CN110184261A - 两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/sds复配体系在提高酶活性中的应用 - Google Patents

两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/sds复配体系在提高酶活性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高酶活性中的应用。所述的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的结构式如式所示，所述的酶为菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶。本发明将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与SDS进行复配，通过二者的拮抗作用，显著降低了SDS对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性的抑制作用。在SDS的存在下，通过加入两亲性杯[4]芳烃咪唑盐，仍能大幅度提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶的酶活性，拓宽了菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的进一步应用。

Description

两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高酶活性中的 应用
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，涉及两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/十二烷基硫酸钠(SDS)复配体系在提高菠萝果汁中的菠萝蛋白酶(BM)和/或多酚氧化酶(PPO)活性中的应用。
背景技术
酶是一种高效、专一且作用条件温和的生物催化剂。在许多植物体中存在不同种类的酶。菠萝中的酶含量极为丰富，包括菠萝蛋白酶和多酚氧化酶。菠萝蛋白酶是一种蛋白水解酶，多酚氧化酶是一种金属蛋白酶，它们在医药、化工、食品等领域均有着广泛的应用。因此对菠萝粗提液中两种酶活性进行选择性调控具有实际应用价值。目前工业上大多采用表面活性剂对酶活性进行调控，但存在生物相容性较差、表面活性剂用量过多、对酶活性的调控范围较窄等问题。
在菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的工业生产中，不可避免地会加入一些添加剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS在GB 2760-96规定为食品工业用加工助剂，此外它也用作药物、化妆品、合成树脂的乳化剂。然而，SDS会显著抑制菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的活性，因此在SDS的存在下如何保持酶的活性及稳定性是一个至关重要的问题。
杯芳烃衍生物是第三代的主体超分子化合物。经过化学修饰的杯芳烃，不仅可以赋予杯芳烃两亲性，而且可以使其具有较好的生物相容性，在生物成像、药物增溶和酶活性的调控等方面都展现出了良好的应用前景。中国专利申请201810041508.4公开了杯芳烃衍生物在调控菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性中的应用。然而，磺酸盐杯[n]芳烃对菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的活性均起到抑制作用。杯[4]芳烃季铵盐虽然可以提高菠萝蛋白酶和多酚氧化酶的活性，但是季铵盐的生物相容性和细胞毒性较差，限制了其在食品医药中的进一步应用。
发明内容
本发明的目的在于提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/十二烷基硫酸钠(SDS)复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用。本发明将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与SDS进行复配，通过二者的拮抗作用，显著降低了SDS对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶酶活性的抑制作用。在SDS的存在下，通过加入两亲性杯[4]芳烃咪唑盐，仍能大幅度提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶的酶活性。
本发明中，所述的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的结构式如式(I)所示，包括杯[4]芳烃咪唑盐PC2I(m＝3,n＝2)，PC4I(m＝3,n＝4)，PC6I(m＝3,n＝6)或BC4I(m＝4,n＝4)，
优选地，本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用，其中复配体系中，两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的质量与SDS的摩尔比为3:10～7:3，g:mmol，更优选为7:10～7:3，g:mmol，两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的浓度为0.03～0.07mg/mL，SDS的浓度为0.03～0.1mM。
