CN110845536B - 一种含膦酸酯的酰腙衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种含膦酸酯的酰腙衍生物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含膦酸酯的酰腙衍生物及其制备方法和用途，该含膦酸酯的酰腙衍生物结构通式为：

Description

一种含膦酸酯的酰腙衍生物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药用新化合物领域，具体地说涉及一种含膦酸酯的酰腙衍生物及其制备方法和用途。
背景技术
烟草花叶病毒是在植物中普遍存在的一种植物病毒，又称“植物癌症”，能感染许多植物，植物一旦被植物病毒感染，就很难防治，每年造成非常大的经济损失。目前，农药市场上抗植物病毒药剂主要有：宁南霉素、香菇多糖、毒氟磷、病毒唑、壳寡糖、DADHT等，已在实际当中投入应用，但是预防效果大多在60％以下。
与此同时，恶性癌症严重威胁着人类的生命。其中，肝癌是导致人类死亡最主要的癌症之一。在医药市场上抗肝癌化疗药物主要有：顺铂、5-氟脲嘧啶或氟脲苷、表阿霉素或阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤、羟喜树碱等。
而目前还未能研发出对人类肝癌细胞和烟草花叶病毒均具有非常好的抑制效果的化合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种对人类肝癌细胞和烟草花叶病毒均具有非常好的抑制效果的含膦酸酯的酰腙衍生物及其制备方法和用途。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种含膦酸酯的酰腙衍生物，其结构通式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0002291430000000011
其中，R表示任意位置的单取代或双取代的取代基，且取代基选自(当R为双取代的取代基时，双取代的取代基是各自独立的选自)氢原子、卤素原子、羟基、甲基、甲氧基、硝基。
进一步地，所述含膦酸酯的酰腙衍生物的结构式如式(1)或式(2)或式(3)或式(4)或式(5)或式(6)或式(7)或式(8)或式(9)或式(10)或式(11)或式(12)或式(13)所示：
Figure BDA0002291430000000021
Figure BDA0002291430000000031
Figure BDA0002291430000000041
本发明提供上述含膦酸酯的酰腙衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)以对羟基苯甲醛和溴乙酸乙酯为原料，制备4-甲酰基苯氧基乙酸乙酯；
(2)以步骤(1)的产物4-甲酰基苯氧基乙酸乙酯为原料，通过缩合反应，与2-氨-4-甲基苯并噻唑制备对应的亚胺，在一锅法下，通过亲核加成，继续与亚磷酸二乙酯反应，制备含苯并噻唑杂环的膦酸酯；
(3)以步骤(2)的产物含苯并噻唑杂环的膦酸酯为原料，与水合肼反应，制备含苯并噻唑杂环的膦酸酯酰肼；
(4)以步骤(3)的产物膦酸酯酰肼为原料，与含有目标取代基R的芳香醛反应，制备含膦酸酯的酰腙衍生物。
本发明还提供上述含膦酸酯的酰腙衍生物在制备抗烟草花叶病毒病农药中的应用以及在制备抗肝癌药物中的应用。
具体可以提供一种包含上述含膦酸酯的酰腙衍生物的抗烟草花叶病毒病农药以及提供一种包含上述含膦酸酯的酰腙衍生物的抗肝癌药物。具体制备方法可参照制药领域的常规方法制备，添加或不添加制药领域通用的辅料。
本发明的有益效果体现在：
本发明设计了一种含膦酸酯的酰腙衍生物的新化合物，对人类肝癌细胞和烟草花叶病毒均具有非常好的抑制效果，且本发明含膦酸酯的酰腙衍生物的制备方法简单易行，合成收率在70％以上，实用性好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
以下实施例所使用的各种原料，如未作特别说明，均为本领域公知的市售产品。
实施例1
含膦酸酯的酰腙衍生物的制备
第一步：4-甲酰基苯氧基乙酸乙酯中间体的制备
合成路线如下：
Figure BDA0002291430000000051
将12.2g对羟基苯甲醛(100mmol)加入到250mL三口瓶中，然后再加入16.7g溴代乙酸乙酯(100mmol)和100mL乙腈溶剂，再加入13.8g碳酸钾(100mmol)。将上述的反应瓶置于78-80℃油浴中进行搅拌反应，采用TCL跟踪反应(其中展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1，V/V)，直到原料对羟基苯甲醛反应完全，停止反应，得到粗产物。粗产物经水泵减压旋转脱去溶剂乙腈，然后向粗产物中加入100mL饱和食盐水，分别用50mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，再经无水硫酸钠干燥，减压旋转脱溶，得到粗品，再用混合溶剂石油醚和乙腈(体积比为4:1)进行重结晶得到16.8g白色固体，即为4-甲酰基苯氧基乙酸乙酯，产率为81％，核磁数据为：1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.87(s,1H),7.93–7.77(m,2H),7.12(d,J＝8.7Hz,2H),4.92(s,2H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(151MHz,DMSO)δ191.79(s),168.66(s),162.95(s),132.17(s),130.65(s),115.52(s),65.23(s),61.29(s),14.48(s).
