CN1861103A - 脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法与以其为活性成分的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法与应用，其目的是提供一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法与其在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗中的应用。该脂肪酸合酶抑制剂，是以元宝枫叶为原料，用丙酮－水或乙醇－水混合溶剂浸取得到的。本发明所提供的以元宝枫叶为原料制备的脂肪酸合酶抑制剂，具有较高的脂肪酸合酶抑制活性，对肿瘤细胞具有较强的抑制生长的作用，本发明将在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗方面，特别是在制备防治癌症等方面的药物中发挥巨大作用。
Description
技术领域
本发明涉及酶的抑制剂及其制备方法与应用，特别是涉及一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法与在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗中的应用，尤其是涉及一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法及以其为活性成分的抑癌和减肥药物。
背景技术
脂肪酸合酶原称脂肪酸合成酶，(EC 2.3.1.85，fatty acid synthase，缩写为FAS)，动物体内的脂肪酸合酶称为I型FAS，原核生物及植物中的脂肪酸合酶称为II型FAS。国内外基础研究表明，脂肪酸合酶是可以用于治疗目的的潜在靶位。
目前为止，已报道的脂肪酸合酶抑制剂较少，只有合成的C75(Kuhajda F.P.，Pizer E.S.，Li J.N.，et al.Proc Natl Acad Sci USA，97，3450-3454(2000))，较早发现的天然产物浅蓝菌素(cerulenin)(Vance D.，Goldberg I.，Mitsuhashi O.et al.Biochem Biophys Res Commun.48，649-656(1972))和绿茶中的酯型儿茶素EGCG(Wang X.，Tian W.X..Biochem Biophys Res Commun，288(5)：1200-1206(2001))和ECG(Wang X.，Song K.S.，Guo Q.X.，et al.Biochem Pharmacol，66：2039-2047(2003))。这些抑制剂所具有的共同缺点是抑制活性不够高，应用价值受到局限，因此寻找到抑制活性高的脂肪酸合酶抑制剂具有重要的实际应用价值。
元宝枫又名五角枫(Acer Truncatum Bunge)为槭树科(Aceraceae)槭树属(AcerLinn)植物。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酸合酶抑制剂及其制备方法。
本发明所提供的脂肪酸合酶抑制剂，是以元宝枫叶为原料，用丙酮-水或乙醇-水混合溶剂浸取得到的。
所述丙酮-水混合溶剂中丙酮的体积百份数为50-70％；所述乙醇-水混合溶剂中乙醇的体积百份数为50-70％。
混合溶剂与元宝枫干叶的重量份数比为8-30∶1。
浸取的方法为在25-70℃温度下搅拌或加热回流；搅拌浸取的时间为3-24小时；加热回流的时间为2-3小时。
上述提取后需过滤，保留滤液并浓缩；浓缩的方法为低温蒸发，目的是除去其中的有机溶剂。
为得到更好的纯化效果，还可对经过滤和浓缩得到的有效物进一步浓缩，方法为：用乙酸乙酯进行萃取，再将乙酸乙酯提取液(减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效物浸膏。可将此浸膏进一步(真空)干燥得到固态物质。
所述对有效物浸膏进一步浓缩的方法中，还可包括用等体积的石油醚分若干次进行萃取，除去其中的脂类物质。
元宝枫叶中含有脂肪酸合酶的强抑制成分，本发明所提供的以元宝枫叶为原料制备的脂肪酸合酶抑制剂，具有较高的脂肪酸合酶抑制活性，且用不同季节采集的元宝枫叶为原料制备的脂肪酸合酶抑制剂对脂肪酸合酶的抑制活性无显著差异，此外，该脂肪酸合酶抑制剂对肿瘤细胞具有较强的抑制生长的作用。本发明将在以脂肪酸合酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗方面，在制备控制体重、防治与肥胖相关的疾病等方面的药物，特别是在制备防治癌症的药物中发挥巨大作用。同时，本发明的脂肪酸合酶抑制剂在保健品及化妆品的生产中也会有较大的应用价值。
具体实施方式
下述实施例中，所用的脂肪酸合酶均为用常规方法(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)：234-236)自新鲜鸭肝中分离提纯的，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带。
脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法测定(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)：234-236)。
实施例1、元宝枫叶中有效物质的提取
将各个季节采集的元宝枫叶(包括秋季落叶)洗净，自然晾干或低温烘干(＜50℃)后将其粉碎，用下述方法提取有效物：
用乙醇-水混合溶剂(乙醇的体积百份数为70％)与上述粉碎的元宝枫干叶按重量份数比20∶1混合，室温25℃下搅拌浸取12小时，过滤；在同样条件下再浸取12小时，然后过滤，将两次滤液合并，(减压)低温蒸发浓缩，除去其中的有机溶剂，得到有效物质浸膏，即脂肪酸合酶抑制剂。可进一步将浸膏(真空)干燥(＜55℃)得到固态物质。
实施例2、元宝枫叶中有效物质的提取
将各个季节采集的元宝枫叶(包括秋季落叶)洗净，自然晾干或低温烘干(＜50℃)后将其粉碎，用下述方法提取有效物：
