CN104561219A - 一种酶促合成人参皂苷Rh2的方法 - Google Patents

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夏咏梅
方云
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Abstract

本发明公开了一种酶促合成人参皂苷Rh2((3β,12β)-12,20-Dihydroxydammar-24-en-3-ylβ-D-glucopyranoside)的方法。属于天然化合物的合成技术领域。本发明以来源于米曲霉的糖基水解酶为催化剂选择性催化水解人参皂苷Rg3，以制备在人参中含量稀少且具有更高药理作用的人参皂苷Rh2。该方法具有高选择性、高转化率、反应迅速和反应条件温和等优点。本发明提供了一种高效、环境友好的新方法以制备人参皂苷Rh2。参考文献：1.HouJ,XueJ,WangC,etal.JMicrobiolBiotechnol,2012,28(4):1807-18112.SuJ-H,XuJ-H,LuW-Y,etal.JmolcatalB-enzym:Enzymatic,2006,38(2):113-118。

Description

一种酶促合成人参皂苷Rh2的方法
技术领域
本发明属于天然化合物的合成技术领域，具体涉及一种酶促合成人参皂苷Rh2的方法。
背景技术
作为一类三萜化合物，人参皂苷(ginsenoside，Rx)是名贵中草药人参中起药理活性的主成分，具有抗肿瘤、、提高机体免疫力、抗疲劳、抗菌、延缓衰老等作用。目前已经发现数十种人参皂苷，约占人参组成的4％左右，可以根据苷元的不同人参皂苷主要分四大类：原人参二醇型(protopanaxadiol，简称PPD)、原人参三醇型(protopanaxatriol，简称PPT型)、齐墩果酸型和奥克梯隆醇型。皂苷苷元、糖基数目和C20处构型是影响抗肿瘤活性的主要因素：齐墩果酸型>原人参二醇型>原人参三醇型；单糖苷>二糖苷>三糖苷>四糖苷；20(R)人参皂苷>20(S)人参皂苷。原人参二醇型人参皂苷在人参提取物中含量最高，其中人参皂苷Rg3和人参皂苷Rh2为典型代表，Rh2可以看作Rg3部分降解生成的次级苷。由上述构效关系，人参皂苷Rh2的药理活性更高，并且由药代动力学可知Rh2口服生物利用度高于Rg3，因而Rh2具有更高的附加值。但Rh2含量比Rg3稀少，在红参含量仅为十万分之一，而在白参中未发现含有Rh2。
制备人参皂苷Rh2主要由两条途径，一是由原人参二醇或人参二醇苷元出发，通过单糖基化得到Rh2，但步骤繁琐，且需要保护基的参与；其二根据分子结构式，定向选择性水解Rg3结构中C3位的β-1,2葡萄糖苷键即可得Rh2(式1)。在无机酸水解Rg3过程中Rh2仅作为中间体，其会被进一步水解最终只得到苷元原人参二醇和苷元的环化物人参二醇。由于糖苷酶的高区域选择性，成为制备Rh2的最有效的手段之一。已报到来源于Esteya vermicola CNU 120806粗酶液和来源于Fusarium proliferatum ECU2042的β-葡萄糖苷酶可以催化Rg3变成Rh2[1-2]；发酵法也可以制备Rh2，但这些方法均存在底物浓度、产率和转化率低等缺点。
发明内容
Rh2具有抗肿瘤、提高免疫力等药理活性。本发明公开了一种酶促合成人参皂苷Rh2的方法，属于天然化合物的合成技术领域。通过形成复合物的形式，提供高人参皂苷Rg3在水中的溶解度，从而提高生产效率。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
以含有人参皂苷Rg3的复合物为底物，配制成0.5mg/mL-5mg/mL的水溶液，用缓冲液调整溶液pH至4.0-7.0；在50℃-65℃下恒温0.5h后，按照催化剂与Rg3质量比1:5-1:100加入酶；25℃-65℃下反应3h-48h；然后通过醇沉去酶蛋白及增溶剂；反应液经冷冻干燥即可得人参皂苷Rh2。
Rg3在水中的溶解度极小，小于0.05mg/mL(25℃)。虽然Rg3能够溶于甲醇和乙醇，但醇会使酶失活。为了解决人参皂苷Rg3在水中的溶解度，通过增溶剂形成复合物：首先将β-环糊精(β-cyclodextrin，β-CD)或羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)配制成200mg/mL水溶液，共计25mL在25℃下恒温；将20(R)-Rg3或20(S)-Rg3超声溶解在乙醇中，浓度为3mg/mL；然后将Rg3的乙醇溶液缓慢滴加进入环糊精的水溶液中，并持续搅拌6h；冷冻干燥后可以得到人参皂苷Rg3的粉末状复合物。
20(R)-人参皂苷Rg3和20(S)-人参皂苷Rg3分别为底物时，可以生成对应的产物20(R)-人参皂苷Rh2、20(S)-人参皂苷Rh2，产率可以达到98％以上。
本发明使用的催化剂是含有糖基水解酶的米曲霉、米曲霉中提取出的糖基水解酶，反应最适温度为50℃-65℃，适宜的pH为4.0-7.0。
本发明的有益效果：提供了一种一步法合成人参皂苷Rh2，该方法具有反应温和、选择性和产率高且产品易分离等优点。以复合物的形式，增加了底物Rg3的浓度，从而大大提高了生产效率。并且这种酶促催化方法对制备R型和S型Rh2均适用。
附图说明
图1反应液和Rh2标准品的总离子流图(1为反应0h取样，4.00min为20(S)-Rg3；2为反应12h时取样；3为20(S)-Rh2标准品)
图2人参皂苷样品的质谱图(1为20(S)-Rg3；2为酶催化产物；3为20(S)-Rh2标准品)
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，其目的仅在于更好的说明本发明的内容但并不以任何方式限制本发明。
实施例1
首先制备HP-β-CD与20(S)-Rg3的复合物，冷冻干燥的白色粉末，收率为95.2％，其中20(S)-Rg3的含量为3％；将20(S)-Rg3的按照复合物配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；50℃下恒温0.5h后加入米曲霉4mg，反应12h后进行HPLC和LC-MS分析。由图1可知12h后全部转化为Rh2，图2表示二者的质谱图([MRg3-H]-，738.6；[MRg3-H+HCOOH]-，829.6；[2MRg3-H]-，1568.2；[MRh2-H+HCOOH]-，667.5；[2MRh2-H+HCOOH]-，1290.0)。将反应液加热煮沸3min灭酶活，离心去上清液，加入80％乙醇溶液除去HP-β-CD，最后冷冻干燥得13.5mg Rh2样品。
实施例2
首先制备HP-β-CD与20(R)-Rg3的复合物，冷冻干燥的白色粉末，收率为96.0％，20(R)-Rg3的含量为3％；将20(R)-Rg3的按照复合物配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；50℃下恒温0.5h后加入米曲霉4mg，反应12h后进行HPLC，转化率为98.9％。将反应液加热煮沸3min灭酶活，离心去上清液，加入80％乙醇溶液除去HP-β-CD，最后冷冻干 燥得12.5mg 20(R)-Rh2样品。
实施例3
首先制备β-CD与20(S)-Rg3的复合物，冷冻干燥的白色粉末，收率为91.5％，20(S)-Rg3的含量为3％；将20(S)-Rg3的按照复合物配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；50℃下恒温0.5h后加入米曲霉4mg，反应12h后进行HPLC，转化率为95.6％。将反应液加热煮沸3min灭酶活，离心去上清液，加入80％乙醇溶液除去β-CD，最后冷冻干燥得11.6mg20(S)-Rh2样品。
实施例4
首先制备β-CD与20(R)-Rg3的复合物，冷冻干燥的白色粉末，收率为92.3％，20(R)-Rg3的含量为3％；将20(R)-Rg3的按照复合物配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；50℃下恒温0.5h后加入米曲霉4mg，反应12h后进行HPLC，转化率为95.6％。将反应液加热煮沸3min灭酶活，离心去上清液，加入80％乙醇溶液除去β-CD，最后冷冻干燥得10.3mg20(S)-Rh2样品。
实施例5
将实施例1中制备HP-β-CD与20(S)-Rg3的复合物，按照20(S)-Rg3配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；50℃下恒温0.5h后加入从米曲霉中提取的糖基水解酶粉0.5mg，反应24h后进行HPLC分析，Rg3全部转化为Rh2。
实施例6
将实施例1中制备HP-β-CD与20(S)-Rg3的复合物，按照20(S)-Rg3配制成5mg/mL的溶液，共计20mL；50℃下恒温0.5h后加入从米曲霉中提取的糖基水解酶粉2.5mg，反应24h后进行HPLC分析，Rg3全部转化为Rh2。
实施例7
将实施例1中制备HP-β-CD与20(S)-Rg3的复合物，按照20(S)-Rg3配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；60℃下恒温0.5h后加入米曲霉4mg，反应3h后进行HPLC分析，Rg3就全部转化为Rh2。
实施例8
将实施例1中制备HP-β-CD与20(S)-Rg3的复合物，按照20(S)-Rg3配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；65℃下恒温0.5h后加入米曲霉4mg，反应1h后进行HPLC分析，Rg3就全部转化为Rh2。
实施例9
将实施例2中制备HP-β-CD与20(R)-Rg3的复合物，按照20(S)-Rg3配制成2.5mg/mL的溶液，共计20mL；65℃下恒温0.5h后加入米曲霉5mg，反应0.75h后进行HPLC分析，Rg3就全部转化为Rh2。
实施例10
将实施例1中制备HP-β-CD与20(S)-Rg3的复合物，按照20(S)-Rg3配制成1mg/mL的溶液，共计20mL；65℃下恒温0.5h后加入从米曲霉中提取的糖基水解酶粉2.5mg，反应1.5h后进行HPLC分析，Rg3就全部转化为Rh2。