第二步：含苯并噻唑杂环的膦酸酯中间体的制备
合成路线如下：
Figure BDA0002291430000000061
将16.64g 4-甲酰基苯氧基乙酸乙酯(80mmol)加入到250mL三口瓶中，然后加入13.12g 2-氨基-4-甲基苯并噻唑(80mmol)和100mL甲苯溶剂，再加入0.48g醋酸(8mmol)。将含上述反应瓶接上分水器和回流冷凝管置于加热套中进行搅拌并加热回流6小时，溶液由无色变为黄色溶液，接着加入22.08g亚磷酸乙酯(160mmol)，加热回流4小时，停止反应。向反应瓶中加入100mL5％NaOH，转移至分液漏斗中，分别用50mL乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，再经无水硫酸钠干燥，减压旋转脱溶，得到粗产物，再用乙醇对粗产物进行重结晶，得到38.4g白色固体，即为含苯并噻唑杂环的膦酸酯，其产率为78％，熔点为128～130℃，核磁数据为：1H NMR(600MHz,DMSO)δ8.89(dd,J＝9.6,2.9Hz,1H),7.43(dd,J＝14.9,7.5Hz,3H),7.01(d,J＝7.3Hz,1H),6.96–6.84(m,3H),5.58(dd,J＝21.0,9.6Hz,1H),4.73(s,2H),4.12(q,J＝7.1Hz,2H),4.08–3.96(m,2H),3.94–3.86(m,1H),3.84–3.76(m,1H),2.41(s,3H),1.16(t,J＝7.1Hz,3H),1.13(t,J＝7.0Hz,3H),1.03(t,J＝7.0Hz,3H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ169.13(s),164.99(d,J＝9.7Hz),157.67(s),150.92(s),130.76(s),129.91(d,J＝5.7Hz),129.01(s),128.00(s),126.68(s),121.69(s),118.86(s),114.75(s),65.13(s),63.07(d,J＝6.7Hz),62.86(d,J＝6.8Hz),61.09(s),54.84(s),53.81(s),18.41(s),16.72(d,J＝5.4Hz),16.53(d,J＝5.4Hz),14.48(s).
