KR20170112637A - 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법 - Google Patents
장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인삼 성분 중에서 함량이 많고 분리하기가 용이한 다이올계 사포닌을 장수버섯 균사체가 생산하는 효소들에 의해서 인삼 사포닌의 장내대사산물인 희귀 사포닌을 간편하면서 고수율로 제조하는 방법에 관한 것으로, 국내외에서 오래전부터 약용으로 이용되어 오고 있는 장수버섯을 배양하여 생산된 균사체에서 분리한 효소를 사용하여 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd 또는 이들의 혼합물로부터 천연 인삼에는 함유되어 있지 않은 희귀 사포닌인 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 또는 컴파운드 와이를 간단하면서도 고수율로 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼 성분 중에서 함량이 많고 분리하기가 용이한 다이올계 사포닌을 장수버섯 균사체가 생산하는 효소들에 의해서 인삼 사포닌의 장내대사산물인 희귀 사포닌을 간편하면서 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
컴파운드 케이(compound K), 컴파운드 엠씨(compound Mc), 컴파운드 와이(compound Y)와 같은 희귀 사포닌은 일반 인삼에는 함유되어 있지 않고, 인삼 사포닌을 섭취하였을 때 장내 세균들에 의한 대사산물이다.
상기 컴파운드 케이의 경우는 여러 가지 생리활성을 지니고 있는 것으로 밝혀져 있으나, 컴파운드 엠씨와 컴파운드 와이는 여러 가지 생리활성 시험에 제공할 수 있을 정도로 용이하게 생산할 수 있는 방법이 개발되어 있지 않은 관계로 이들의 생리활성에 대해서는 거의 밝혀져 있지 않은 실정이다.
컴파운드 케이(compound K)라 불리우는 20(S)-프로토파낙사다이올-20-0-베타-디-글루코피라노사이드는 면역증강작용, 암세포 증식 억제, 종양혈관신생억제작용, 알러지 및 아토피 억제, 항당뇨 작용, 모발 발모 촉진효과 뿐만 아니라, 인체 세포내 히알루론산 유전자(hyaluronic acid synthase)의 발현을 증가시켜 히알루론산의 생성을 촉진시키는 것으로 알려져 있는 생리활성 물질이다 (대한민국 등록특허공보 제10-0164266호, 대한민국 등록특허공보 제10-0485326호 등).
반면에, 컴파운드 엠씨와 컴파운드 와이의 생리활성에 대해서는 아직까지 구체적으로 밝혀져 있지 않은 희귀 인삼 사포닌이다.
인삼 특유의 약리활성 사포닌인 진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리테르페노이드인 프로토파낙사다이올 또는 프로토파낙사트라이올에 글루코스, 람노스, 아라비노스 또는 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물들로서 현재까지 고려인삼에서 약 30 여종의 유도체들이 밝혀져 있다.
또한, 인삼 사포닌은 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합 위치에 따라 약리 효능이 각각 다르다는 것이 이미 밝혀져 있으며, 인삼 중 함량이 많고 분리하기가 용이한 주요 사포닌의 약리효능에 대해서는 많은 연구가 수행되었으나, 미량 사포닌의 약리효능에 관한 연구는 극히 적은 편이다.
한편, 다이올계 인삼 사포닌을 경구 투여하게 되면 장내 세균, 특히 프리보텔라리스(Prevotellaris)에 의해 대사되어 흡수되며 이들 대사산물이 인삼 사포닌의 약효를 나타내는 체내 대사산물 (The Ginseng Review 10, Kobayashi 등, 1994년)로 밝혀져 있는 데, 컴파운드 케이는 효능실험을 통하여 면역 증강작용, 암세포 증식 억제, 종양혈관신생 억제작용, 알러지 및 아토피 억제, 항당뇨 작용, 모발 발모 촉진효과 뿐만 아니라, 인체 세포내 히알루론산 합성 유전자의 발현을 증가시켜 히알루론산의 생성 촉진 효과 등 여러 가지 유효한 효능이 있는 것으로 밝혀지고 있으나, 인삼 자체에는 함유되어 있지 않고, 체내 대사산물로서 그 수율도 낮아 일시에 다량의 시료를 얻기가 어려운 실정이다.