用丙酮-水混合溶剂(丙酮的体积百份数为60％)与上述粉碎的元宝枫干叶按重量份数比为20∶1混合，加热回流3小时，过滤；在同样条件下再加热回流2小时，过滤，将两次滤液合并，(减压)低温蒸发浓缩，除去其中的有机溶剂，得到有效物质水相，可对水相中的有效物进一步浓缩，具体方法为：先用等体积的石油醚分3-4次进行萃取，除去其中的脂类物质，再用乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯提取液(减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效物浸膏，可将此浸膏进一步(真空)干燥得到固态物质。
实施例3、元宝枫叶中有效物质的提取
将各个季节采集的元宝枫叶(包括秋季落叶)洗净，自然晾干或低温烘干(＜50℃)后将其粉碎，用下述方法提取有效物：
用乙醇-水混合溶剂(乙醇与水的体积份数比为60∶40)与上述粉碎的元宝枫干叶按重量份数比为10∶1混合，加热回流3小时，然后过滤，在同样条件下再加热回流2小时，将两次滤液合并，(减压)低温蒸发浓缩，除去其中的有机溶剂，得到含有效物质的水相，可对水相中的有效物进一步浓缩，具体方法为：用乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯提取液(减压)低温蒸发浓缩，除去有机溶剂得到经浓缩的有效物浸膏，可将此浸膏进一步(真空)干燥得到固态物质。
实施例4、对脂肪酸合成酶抑制活性的检测
在37℃下，在2毫升石英比色皿中加入该酶底物：0.2mM乙酰辅酶A溶液25微升，0.4mM丙二酰辅酶A溶液50微升和1.3mM NADPH溶液50微升，再加入0.1M，pH 7.0磷酸盐缓冲液1.85毫升及FAS溶液30微升混匀，启动酶促反应。用分光光度计监测单位时间内340nm波长处吸光值A的变化(ΔA/min)来表示FAS的活力。在一定浓度元宝枫叶提取物存在下，FAS全酶反应的活力下降，当其活力下降一半时所需元宝枫叶提取物的浓度即为IC50，用该数值表示元宝枫叶(包括秋季落叶)提取物对FAS的抑制能力，上述测活体系中FAS的终浓度为7微克/毫升。
测定结果表明：在上述测活条件下，元宝枫叶提取物的IC50为2-3微克/毫升(随季节略有差异)，折合成干叶重，为20-30微克/毫升。
实施例5、肿瘤细胞实验
细胞培养：将食道癌CAES-17、胃癌BGC-823、乳腺癌MCF-7和肝癌BEL-7402四种癌细胞株(均购自医科院药物研究所)培养于含10％小牛血清、青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI-1640培养液中，在适当湿度、5％CO2的培养箱中37℃单层贴壁传代培养。
收集对数生长期的四种肿瘤细胞，分别接种于96孔板中，2×104个/孔，贴壁培养24小时分别换成含有实施例1、实施例2和实施例3获得的元宝枫提取物的培养液，按不同元宝枫提取物浓度分成7组(设0、5、10、20、40、60、80μg/mL共7个实验组，每个浓度设3个复孔，实验结果取平均值)。
继续培养24小时，换成不含提取物的培养液，同时加入20μL MTT(四甲基偶氮唑蓝，5mg/ml)继续培养4小时。弃上清液，每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)(对照组加入等量培养液和二甲基亚砜)，水平震荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪测定吸光值(A)，波长570nm，并按下述公式计算提取物对癌细胞生长的抑制作用，结果如表1所示，表明本发明的脂肪酸和酶抑制剂对肿瘤细胞具有显著的抑制作用。
细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组A570/对照组A570)×100％
表1 不同浓度提取物(作用24小时)对肿瘤细胞生长的抑制率(％)
| 提取物浓度(μg/ml) | 5 | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 | 空白对照组 |
| 食道癌CAES-17 | 18 | 32 | 40 | 49 | 53 | 56 | 0 |
| 胃癌BGC-823 | 27 | 28 | 37 | 42 | 49 | 55 | 0 |
| 乳腺癌MCF-7 | 26 | 23 | 43 | 50 | 56 | 52 | 0 |
| 肝癌BEL-7402 | 23 | 35 | 48 | 57 | 65 | 79 | 0 |
注：上述抑癌实验所用元宝枫叶提取物已经乙酸乙酯步骤进一步浓缩，不同季节叶和秋季落叶的提取物对癌细胞的抑制能力无显著差异。
Claims (10)
1、一种脂肪酸合酶抑制剂，是以元宝枫叶为原料，用丙酮-水或乙醇-水混合溶剂浸取得到的。
2、根据权利要求1所述的脂肪酸合酶抑制剂，其特征在于：所述丙酮-水混合溶剂中丙酮的体积百份数为50-70％；所述乙醇-水混合溶剂中乙醇的体积百份数为50-70％。
3、根据权利要求1或2所述的脂肪酸合酶抑制剂，其特征在于：所述混合溶剂与元宝枫干叶的重量份数比为8-30∶1。
4、根据权利要求1或2所述的脂肪酸合酶抑制剂，其特征在于：所述浸取的方法为在25-70℃下搅拌，或加热回流；所述在25-70℃下搅拌浸取的时间为3-24小时；加热回流的时间为2-3小时。
5、权利要求1所述的脂肪酸合酶抑制剂的制备方法，是以元宝枫叶为原料，用丙酮-水或乙醇-水混合溶剂进行浸取，得到产品。
6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述丙酮-水混合溶剂中丙酮的体积百份数比为50-70％；所述乙醇-水混合溶剂中乙醇的体积百份数为50-70％，酮-水或醇-水混合溶剂与元宝枫叶的重量份数比为8-30∶1；所述浸取的方法为在25-70℃下搅拌或加热回流；所述温度下搅拌浸取的时间为3-24小时；加热回流的时间为2-3小时。
7、根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于：所述浸取后还需进行过滤和浓缩；所述浓缩的方法为(减压)低温蒸发。
8、以权利要求1所述的脂肪酸合酶抑制剂为活性成分的抑制癌症的药物。
9、以权利要求1所述的脂肪酸合酶抑制剂在制备抑制癌症药物中的应用。
10、以权利要求1所述的脂肪酸合酶抑制剂为活性成分的减肥药物。
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