进一步地，本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用，具体应用方法为：将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐、SDS或两种物质复配与底物先混合，再加入酶。
优选地，本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用，具体应用方法为：将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与酶混合，SDS与底物混合，再将两种混合溶液混合。
更为优选地，本发明提供两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用，具体应用方法为：将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与SDS复配后，先与酶混合，再加入底物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
SDS对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性具有抑制作用。例如SDS浓度为0.1mM时，可将菠萝蛋白酶活性降低至60％左右。两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性具有提高作用。例如PC4I为0.03～0.07mg/mL时，可将菠萝蛋白酶活性提高至140％左右。本发明首次通过两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系实现对菠萝蛋白酶和多酚氧化酶活性的调控，将SDS与PC4I复配，能够对SDS诱导的菠萝蛋白酶活性的抑制产生拮抗作用，且将菠萝蛋白酶酶活性提高至140％左右。同时，本发明的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐生物相容性较好，并且对两种酶活性的调控具有选择性。
附图说明
图1为PC4I与SDS复配对BM活性的影响结果图，t＝37.2℃，pH＝8，粗酶稀释25倍。
图2为不同疏水链长及不同间隔基的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对BM活性的影响结果图，t＝37.2℃，pH＝8.0，粗酶稀释25倍，[两亲性杯[4]芳烃咪唑盐]＝0.07mg/mL。
图3为PC4I与SDS复配对PPO活性的影响结果图，t＝30℃，pH＝7.0。
图4为PC4I与SDS复配，加样顺序对BM活性的影响结果图，t＝37.2℃，pH＝8.0，粗酶稀释25倍，[PC4I]＝0.07mg/mL，[SDS]＝0.1mM。
图5为PC4I与SDS复配，加样顺序对PPO活性的影响结果图，t＝30℃，pH＝7.0，[PC4I]＝0.07mg/mL，[SDS]＝0.1mM。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
本发明所述的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐参考中国专利申请201810041508.4进行制备。与该专利申请不同的是采用N-甲基咪唑为原料。
1.基础实验和试剂
(1)粗酶液的制备
将菠萝洗净去皮切块得到果肉，称取24.3158g，加入24mL含乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(40mM，pH 6.0)于榨汁机中破碎3-5分钟，然后用纱布进行过滤，将滤液在转速为10000rpm、温度为4℃的高速冷冻离心机中离心25min，分离得到上清液。放置于-20℃保存。
(2)底物溶液配制
a.邻苯二酚(Catechol)
以Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(0.1M，pH 7.0)为溶剂，配制浓度为300mM的邻苯二酚母液。
b.酪蛋白(Casein)
称取0.6g干酪素，加入20mL 0.2M的Na2HPO4溶液以及15mL 0.2M的NaOH溶液，于70℃水浴下加热，并不停搅拌至完全溶解，再调节pH至8.0，定容至100mL。
(3)酶提取液的配置
量取4.92mL 0.2M的Na2HPO4溶液及35.08mL 0.2M的NaH2PO4溶液，加入0.293gEDTA·2Na，于60℃水浴中加热至完全溶解，再调节pH至6.0，定容至100mL，即得pH 6.080mMNa2HPO4-NaH2PO4(EDTA·2Na)缓冲溶液。
(4)三氯乙酸溶液的配置
称取1.799g三氯乙酸，加入2.994g无水乙酸钠、1.89mL冰醋酸及适量去离子水，用玻璃棒搅拌，定容至100mL。
(5)L-半胱氨酸溶液的配置
称取0.26g L-半胱氨酸及0.22g EDTA·2Na，加入适量去离子水，于60℃水浴中加热至完全溶解，再调节pH至6.0，定容至100mL。
(6)表面活性剂溶液的配制
在去离子水中配制1mM SDS溶液。
(7)杯芳烃溶液的配制
在去离子水中配制1mg/mL两亲性杯[4]芳烃咪唑盐溶液。