따라서, 종래 다양한 생리활성을 갖는 진세노사이드 대사산물을 다량 함유하는 발효인삼 또는 발효 홍삼을 제조하기 위하여 인삼 또는 홍삼에 상황버섯, 동충하초, 차가버섯, 흰목이 버섯, 표고버섯 또는 잎새버섯 균사체를 혼합하여 발효시키는 방법이 시도되었으나, 이와 같은 방법으로 얻어진 대사산물은 컴파운드 케이가 아니라, 진세노사이드 Rd가 주요 대사산물이다 (대한민국 등록특허공보 제10-0945587호; 한국식품영양학회지, 38권, 1084-1089 페이지, 2009).
또한, 컴파운드 케이의 제조방법으로서 다이올계 사포닌을 시판되고 있는 미생물이 유래의 각종 효소로 가수분해하여 컴파운드 케이를 제조하는 기술이 개발되어 있으나 (대한민국 등록특허공보 제10-1408985호, 대한민국 등록특허공보 제10-1158846호 등), 이들 효소들을 이용하여 식품 또는 식품첨가물용 생리활성 성분을 제조함에 있어서, 생물학적 안전성이나 독성이 명확하게 검증되지 않았을 뿐만 아니라, 컴파운드 케이의 생성 수율이 낮고, 효소를 분리 정제해야 하는 등 경제성 측면에서 어려움이 있었다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 오래전부터 약용으로 이용되어 온 버섯의 균사체가 생산하는 효소를 이용하여 인삼 중에 함량이 높은 다이올계 사포닌으로부터 희귀 사포닌의 제조방법을 개발할 목적으로 각종 버섯 균사체에서 얻어진 효소 분획을 사용하여 다각적인 시험을 실시한 결과 장수버섯 균사체 또는 장수버섯 균사체로부터 암모늄 썰페이트 침전에 의해 분리한 효소 분획이 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd 또는 이들의 혼합물과 반응시켰을 때, 반응조건에 따라 고수율로 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 또는 컴파운드 와이를 생성한다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 장수버섯 균사체 또는 장수버섯 균사체로부터 분리한 효소분획을 인삼에 다량 함유되어 있는 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd 또는 이들의 혼합물 또는 다이올계 사포닌 함량이 높은 각종 인삼 추출물에 처리하여 생물학적 방법으로 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 또는 컴파운드 와이를 간단하게 대량으로 제조하는 새로운 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 장수버섯 균사체를 수득하는 단계, 상기에서 수득한 장수버섯 균사체로부터 진세노사이드 가수분해 활성을 갖는 효소분획을 수득하는 단계, 상기에서 수득한 효소분획에 인삼에서 분리한 다이올계 사포닌을 첨가하고, 혼합하여 상기 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계, 상기에서 수득한 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 효소반응시켜 가수분해 생성물을 수득하는 단계, 및 상기에서 수득한 가수분해 생성물로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계를 포함하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 장수버섯 균사체를 수득하는 단계, 상기에서 수득한 장수버섯 균사체를 동결 건조하는 단계, 상기에서 수득한 동결 건조된 장수버섯 균사체에 인삼에서 분리한 다이올계 사포닌을 첨가하고, 혼합하여 상기 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계, 상기에서 수득한 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 효소반응시켜 가수분해 생성물을 수득하는 단계, 및 상기에서 수득한 가수분해 생성물로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계를 포함하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 희귀 인삼 사포닌을 제공한다.
본 발명에 의하면, 국내외에서 오래전부터 약용으로 이용되어 오고 있는 장수버섯을 배양하여 생산된 균사체에서 분리한 효소를 사용하여 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2로부터 천연 인삼에는 함유되어 있지 않은 희귀 사포닌인 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 또는 컴파운드 와이를 간단하면서도 고수율로 제조할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 다이올계 사포닌 분획이나 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획에 장수버섯에서 분리한 효소분획을 첨가 후 반응시킴으로서, 희귀 인삼 사포닌인 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이가 주성분으로 함유되어 있는 반응생성물을 간단하게 제조할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 장수버섯 균사체 추출물로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획으로 진세노사이드 Rb1, Rc 또는 Rb2를 96시간 가수분해시킨 후 박층 크로마토그래피에 의해 가수분해 생성물을 분석 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 장수버섯 균사체 추출물로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획으로 진세노사이드 Rb1, Rc 또는 Rb2를 96시간 가수분해시킨 후 Q-TOF-LC-MS로 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 장수버섯 균사체 추출물로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획으로 가수분해시켰을 때 진세노사이드 Rb1, Rc 또는 Rb2로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이의 생성 경로를 나타낸 것이다.