第三步：膦酸酯酰肼中间体的制备
合成路线如下：
Figure BDA0002291430000000071
将30.0g含苯并噻唑杂环的膦酸酯中间体(60mmol)和50mL乙醇溶剂加入到250mL三口瓶中，然后在三口瓶上接上恒压滴液漏斗，在恒压滴液漏斗中加入2.8g 80％水合肼(70mmol)和50mL乙醇混合溶液，最后将反应瓶置于80℃油浴中进行搅拌，而恒压滴液漏斗液体以每秒1滴速度进行滴加，直到滴加完混合液，再反应6小时，停止反应，减压旋转脱溶，得到粗产物，再用乙醇进行重结晶得到28.7g白色固体，即为膦酸酯酰肼，其产率为71％，熔点为126～138℃，核磁数据如下：1H NMR(600MHz,DMSO)δ9.29(s,1H),8.92–8.85(m,1H),7.49–7.38(m,3H),7.01(d,J＝7.4Hz,1H),6.96–6.87(m,3H),5.57(dd,J＝21.0,9.5Hz,1H),4.44(s,2H),4.32(s,2H),4.08–3.95(m,2H),3.93–3.87(m,1H),3.83–3.77(m,1H),2.40(s,3H),1.13(t,J＝7.0Hz,3H),1.04(t,J＝7.0Hz,3H)。
第四步：含膦酸酯的酰腙衍生物的制备
合成路线如下：
Figure BDA0002291430000000072
本步是为了制备目标产物含膦酸酯的酰腙衍生物，与含有不同取代基的芳香醛反应，即可制得含有不同取代基的目标产物，下面提供13种含膦酸酯的酰腙衍生物(以下依次编号记作为M1至M13)的具体制备实例：
1.M1：O O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-苯亚甲基乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
准确称取上述制备好的膦酸酯酰肼中间体0.9570g(2mmol)、苯甲醛0.212g(2mmol)依次加入到50mL单口烧瓶中，然后加入15mL无水乙醇和醋酸0.012g(0.2mmol)于反应瓶内。将上述的混合物置于78～80℃油浴中进行搅拌反应，采用TCL跟踪反应(其中展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：4，V/V)，待到反应液中的原料点膦酸酯酰肼消失，停止反应，得到粗产物。将含粗产物的单口反应瓶在水泵旋转蒸发仪进行减压脱去溶剂乙醇，再加入10mL去离子水搅拌即出现大量的白色固体，用蒸馏水洗涤2到3次，过滤得粗产品，用体积比为2：1无水乙醇和二氯甲烷混合溶剂重结晶得到0.97g目标产物，熔点为184～186℃，产率为86％，结构式如式(1)所示：
Figure BDA0002291430000000081
2.M2：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(2-氯苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于，以邻氯苯甲醛为原料。区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL去离子水搅拌即出现大量的白色固体，过滤得粗产品，用体积比为2：1无水乙醇和二氯甲烷混合溶剂重结晶得到0.99g目标产物，熔点为160～161℃，产率为82％，结构式如式(2)所示：
Figure BDA0002291430000000082
3.M3：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(2-氟苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于，以邻氟苯甲醛为原料。区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，用体积比为2：1无水乙醇和二氯甲烷混合溶剂重结晶得到1.0g目标产物，熔点为172～174℃，产率为92％，结构式如式(3)所示：
Figure BDA0002291430000000091
4.M4：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(2-硝基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于，以邻硝基苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，再用适量的无水乙醇洗涤粗产品得到1.06g目标产物，熔点为151～153℃，产率为87％，结构式如式(4)所示：
Figure BDA0002291430000000092
5.M5：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(4-溴苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于以对溴苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，再用适量的无水乙醇重结晶得到0.96g目标产物，熔点为205～207℃，产率为74％，结构式如式(5)所示：
Figure BDA0002291430000000093
6.M6：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(4-甲基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于以对甲基苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，再用适量的无水乙醇重结晶得到1.06g目标产物，熔点为191～193℃，产率为91％，结构式如式(6)所示：
