CN110184261B - 两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/sds复配体系在提高酶活性中的应用 - Google Patents
两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/sds复配体系在提高酶活性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
技术领域
本发明属于生物酶技术领域,涉及两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/十二烷基硫酸钠(SDS)复配体系在提高菠萝果汁中的菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化酶(PPO)活性中的应用。
背景技术
酶是一种高效、专一且作用条件温和的生物催化剂。在许多植物体中存在不同种类的酶。菠萝中的酶含量极为丰富,包括菠萝蛋白酶和多酚氧化酶。菠萝蛋白酶是一种蛋白水解酶,多酚氧化酶是一种金属蛋白酶,它们在医药、化工、食品等领域均有着广泛的应用。因此对菠萝粗提液中两种酶活性进行选择性调控具有实际应用价值。目前工业上大多采用表面活性剂对酶活性进行调控,但存在生物相容性较差、表面活性剂用量过多、对酶活性的调控范围较窄等问题。
在菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的工业生产中,不可避免地会加入一些添加剂,如十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS在GB 2760-96规定为食品工业用加工助剂,此外它也用作药物、化妆品、合成树脂的乳化剂。然而,SDS会显著抑制菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的活性,因此在SDS的存在下如何保持酶的活性及稳定性是一个至关重要的问题。
杯芳烃衍生物是第三代的主体超分子化合物。经过化学修饰的杯芳烃,不仅可以赋予杯芳烃两亲性,而且可以使其具有较好的生物相容性,在生物成像、药物增溶和酶活性的调控等方面都展现出了良好的应用前景。中国专利申请201810041508.4公开了杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性中的应用。然而,磺酸盐杯[n]芳烃对菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的活性均起到抑制作用。杯[4]芳烃季铵盐虽然可以提高菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的活性,但是季铵盐的生物相容性和细胞毒性较差,限制了其在食品医药中的进一步应用。
发明内容
本发明的目的在于提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/十二烷基硫酸钠(SDS)复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用。本发明将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与SDS进行复配,通过二者的拮抗作用,显著降低了SDS对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶酶活性的抑制作用。在SDS的存在下,通过加入两亲性杯[4]芳烃咪唑盐,仍能大幅度提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶的酶活性。
本发明中,所述的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的结构式如式(I)所示,包括杯[4]芳烃咪唑盐PC2I(m=3,n=2),PC4I(m=3,n=4),PC6I(m=3,n=6)或BC4I(m=4,n=4),
优选地,本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用,其中复配体系中,两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的质量与SDS的摩尔比为3:10~7:3,g:mmol,更优选为7:10~7:3,g:mmol,两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的浓度为0.03~0.07mg/mL,SDS的浓度为0.03~0.1mM。
进一步地,本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用,具体应用方法为:将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐、SDS或两种物质复配与底物先混合,再加入酶。
优选地,本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用,具体应用方法为:将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与酶混合,SDS与底物混合,再将两种混合溶液混合。
更为优选地,本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用,具体应用方法为:将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与SDS复配后,先与酶混合,再加入底物。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
SDS对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性具有抑制作用。例如SDS浓度为0.1mM时,可将菠萝蛋白酶活性降低至60%左右。两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性具有提高作用。例如PC4I为0.03~0.07mg/mL时,可将菠萝蛋白酶活性提高至140%左右。本发明首次通过两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系实现对菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性的调控,将SDS与PC4I复配,能够对SDS诱导的菠萝蛋白酶活性的抑制产生拮抗作用,且将菠萝蛋白酶酶活性提高至140%左右。同时,本发明的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐生物相容性较好,并且对两种酶活性的调控具有选择性。