도 4는 인삼 다이올계 사포닌 분획을 장수버섯 균사체 추출물로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획과 반응시켰을 때 반응 시간별 다이올계 사포닌의 분해와 희귀사포닌의 생성 패턴을 박층 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획을 장수 균사체 추출물을 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획과 반응시켰을 때 반응 시간별 주요 구성 사포닌의 분해와 희귀 사포닌의 생성 패턴을 박층 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 장수버섯 균사체 추출물로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획으로 진세노사이드 Rb1, Rc 또는 Rb2를 96시간 가수분해시킨 후 Q-TOF-LC-MS로 분자량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 장수버섯 균사체 추출물로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획으로 가수분해시켰을 때 진세노사이드 Rb1, Rc 또는 Rb2로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이의 생성 경로를 나타낸 것이다.
도 4는 인삼 다이올계 사포닌 분획을 장수버섯 균사체 추출물로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획과 반응시켰을 때 반응 시간별 다이올계 사포닌의 분해와 희귀사포닌의 생성 패턴을 박층 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획을 장수 균사체 추출물을 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획과 반응시켰을 때 반응 시간별 주요 구성 사포닌의 분해와 희귀 사포닌의 생성 패턴을 박층 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 장수버섯 균사체를 수득하는 단계, 상기에서 수득한 장수버섯 균사체로부터 진세노사이드 가수분해 활성을 갖는 효소분획을 수득하는 단계, 상기에서 수득한 효소분획에 인삼에서 분리한 다이올계 사포닌을 첨가하고, 혼합하여 상기 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계, 상기에서 수득한 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 효소반응시켜 가수분해 생성물을 수득하는 단계, 및 상기에서 수득한 가수분해 생성물로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계를 포함하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 장수버섯 균사체를 수득하는 단계, 상기에서 수득한 장수버섯 균사체를 동결 건조하는 단계, 상기에서 수득한 동결 건조된 장수버섯 균사체에 인삼에서 분리한 다이올계 사포닌을 첨가하고, 혼합하여 상기 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계, 상기에서 수득한 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 효소반응시켜 가수분해 생성물을 수득하는 단계, 및 상기에서 수득한 가수분해 생성물로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계를 포함하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 장수버섯 균사체를 생산하는 단계는, 당화시킨 맥아 배지에 뽕나무 균사체를 접종한 후, 20∼30℃에서 4~6주간 배양한 다음, 균사체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 효소분획을 수득하는 단계는, 상기에서 수득한 장수버섯 균사체에 대하여 3~10배 중량비의 초산 완충용액으로 추출한 다음, 암모늄 설페이트를 40∼80 %(w/w)의 농도로 첨가하여 단백질을 침전시킨 다음, 이를 동결 건조시켜 사포닌 가수분해 활성을 갖는 효소분획을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계는, 상기 효소분획 0.05∼2 중량%에 인삼에서 분리한 다이올계 개별 사포닌 또는 다이올계 사포닌의 혼합물을 0.2∼3 중량% 농도로 pH 3~8의 완충용액 또는 완충용액과 유기용매의 혼합액에 용해시킨 다이올계 사포닌을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계는, 상기 동결 건조된 장수버섯 균사체 0.05∼2 중량%에 인삼에서 분리한 다이올계 개별 사포닌 또는 다이올계 사포닌의 혼합물을 0.2∼3 중량% 농도로 pH 3-8의 완충용액 또는 완충용액과 유기용매의 혼합액에 용해시킨 다이올계 사포닌을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 효소반응은 온도 20∼70℃의 수욕조에서 교반하면서 20∼120 시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계는, 가수분해 반응이 종료된 반응액을 열수 중에서 가열하여 상기 효소반응을 종료시킨 다음, 수포화 부탄올로 추출하여 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌이 용출된 부탄올 분획을 얻거나, 반응액을 미리 활성화시킨 비이온성 수지에 흡착시킨 다음, 수용성 알코올로 용출하여 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌이 함유된 용매분획을 얻는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계 후에, 상기 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌이 함유된 용매분획을 감압 농축하여 분말을 얻거나, 용매 분획을 칼럼 크로마토그래피로 정제된 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 인삼은 고려인삼, 미국인삼, 삼칠인삼, 히말리아산 인삼, 베트남 인삼 및 삼칠인삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 다이올계 사포닌은 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, 다이올계 사포닌 분획 및 인삼근의 조사포닌 분획으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 유기용매는 아세톤, 아세토니트릴 또는 탄소수 1~4의 저급 알코올일 수 있다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법에서, 상기 탄소수 1~4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서는 인삼의 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, 이들의 혼합물 또는 이러한 성분들이 함유되어 있는 인삼근 추출물을 물, pH 3∼8 범위의 완충용액 또는 완충용액과 수성 유기용매의 혼합액 중에서 장수버섯 균사체 또는 장수버섯 균사체로부터 분리된 효소분획과 반응시키면, 단기간 내에 프로토파낙사다이올의 C3 위치의 베타-글루코시드 결합이 분해되어 당류들이 떨어지고 C20 위치에 글루코스가 한 개 결합되어 있거나, 아라비노스(arabinose)와 글루코스가 각각 1분자씩 결합되어 있는 컴파운드 엠씨 또는 컴파운드 와이가 단시간내에 고수율로 생성된다.