(8)酶活性测定(紫外分光光度计)
a.多酚氧化酶
以邻苯二酚为底物，对粗酶液进行酶活性的测试，其中邻苯二酚的浓度为150mM。将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图，通过计算该图初始线性部分的斜率，结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1)，得到多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化的初始反应速率ν(μM·s-1)。将不加任何添加剂的酶活性定义为100％。
b.菠萝蛋白酶
将粗酶液稀释25倍后置于37.2℃水浴锅中恒温1h。在一支2mL离心管中加入120μL酶液及等量的L-半胱氨酸溶液，充分混匀后，分别取100μL该混合液加入两支2mL离心管中，于37.2℃水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后，于对照管和样品管中分别加入500μL三氯乙酸溶液和500μL酪蛋白溶液，准确反应10min，再分别于对照管和样品管中加入500μL酪蛋白溶液和500μL三氯乙酸溶液。在37.2℃水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件：10000rpm、4℃、25min)，取上层清液，用于紫外测定，记录275nm处的吸光度值。将不加任何添加剂的酶活性定义为100％。
2.PC4I与SDS复配对BM活性的影响：
依次在2mL离心管中加入去离子水、SDS母液、PC4I母液、以及粗酶液。其中，SDS的浓度分别为0mM、0.03mM、0.1mM；PC4I的浓度分别为0mg/mL、0.03mg/mL、0.07mg/mL，粗酶液稀释了25倍。将该混合溶液于37.2℃恒温1h后，进行BM活性测试，以不加任何添加剂的酶活性定义为100％。
图1为PC4I与SDS复配对BM活性的影响结果图，t＝37.2℃，pH＝8.0，粗酶稀释25倍。从图1中可知，SDS浓度为0.1mM时，可将菠萝蛋白酶活性降低至60％左右；PC4I为0.03～0.07mg/mL，可将BM活性提高至140％左右；将SDS与PC4I复配，可以对SDS诱导的BM活性的抑制产生拮抗作用，且可将BM活性提高至140％左右。
3.不同疏水链长及不同间隔基的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对BM活性的影响：
先后在2mL离心管中加入去离子水、SDS母液、两亲性杯[4]芳烃咪唑盐母液、以及粗酶液。其中，SDS的浓度分别为0mM、0.03mM、0.1mM，两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的浓度分别为0mg/mL、0.07mg/mL，粗酶液稀释了25倍。将该混合溶液于37.2℃恒温1h后，进行BM活性测试，以不加任何添加剂的酶活性定义为100％。
图2为不同疏水链长及不同间隔基的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐对BM活性的影响结果图，t＝37.2℃，pH＝8.0，粗酶液稀释了25倍，[两亲性杯[4]芳烃咪唑盐]＝0.07mg/mL。从图2中可知，改变杯芳烃的疏水链长度以及与极性头基相连的间隔基长度时，同样可以将BM活性提高至140％左右，且即使将对BM活性有抑制作用的SDS引入体系中依然可以将BM活性提高30％～40％。
4.PC4I与SDS复配对PPO活性的影响：
将SDS母液、PC4I母液以及粗酶液混合后，在30℃下平衡1h。将得到的混合液加入邻苯二酚稀释液中进行催化反应。将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图，通过计算该图初始线性部分的斜率，结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1)，得到PPO催化邻苯二酚氧化的初始反应速率ν(μM·s-1)。SDS的浓度分别为0mM、0.03mM、0.1mM，PC4I的浓度分别为0mg/mL、0.03mg/mL、0.07mg/mL，粗酶液稀释了15倍，邻苯二酚浓度为150mM。以不加任何添加剂的酶活性定义为100％。
图3为PC4I与SDS复配对PPO活性的影响结果图，t＝30℃，pH＝7.0。从图3中可知，SDS浓度为0.1mM时，可将PPO活性降低至80％左右；PC4I可以提高PPO活性，且浓度越高，对PPO活性的提高程度越大，当PC4I为0.07mg/mL，可将PPO活性提高至230％左右。
5.PC4I与SDS复配，加样顺序对BM活性的影响：
与底物先混合：用去离子水将粗酶液稀释25倍，平衡1h；将SDS、PC4I与底物酪蛋白先混合，平衡1h，进行BM活性测试。
与酶先混合：将SDS与底物酪蛋白先混合，而PC4I与酶稀释液先混合，平衡1h，进行BM活性测试。将PC4I与底物酪蛋白先混合，而SDS与粗酶液先混合平衡1h，进行BM活性测试。将底物酪蛋白单独平衡1h，SDS母液、PC4I母液以及粗酶液混合后，平衡1h，进行BM活性测试。其中，SDS的浓度为0.1mM，杯芳烃的浓度为0.07mg/mL，粗酶液稀释了25倍，以不加任何添加剂的酶活性定义为100％。