Figure BDA0002291430000000101
7.M7：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(4-硝基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的合成，如实施M1中方法和条件一致，区别在于以对硝基苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，再用适量的无水乙醇洗涤粗产品得到1.12g目标产物，熔点为233～235℃，产率为92％，结构式如式(7)所示：
Figure BDA0002291430000000102
8.M8：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(3-甲基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于以3-甲基苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，再用适量的无水乙醇重结晶得到0.93g目标产物，熔点为173～175℃，产率为83％，结构式如式(8)所示：
Figure BDA0002291430000000111
9.M9：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(3-氯苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于以3-氯苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，再用适量的无水乙醇重结晶得到1.05g目标产物，熔点为172～174℃，产率为87％，结构式如式(9)所示：
Figure BDA0002291430000000112
10.M10：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(3-硝基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于以3-硝基苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：将反应液通过减压旋转去除溶剂，再加入10mL水洗涤2到3次，过滤去除醋酸得到粗产品，再用适量的无水乙醇洗涤粗产品得到1.15g目标产物，熔点为182～184℃，产率为94％，结构式如式(10)所示：
Figure BDA0002291430000000113
11.M11：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(2-羟基-5-甲基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M1中方法和条件一致，区别在于以2-羟基-5-甲基苯甲醛为原料，反应溶剂为正丁醇，区别还在于后处理为：反应液转入250mL分液漏斗中，加入50mL水，萃取，去除水相，有机相通过减压旋转去除溶剂，采用洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯＝1:2)过柱，得到0.92g目标产物，熔点为172～173℃，产率为77％，结构式如式(11)所示：
Figure BDA0002291430000000121
12.M12：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(3-氟-4-羟基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M11中方法和条件一致，区别在于以3-氟-4-羟基苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：反应液转入250mL分液漏斗中，加入50mL水，萃取，去除水相，有机相通过减压旋转去除溶剂，采用洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯＝1:4)过柱，得到1.01g目标产物，熔点为214～216℃，产率为84％，结构式如式(12)所示：
Figure BDA0002291430000000122
13.M13：O,O’-二乙基-1-(4-甲基苯并[d]噻唑-2-氨基)-1-[4-(N-(3-氯-4-羟基苯亚甲基)乙酰肼基氧基)]-苯基甲基膦酸酯的制备：
如制备M11中方法和条件一致，区别在于以3-氯-4-羟基苯甲醛为原料，区别还在于后处理为：反应液转入250mL分液漏斗中，加入50mL水，萃取，去除水相，有机相通过减压旋转去除溶剂，采用洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯＝1:3)过柱，得到1.0g目标产物，熔点为233～234℃，产率为81％，结构式如式(13)所示：
Figure BDA0002291430000000131
含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的产率、理化性质、核磁共振氢谱数据、核磁共振碳谱数据、红外光谱数据、高分辨质谱数据见表1至5，可以证明含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的结构。
表1含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的产率和理化性质