본 발명에 사용되는 용매로는 물, 완충용액과 같은 효소의 활성을 저하시키지 않는 수성용매를 사용하는 것이 좋다. 가장 바람직한 수성용매로는 pH 3∼8, 특히 pH 4∼5범위의 완충용액이 바람직하다.
상기 수성 용매는 단독으로 사용할 수도 있으나 다른 수성 용매 및 수성 유기용매와 혼합하여 사용할 수도 있는데, 혼합하여 사용할 수 있는 유기용매는 물과 혼화되면서 효소의 활성을 저하시키지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 아세톤, 아세토니트릴 등이 있으며, 물 또는 완충용액에 대한 수성 유기용매의 혼합비율은 효소의 활성을 저해하지 않는 다면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 5∼40% 범위가 바람직하다.
반응 온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도 조건이어야 하는데, 물 또는 완충용액과 같은 수성용매만을 사용하는 경우는 70℃ 이하가 바람직하고, 수성용매와 유기용매의 혼합액을 사용하는 경우는 40℃ 이하가 바람직하다.
본 발명에 사용되는 반응시간 역시 효소의 활성이 유지되는 기간이라면 특별히 제한을 받지 않으나, 24∼150시간, 바람직하게는 48∼96시간이 선호된다.
본 발명에 의한 희귀 사포닌의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rc 또는 진세노사이드 Rb2를 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고, 장수버섯 균사체 또는 장수버섯 균사체에서 암모늄 설페이트 침전에 의해 분리된 효소 분획 또는 이들의 동결건조분말을 가하고, 20∼60℃에서 24∼120시간 반응시킨 후 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨다.
이와 같은 방법에 의하면 반응 조건에 따라서 진세노사이드 Rb1으로 부터는 컴파운드 케이, 진세노사이드 Rc로부터는 컴파운드 엠씨, 그리고 진세노사이드 Rb2로 부터는 컴파운드 와이가 고수율로 생성된다.
도 1은 진세노사이드 Rb1, Rc 또는 Rb2를 함유하는 완충용액에 장수버섯 균사체로부터 암모늄 설페이트 침전에 의해 분리된 효소분획의 동결건조분말을 첨가 후 96시간 반응액을 박층 크로마토그래피에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 각각의 가수분해 생성물을 Q-TOF-LC-MS로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 3은 각각의 가수분해물을 표준품과 박층크로마토그래피에 의한 Rf값 및 고속액체크로마토그래피에 의해 비교 분석한 결과를 바탕으로 가수분해 경로를 나타낸 것이다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌에 관한 것이다.
본 발명의 상기 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌에서, 상기 희귀 인삼 사포닌은 하기 화학식 1의 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및/또는 컴파운드 와이이다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1〉
맥아 배지에 장수버섯을 접종 후 24-28℃에서 2주간 진탕 배양하여 생산된 균사체를 증류수로 세척한 다음 약 3배량의 100mM 인산 완충용액 (pH 6.5)을 가하고 1주야 교반하여 효소를 추출하였다.
추출 용액을 원심분리(9000 rpm, 15분)하여 침전을 분리 제거하고, 상등액에 암모늄 설페이트(40~80%)를 가한 다음, 원심분리(9000 rpm, 15분)하여 생성된 침전 분획을 회수하였다.