Claims (4)

1.一种酶促合成人参皂苷Rh2的方法，其特征在于以含有人参皂苷Rg3的复合物为底物，配制成0.5mg/mL-5mg/mL的水溶液，用缓冲液调整溶液pH至4.0-7.0；在50℃-65℃下恒温0.5h后，按照催化剂与Rg3质量比1:5-1:100加入含有糖基水解酶的米曲霉或相应的糖基水解酶；25℃-65℃下反应3h-48h；然后通过醇沉去酶蛋白及增溶剂，反应液经冷冻干燥即可得人参皂苷Rh2。
2.根据权利要求1所述的酶促合成人参皂苷Rh2的方法，所述的含有人参皂苷Rg3的复合物，其特征是用β-环糊精或羟丙基-β-环糊精为增溶剂与人参皂苷形成复合物，使Rg3在水中的溶解度由17μg/mL提至0.5mg/mL-5mg/mL。
3.根据权利要求1所述的酶促合成人参皂苷Rh2的方法，其特征是所述的Rg3为20(R)-人参皂苷Rg3或20(S)-人参皂苷Rg3或其对映体混合物，分别生成对应的产物20(R)-人参皂苷Rh2或20(S)-人参皂苷Rh2或人参皂苷Rh2对映体混合物。
4.根据权利要求1所述的酶促合成人参皂苷Rh2的方法，其特征是所用酶可以是含有糖基水解酶的米曲霉或从米曲霉中提取出的糖基水解酶。
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