图4为PC4I与SDS复配，加样顺序对BM活性的影响结果图，t＝37.2℃，pH＝8.0，粗酶稀释25倍。[PC4I]＝0.07mg/mL，[SDS]＝0.1mM。结果表明：(1)当PC4I和/或SDS与酪蛋白先混合时，对BM的活性几乎没有影响；(2)当SDS与粗酶先混合，PC4I与酪蛋白先混合时，呈现出SDS对BM活性的抑制作用，可以将BM活性降低至60％左右；(3)当PC4I与粗酶先混合，SDS与酪蛋白先混合时，呈现出PC4I对BM活性的提高作用，将BM活性提高至130％；(4)当PC4I与SDS复配，先与粗酶液混合，仍可将BM活性提高30％左右。
6.PC4I与SDS复配，加样顺序对PPO活性的影响：
与底物先混合：将粗酶液平衡1h。把去离子水、邻苯二酚母液、SDS、PC4I母液混合，平衡1h。将粗酶液加入上述混合液中进行催化反应。将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图，通过计算该图初始线性部分的斜率，结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1)，得到酶催化邻苯二酚氧化的初始反应速率ν(μM·s-1)。
与酶先混合：将SDS母液、PC4I母液以及粗酶液混合后，平衡1h。将得到的混合液加入邻苯二酚稀释液中进行催化反应，将420nm处的吸光度值(A)与时间(t)作图，通过计算该图初始线性部分的斜率，结合产物邻苯二醌的摩尔吸光系数(1100M-1cm-1)，得到酶催化氧化邻苯二酚的初始反应速率ν(μM·s-1)。SDS的浓度为0.1mM，杯芳烃的浓度为0.07mg/mL，粗酶液稀释了15倍，邻苯二酚浓度为150mM。以不加任何添加剂的酶活性定义为100％。
图5为PC4I与SDS复配，加样顺序对PPO活性的影响结果图，t＝30℃，pH＝7.0，[PC4I]＝0.07mg/mL，[SDS]＝0.1mM。研究两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与表面活性剂SDS复配对PPO活性的影响机制，将SDS、PC4I、底物邻苯二酚和PPO四种物质的加样顺序改变，探讨加样顺序对PPO活性的影响。发现：(1)当粗酶与SDS先混合，PC4I与底物邻苯二酚混合时，呈现出SDS对PPO活性的抑制作用，可以将PPO活性降低至80％左右；(2)当PC4I与粗酶先混合，SDS与底物邻苯二酚混合时，呈现出PC4I对PPO活性的提高作用，将PPO活性提高至230％；(3)当PC4I与SDS复配，先与粗酶液混合，可将PPO活性提高至130％；(4)而当PC4I和/或SDS与底物邻苯二酚先混合时，对PPO活性影响不大。

Claims (8)

1.两亲性杯[4]芳烃咪唑盐/SDS复配体系在提高菠萝蛋白酶和/或多酚氧化酶活性中的应用，所述的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的结构式如式(I)所示，
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的两亲性杯[4]芳烃咪唑盐选自杯[4]芳烃咪唑盐PC2I(m＝3,n＝2)，PC4I(m＝3,n＝4)，PC6I(m＝3,n＝6)或BC4I(m＝4,n＝4)。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的复配体系中，两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的质量与SDS的摩尔比为3:10～7:3，g:mmol。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的复配体系中，两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的质量与SDS的摩尔比为7:10～7:3，g:mmol。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的复配体系中，两亲性杯[4]芳烃咪唑盐的浓度为0.03～0.07mg/mL，SDS的浓度为0.03～0.1mM。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐、SDS或两种物质复配与底物先混合，再加入酶。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与酶混合，SDS与底物混合，再将两种混合溶液混合。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：将两亲性杯[4]芳烃咪唑盐与SDS复配后，先与酶混合，再加入底物。
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JING WANG等: "Assembly behaviors of calixarene-based amphiphile and supra-amphiphile and the applications in drug delivery and protein recognition", 《ADVANCES IN COLLOID AND INTERFACE SCIENCE》 *
李英等: "杯芳烃应用研究进展", 《化学工业与工程技术》 *
毛林峰等: "水溶性杯芳烃的应用研究进展", 《广东化工》 *
顾薇薇等: "杯芳烃N-氮杂卡宾金属络合物的合成", 《中国化学会全国第十五届大环化学暨第七届超分子化学学术讨论会论文摘要集》 *

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