상기 회수한 침전 분획을 10mM 인산 완충용액 (pH 6.5)내에서 1주야 투석 처리한 다음 원심분리하여 생성된 침전을 제거하고, 상층액을 동결건조하여 효소원으로 사용하였다.
이어서, 진세노사이드 Rb1 0.4g을 미리 메탄올 5ml에 용해시킨 다음, 여기에 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)을 가하여 50㎖로 정용한 다음, 여기에 장수버섯 균사체로서 분리하여 동결건조한 암모늄 썰페이트 침전분획 100mg 첨가하고 45℃에서 교반하면서 96시간 반응시켰다.
박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 같이 컴파운드 케이가 70% 이상 함유된 분말상 반응 생성물을 얻었다.
반응 생성물을 다시 용출 용매로서 클로로포름-메탄올-물(65,35:10, 하층)을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 액체크로마토그래피에 의한 분석에 의해 순도가 95% 이상인 컴파운드 케이 150mg을 얻었다.
<실시예 2〉
진세노사이드 Rc 0.2g을 미리 메탄올에 5ml에 용해시킨 후, 여기에 0.1M 초산 완충용액(pH 4.5)을 가하여 100㎖로 정용한 다음, 여기에 상기 실시예 1에서와 같이 장수버섯 균사체로서 분리하여 동결 건조한 암모늄 설페이트 침전으로 얻어진 효소분획 분말 100mg 첨가하고, 37℃ 수욕조상에서 교반하면서 96시간 반응시켰다.
박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 미리 활성화시킨 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후, 당류와 효소는 증류수로 용출시켜 제거하였다.
이어서, 100% 에탄올로 용출시켜 얻어진 용출액을 갑압 농축하여 컴파운드 엠씨(compound Mc)가 85%이상 함유된 분말상 반응 생성물 120 mg을 얻었다.
<실시예 3〉
진세노사이드 Rb2 0.1g을 초산 완충용액(pH 4.5)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음, 여기에 상기 실시예 1에서와 같이 얻어진 효소분획 분말 100mg을 첨가하여 50℃ 수욕조상에서 교반하면서 96시간 반응시켰다.
반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 컴파운드 케이와 컴파운드 와이가 60% 이상 함유된 분말상의 반응 생성물을 얻었다.
이어서, 반응 생성물은 다시 용출 용매로서 클로로포름-메탄올-물(65:35:10, 하층)을 사용한 실리카겔 컴럼 크로마토그래피를 실시하여 액체크로마토그래피에 의해 순도가 95% 이상인 컴파운드 와이 45mg을 얻었다.
<실시예 4〉
진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd가 53:24:17:6의 비율로 혼합된 다이올계 사포닌 1g을 미리 메탄올 5ml을 가하여 용해시키고, 여기에 초산 완충용액 (pH 4.5)에 95 ml를 가하여 전체를 100㎖로 정용하였다.
이어서, 상기 실시예 1에서와 같이 분리된 효소 분획 500mg을 가한 다음, 40℃ 수욕조상에서 교반하면서 96시간 반응시킨 후, 반응액을 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 미리 활성화시킨 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하였다.
이어서, 컬럼에 흡착된 가수분해 생산물을 100% 에탄올로 용출시킨 다음, 농축하여 도 4에서와 같이 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2 및 Rd가 거의 함유되어 있지 않고, 희귀 사포닌인 컴파운드 케이와, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이가 주성분으로 함유되어 있는 분말상 반응 생성물 350mg을 얻었다.
<실시예 5〉
4년근 인삼근에서 분리한 조사포닌(total saponin) 분획 1g을 미리 메탄올 5ml에 용해시키고, 여기에 초산 완충용액(pH 4.5)을 가하여 전체를 50㎖로 정용한 다음, 상기 실시예 1에서와 같이 얻어진 효소 분획 500mg을 가한 다음 37℃의 수욕조상에서 교반하면서 120시간 반응시켰다.
반응액을 비등 수욕조에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 수포화 부탄올로 추출한 다음, 감압 농축하여 트라이올계 사포닌인 진세노사이드 Re와 Rg1과 함께, 다이올계 사포닌에서는 컴파운드 케이 이외에 천연 인삼에는 함유되어 있지 않은 컴파운드 엠씨와 컴파운드 와이가 함유된 반응 생성물 490mg을 얻었다.