化合物编号 理化性质 产率(％) 熔点(摄氏度)
M1 白色固体 86 184～186
M2 白色固体 82 160～161
M3 白色固体 92 172～174
M4 白色固体 87 151～153
M5 白色固体 74 205～207
M6 白色固体 91 191～193
M7 白色固体 92 233～235
M8 白色固体 83 173～175
M9 白色固体 87 172～174
M10 白色固体 94 182～184
M11 白色固体 77 172～173
M12 白色固体 84 214～216
M13 白色固体 81 233～234
表2含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的核磁共振氢谱数据
Figure BDA0002291430000000132
Figure BDA0002291430000000141
Figure BDA0002291430000000151
表3含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的核磁共振碳谱数据
Figure BDA0002291430000000152
Figure BDA0002291430000000161
Figure BDA0002291430000000171
Figure BDA0002291430000000181
表4含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的红外光谱数据
Figure BDA0002291430000000182
表5含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的高分辨质谱数据
Figure BDA0002291430000000183
Figure BDA0002291430000000191
实施例2
含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的抗烟草花叶病毒治疗和保护活性实验
2.1测试方法
A、病毒提纯
采用Gooding方法(Gooding,G.V.jr；Hebert,T.T.A simple techniqueforpurification of tobacco mosaic virus in large quantities[J].Phychopathology,1967,57,1285.)选取接种3周以上，TMV系统侵染寄主Nicotianatabacum.L植株上部叶片，在磷酸缓冲液中匀浆，双层纱布过滤，8000g离心，经2次聚乙二醇处理，再离心，沉淀用磷酸缓冲液悬浮，即得到TMV的精提液体。整个实验在4℃下进行。用紫外分光光度计测定260nm波长的吸光度值，根据下示公式(1)计算病毒浓度：
病毒浓度(mg/mL)＝(A260×稀释倍数)/E0.1％ 1cm 260nm 公式(1)
其中E表示消光系数，即波长260nm时，浓度为0.1％(1mg/mL)的悬浮液，在光程为1cm时的光吸收值。TMV的E0.1％1cm260nm是5.0。
B、药剂对TMV侵染的活体治疗作用
药剂对侵染的活体治疗作用：选长势一致的5-6叶期的心叶烟打顶，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁液(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，自然晾干后用清水冲洗。待叶片干后，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度的溶剂作对照，6～7d后记录枯斑数，按下示公式(2)计算抑制率。
C、药剂对TMV侵染的活体保护作用
药剂对TMV侵染的活体保护作用：选长势一致的5～6叶期的心叶烟打顶，用毛笔在左半叶轻轻涂施药剂，右半叶涂施对应溶剂的浓度的溶剂作对照。24h后，向全叶撒匀金刚砂，用排笔蘸取病毒汁液(6×10-3mg/mL)全叶接种病毒，用清水冲洗，6～7d后记录枯斑数，按下示公式(2)计算抑制率。
D、药剂对TMV侵染的活体钝化作用
药剂对TMV侵染的活体钝化作用：选长势一致的5～6叶期的心叶烟打顶，向全叶撒匀金刚砂，用磷酸缓冲液将TMV病毒液稀释至6×10-3mg/mL，将化合物与等体积的病毒汁液混合钝化30min，用排笔人工摩擦接种于撒有金刚砂的适龄心叶烟左半叶，右半叶摩擦接种同浓度病毒汁液；用清水冲洗，2-3d后观察并记录枯斑的数，按下列公式(2)计算抑制率，按下示公式(2)计算抑制率。
抑制率(％)＝(未涂施药剂半叶平均枯斑数—涂施药剂半叶平均枯斑数)/未涂施药剂半叶平均枯斑数公式(2)
其中，未涂施药剂半叶的平均枯斑数和涂施药剂的半叶枯斑数都采用各组三次重复的平均数。
2.2生物测定结果
采用半叶枯斑法，以烟草花叶病毒(TMV)为测试对象，分别以宁南霉素和毒氟磷为对照药剂，选择DMF为溶剂，对照药与初筛药物浓度为500mg/L下对含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13进行了抗TMV植物病毒活性筛选，测试结果见表6。由表6可知，在TMV病毒的治疗、保护及钝化活性方面，含膦酸酯的酰腙衍生物M11抗TMV病毒活性远高于对照药剂，含膦酸酯的酰腙衍生物M1、M9和M10抗TMV病毒活性与对照药剂相当，而其它含膦酸酯的酰腙衍生物抗TMV病毒活性均低于对照药剂。综合含膦酸酯的酰腙衍生物的治疗活性、保护活性及钝化活性考虑，含膦酸酯的酰腙衍生物M11具备进一步开发抗TMV植物病毒药剂的候选药物及先导化合物。
