 효소를 진세노사이드 Rg1(Ginsenoside Rg1)과 반응시키는 단계;
를 포함하는 진세노사이드 F1의 제조방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 세포외 효소는 1.2 단위/㎖ 내지 6.7 단위/㎖이고, 진세노사이드 Rg1은 2.5 mg/㎖ 또는 5.0 mg/㎖인 것을 특징으로 하는 진세노사이드 F1의 제조방법.