도 5는 인삼근에서 추출한 조사포닌 분획을 장수 균사체 추출물을 암모늄 설페이트 침전에 의해 얻어진 효소 분획과 반응시켰을 때 반응 시간별 주요 구성 사포닌의 분해와 희귀 사포닌의 생성 패턴을 박층 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법은, 국내외에서 오래전부터 약용으로 이용되어 오고 있는 장수버섯을 배양하여 생산된 균사체에서 분리한 효소를 사용하여 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2로부터 천연 인삼에는 함유되어 있지 않은 희귀 사포닌인 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 또는 컴파운드 와이를 간단하면서도 고수율로 제조할 수 있는 장점이 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.
Claims (14)
- 장수버섯 균사체를 수득하는 단계;
상기에서 수득한 장수버섯 균사체로부터 진세노사이드 가수분해 활성을 갖는 효소분획을 수득하는 단계;
상기에서 수득한 효소분획에 인삼에서 분리한 다이올계 사포닌을 첨가하고, 혼합하여 상기 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계;
상기에서 수득한 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 효소반응시켜 가수분해 생성물을 수득하는 단계; 및
상기에서 수득한 가수분해 생성물로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계를 포함하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법. - 장수버섯 균사체를 수득하는 단계;
상기에서 수득한 장수버섯 균사체를 동결 건조하는 단계;
상기에서 수득한 동결 건조된 장수버섯 균사체에 인삼에서 분리한 다이올계 사포닌을 첨가하고, 혼합하여 상기 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계;
상기에서 수득한 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 효소반응시켜 가수분해 생성물을 수득하는 단계; 및
상기에서 수득한 가수분해 생성물로부터 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계를 포함하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 장수버섯 균사체를 생산하는 단계는, 당화시킨 맥아 배지에 뽕나무 균사체를 접종한 후, 20∼30℃에서 4~6주간 배양한 다음, 균사체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 효소분획을 수득하는 단계는, 상기에서 수득한 장수버섯 균사체에 대하여 3~10배 중량비의 초산 완충용액으로 추출한 다음, 암모늄 설페이트를 40∼80 %(w/w)의 농도로 첨가하여 단백질을 침전시킨 다음, 이를 동결 건조시켜 사포닌 가수분해 활성을 갖는 효소분획을 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 효소분획과 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계는, 상기 효소분획 0.05∼1 중량%에 인삼에서 분리한 다이올계 개별 사포닌 또는 다이올계 사포닌의 혼합물을 0.2∼3 중량% 농도로 pH 3~8의 완충용액 또는 완충용액과 유기용매의 혼합액에 용해시킨 다이올계 사포닌을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 동결 건조된 장수버섯 균사체와 다이올계 사포닌의 혼합물을 수득하는 단계는, 상기 동결 건조된 장수버섯 균사체 0.05∼2 중량%에 인삼에서 분리한 다이올계 개별 사포닌 또는 다이올계 사포닌의 혼합물을 0.2∼3 중량% 농도로 pH 3~8의 완충용액 또는 완충용액과 유기용매의 혼합액에 용해시킨 다이올계 사포닌을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소반응은 온도 20∼70℃의 수욕조에서 교반하면서 20∼120 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계는, 가수분해 반응이 종료된 반응액을 열수 중에서 가열하여 상기 효소반응을 종료시킨 다음, 수포화 부탄올로 추출하여 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌이 용출된 부탄올 분획을 얻거나, 반응액을 미리 활성화시킨 비이온성 수지에 흡착시킨 다음, 수용성 알코올로 용출하여 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌이 함유된 용매분획을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 희귀 인삼 사포닌을 분리하는 단계 후에, 상기 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌이 함유된 용매분획을 감압 농축하여 분말을 얻거나, 용매 분획을 칼럼 크로마토그래피로 정제된 컴파운드 케이, 컴파운드 엠씨 및 컴파운드 와이로 이루어진 군에서 선택되는 희귀 인삼 사포닌을 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인삼은 고려인삼, 미국인삼, 삼칠인삼, 히말리아산 인삼, 베트남 인삼 및 삼칠인삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다이올계 사포닌은 진세노사이드 Rb1, Rc, Rb2, Rd, 다이올계 사포닌 분획 및 인삼근의 조사포닌 분획으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 유기용매는 아세톤, 아세토니트릴 또는 탄소수 1~4의 저급 알코올인 것을 특징으로 하는, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌.
- 제9항의 방법에 의해 제조된, 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌.
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