表6含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13的抗烟草花叶病毒活性
Figure BDA0002291430000000201
Figure BDA0002291430000000211
实施例3
含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13对肝癌细胞SMMC-7721的抗癌活性实验
3.1测试方法
A、细胞培养与药物作用
用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养SMMC-7721细胞,每两天换一次培养液，3-4天传代一次。药物以DMSO为溶剂，配成1mM的贮存液，使用时用培养基分别稀释成1μM和10μM的药剂作用浓度，以DMSO作为阴性对照组，吉西他滨作为阳性对照，作用于对数生长期的细胞。
B、MTT比色法
取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化后，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基终止消化，离心后用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬。取96孔板，板四周每孔各加200μL的无菌水封边，确保实验中饱和湿度。中间六行各加100μL的细胞悬液，细胞浓度在3.5×104个/ml左右。最后一排为空白对照组，加相同体积的完全培养基。在37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养24小时，细胞完全贴壁，去除培养基，加入含不同药物的完全培养基，每孔200μL。空白对照组加200μL的完全培养基，继续培养。24小时后，在倒置显微镜下观察药物作用效果并拍照，48小时后，同样在倒置显微镜下观察药物作用效果并拍照，然后去除上清，每孔加入100μL的0.5mg/ml的MTT溶液，继续培养4小时后，生成紫色结晶甲瓒。小心去除培养液，每孔加入150μL的DMSO溶解甲瓒，在37℃摇床中摇晃15min，待甲瓒结晶完全溶解，用酶标仪在A490波长下测量OD值。每样本浓度重复六个孔，取平均值计算抑制率，其计算如公式(3)所示：
Figure BDA0002291430000000221
3.2生物测定结果
膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13对肝癌细胞SMMC-7721的抗癌活性如表7所示：
表7含膦酸酯的酰腙衍生物M1～M13对肝癌细胞SMMC-7721的抗癌活性
Figure BDA0002291430000000222
经过初步筛选，含膦酸酯的酰腙衍生物M2、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11在10μM对肝癌SMMC-7721细胞具有明显的抑制活性，并高于阳性对照药吉西他滨。而在1μM时，化合物M2、M6、M7、M11对肝癌SMMC-7721细胞抑制效果略高于对照药剂。基于以上结果，含膦酸酯的酰腙衍生物M2、M6、M7及M11具备进一步开发抗肝癌药剂的候选药物及先导化合物。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
本发明不限于以上对实施例的描述，本领域技术人员根据本发明揭示的内容，在本发明基础上不必经过创造性劳动所进行的改进和修改，都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种含膦酸酯的酰腙衍生物，其特征在于：其结构通式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0002291429990000011
其中，R表示任意位置的单取代或双取代的取代基，且取代基选自氢原子、卤素原子、羟基、甲基、甲氧基、硝基。
2.如权利要求1所述的含膦酸酯的酰腙衍生物，其特征在于：其结构式如式(1)或式(2)或式(3)或式(4)或式(5)或式(6)或式(7)或式(8)或式(9)或式(10)或式(11)或式(12)或式(13)所示：
Figure FDA0002291429990000012
Figure FDA0002291429990000021
Figure FDA0002291429990000031
Figure FDA0002291429990000041
3.如权利要求1或2所述的含膦酸酯的酰腙衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以对羟基苯甲醛和溴乙酸乙酯为原料，制备4-甲酰基苯氧基乙酸乙酯；
(2)以步骤(1)的产物4-甲酰基苯氧基乙酸乙酯为原料，通过缩合反应，与2-氨-4-甲基苯并噻唑制备对应的亚胺，在一锅法下，通过亲核加成，继续与亚磷酸二乙酯反应，制备含苯并噻唑杂环的膦酸酯；
(3)以步骤(2)的产物含苯并噻唑杂环的膦酸酯为原料，与水合肼反应，制备含苯并噻唑杂环的膦酸酯酰肼；
(4)以步骤(3)的产物膦酸酯酰肼为原料，与含有目标取代基R的芳香醛反应，制备含膦酸酯的酰腙衍生物。
4.如权利要求1或2所述的含膦酸酯的酰腙衍生物在制备抗烟草花叶病毒病农药中的应用。
5.如权利要求1或2所述的含膦酸酯的酰腙衍生物在制备抗肝癌药物中的应用。
6.一种抗烟草花叶病毒病农药，其特征在于：包含如权利要求1或2所述的含膦酸酯的酰腙衍生物。
7.一种抗肝癌药物，其特征在于：包含如权利要求1或2所述的含膦酸酯的酰腙衍生物。
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