附图说明
图1为PC4I与SDS复配对BM活性的影响结果图,t=37.2℃,pH=8,粗酶稀释25倍。
图2为不同疏水链长及不同间隔基的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对BM活性的影响结果图,t=37.2℃,pH=8.0,粗酶稀释25倍,[两亲性杯[4]芳烃咪唑盐]=0.07mg/mL。
图3为PC4I与SDS复配对PPO活性的影响结果图,t=30℃,pH=7.0。
图4为PC4I与SDS复配,加样顺序对BM活性的影响结果图,t=37.2℃,pH=8.0,粗酶稀释25倍,[PC4I]=0.07mg/mL,[SDS]=0.1mM。
图5为PC4I与SDS复配,加样顺序对PPO活性的影响结果图,t=30℃,pH=7.0,[PC4I]=0.07mg/mL,[SDS]=0.1mM。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
本发明所述的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐参考中国专利申请201810041508.4进行制备。与该专利申请不同的是采用N-甲基咪唑为原料。
1.基础实验和试剂
(1)粗酶液的制备
将菠萝洗净去皮切块得到果肉,称取24.3158g,加入24mL含乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(40mM,pH 6.0)于榨汁机中破碎3-5分钟,然后用纱布进行过滤,将滤液在转速为10000rpm、温度为4℃的高速冷冻离心机中离心25min,分离得到上清液。放置于-20℃保存。
(2)底物溶液配制
a.邻苯二酚(Catechol)
以Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(0.1M,pH 7.0)为溶剂,配制浓度为300mM的邻苯二酚母液。
b.酪蛋白(Casein)
称取0.6g干酪素,加入20mL 0.2M的Na2HPO4溶液以及15mL 0.2M的NaOH溶液,于70℃水浴下加热,并不停搅拌至完全溶解,再调节pH至8.0,定容至100mL。
(3)酶提取液的配置
量取4.92mL 0.2M的Na2HPO4溶液及35.08mL 0.2M的NaH2PO4溶液,加入0.293gEDTA·2Na,于60℃水浴中加热至完全溶解,再调节pH至6.0,定容至100mL,即得pH 6.080mMNa2HPO4-NaH2PO4(EDTA·2Na)缓冲溶液。
(4)三氯乙酸溶液的配置
称取1.799g三氯乙酸,加入2.994g无水乙酸钠、1.89mL冰醋酸及适量去离子水,用玻璃棒搅拌,定容至100mL。
(5)L-半胱氨酸溶液的配置
称取0.26g L-半胱氨酸及0.22g EDTA·2Na,加入适量去离子水,于60℃水浴中加热至完全溶解,再调节pH至6.0,定容至100mL。
(6)表面活性剂溶液的配制
在去离子水中配制1mM SDS溶液。
(7)杯芳烃溶液的配制
在去离子水中配制1mg/mL两亲性杯[4]芳烃咪唑盐溶液。
(8)酶活性测定(紫外分光光度计)
a.多酚氧化酶
以邻苯二酚为底物,对粗酶液进行酶活性的测试,其中邻苯二酚的浓度为150mM。将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图,通过计算该图初始线性部分的斜率,结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1),得到多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化的初始反应速率ν(μM·s-1)。将不加任何添加剂的酶活性定义为100%。
b.菠萝蛋白酶
将粗酶液稀释25倍后置于37.2℃水浴锅中恒温1h。在一支2mL离心管中加入120μL酶液及等量的L-半胱氨酸溶液,充分混匀后,分别取100μL该混合液加入两支2mL离心管中,于37.2℃水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后,于对照管和样品管中分别加入500μL三氯乙酸溶液和500μL酪蛋白溶液,准确反应10min,再分别于对照管和样品管中加入500μL酪蛋白溶液和500μL三氯乙酸溶液。在37.2℃水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件:10000rpm、4℃、25min),取上层清液,用于紫外测定,记录275nm处的吸光度值。将不加任何添加剂的酶活性定义为100%。
2.PC4I与SDS复配对BM活性的影响:
依次在2mL离心管中加入去离子水、SDS母液、PC4I母液、以及粗酶液。其中,SDS的浓度分别为0mM、0.03mM、0.1mM;PC4I的浓度分别为0mg/mL、0.03mg/mL、0.07mg/mL,粗酶液稀释了25倍。将该混合溶液于37.2℃恒温1h后,进行BM活性测试,以不加任何添加剂的酶活性定义为100%。
图1为PC4I与SDS复配对BM活性的影响结果图,t=37.2℃,pH=8.0,粗酶稀释25倍。从图1中可知,SDS浓度为0.1mM时,可将菠萝蛋白酶活性降低至60%左右;PC4I为0.03~0.07mg/mL,可将BM活性提高至140%左右;将SDS与PC4I复配,可以对SDS诱导的BM活性的抑制产生拮抗作用,且可将BM活性提高至140%左右。
3.不同疏水链长及不同间隔基的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对BM活性的影响:
先后在2mL离心管中加入去离子水、SDS母液、两亲性杯[4]芳烃咪唑盐母液、以及粗酶液。其中,SDS的浓度分别为0mM、0.03mM、0.1mM,两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的浓度分别为0mg/mL、0.07mg/mL,粗酶液稀释了25倍。将该混合溶液于37.2℃恒温1h后,进行BM活性测试,以不加任何添加剂的酶活性定义为100%。
图2为不同疏水链长及不同间隔基的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对BM活性的影响结果图,t=37.2℃,pH=8.0,粗酶液稀释了25倍,[两亲性杯[4]芳烃咪唑盐]=0.07mg/mL。从图2中可知,改变杯芳烃的疏水链长度以及与极性头基相连的间隔基长度时,同样可以将BM活性提高至140%左右,且即使将对BM活性有抑制作用的SDS引入体系中依然可以将BM活性提高30%~40%。
4.PC4I与SDS复配对PPO活性的影响:
将SDS母液、PC4I母液以及粗酶液混合后,在30℃下平衡1h。将得到的混合液加入邻苯二酚稀释液中进行催化反应。将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图,通过计算该图初始线性部分的斜率,结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1),得到PPO催化邻苯二酚氧化的初始反应速率ν(μM·s-1)。SDS的浓度分别为0mM、0.03mM、0.1mM,PC4I的浓度分别为0mg/mL、0.03mg/mL、0.07mg/mL,粗酶液稀释了15倍,邻苯二酚浓度为150mM。以不加任何添加剂的酶活性定义为100%。
图3为PC4I与SDS复配对PPO活性的影响结果图,t=30℃,pH=7.0。从图3中可知,SDS浓度为0.1mM时,可将PPO活性降低至80%左右;PC4I可以提高PPO活性,且浓度越高,对PPO活性的提高程度越大,当PC4I为0.07mg/mL,可将PPO活性提高至230%左右。
5.PC4I与SDS复配,加样顺序对BM活性的影响:
与底物先混合:用去离子水将粗酶液稀释25倍,平衡1h;将SDS、PC4I与底物酪蛋白先混合,平衡1h,进行BM活性测试。
与酶先混合:将SDS与底物酪蛋白先混合,而PC4I与酶稀释液先混合,平衡1h,进行BM活性测试。将PC4I与底物酪蛋白先混合,而SDS与粗酶液先混合平衡1h,进行BM活性测试。将底物酪蛋白单独平衡1h,SDS母液、PC4I母液以及粗酶液混合后,平衡1h,进行BM活性测试。其中,SDS的浓度为0.1mM,杯芳烃的浓度为0.07mg/mL,粗酶液稀释了25倍,以不加任何添加剂的酶活性定义为100%。
图4为PC4I与SDS复配,加样顺序对BM活性的影响结果图,t=37.2℃,pH=8.0,粗酶稀释25倍。[PC4I]=0.07mg/mL,[SDS]=0.1mM。结果表明:(1)当PC4I和/或SDS与酪蛋白先混合时,对BM的活性几乎没有影响;(2)当SDS与粗酶先混合,PC4I与酪蛋白先混合时,呈现出SDS对BM活性的抑制作用,可以将BM活性降低至60%左右;(3)当PC4I与粗酶先混合,SDS与酪蛋白先混合时,呈现出PC4I对BM活性的提高作用,将BM活性提高至130%;(4)当PC4I与SDS复配,先与粗酶液混合,仍可将BM活性提高30%左右。
6.PC4I与SDS复配,加样顺序对PPO活性的影响:
与底物先混合:将粗酶液平衡1h。把去离子水、邻苯二酚母液、SDS、PC4I母液混合,平衡1h。将粗酶液加入上述混合液中进行催化反应。将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图,通过计算该图初始线性部分的斜率,结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1),得到酶催化邻苯二酚氧化的初始反应速率ν(μM·s-1)。
与酶先混合:将SDS母液、PC4I母液以及粗酶液混合后,平衡1h。将得到的混合液加入邻苯二酚稀释液中进行催化反应,将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图,通过计算该图初始线性部分的斜率,结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1),得到酶催化氧化邻苯二酚的初始反应速率ν(μM·s-1)。SDS的浓度为0.1mM,杯芳烃的浓度为0.07mg/mL,粗酶液稀释了15倍,邻苯二酚浓度为150mM。以不加任何添加剂的酶活性定义为100%。
图5为PC4I与SDS复配,加样顺序对PPO活性的影响结果图,t=30℃,pH=7.0,[PC4I]=0.07mg/mL,[SDS]=0.1mM。研究两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与表面活性剂SDS复配对PPO活性的影响机制,将SDS、PC4I、底物邻苯二酚和PPO四种物质的加样顺序改变,探讨加样顺序对PPO活性的影响。发现:(1)当粗酶与SDS先混合,PC4I与底物邻苯二酚混合时,呈现出SDS对PPO活性的抑制作用,可以将PPO活性降低至80%左右;(2)当PC4I与粗酶先混合,SDS与底物邻苯二酚混合时,呈现出PC4I对PPO活性的提高作用,将PPO活性提高至230%;(3)当PC4I与SDS复配,先与粗酶液混合,可将PPO活性提高至130%;(4)而当PC4I和/或SDS与底物邻苯二酚先混合时,对PPO活性影响不大。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的复配体系中,两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的质量与SDS的摩尔比为3:10~7:3,g:mmol。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的复配体系中,两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的质量与SDS的摩尔比为7:10~7:3,g:mmol。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的复配体系中,两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的浓度为0.03 ~0.07mg/mL,SDS的浓度为0.03~0.1 mM。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,具体应用方法为:将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐、SDS或两种物质复配与底物先混合,再加入酶。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,具体应用方法为:将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与酶混合,SDS与底物混合,再将两种混合溶液混合。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,具体应用方法为:将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与SDS复配后,先与酶混合,再加入底物。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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