CN116059237B - 信号通路在chd药物开发中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了信号通路在CHD药物开发中的应用，属于siRNA及其应用领域。本发明披露了LINC00926和miR‑3194‑5p之间存在结合位点，沉默LINC00926后，miR‑3194‑5p的表达上调，从而抑制JAK1/STAT3信号通路，改善人脐静脉血管内皮细胞功能障碍，包括提高人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，抑制细胞凋亡。本发明为治疗CHD提供了一个新的潜在靶点，具有显著的应用前景和经济价值。

Description

信号通路在CHD药物开发中的应用
技术领域
本发明涉及信号通路在CHD药物开发中的应用，属于siRNA及其应用领域。
背景技术
基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类。RNA干扰是利用双链RNA根据碱基互补配对的原则特异性地识别靶mRNA，诱发mRNA高效特异性降解从而将其沉默不能进行后续的翻译。小干扰RNA(siRNA)药物根据RNA干扰机制，从转录后水平进行基因沉默或激活治疗，相比传统蛋白水平发挥作用的药物具有高特异性、高效性、长效性等明显优势。近年来，siRNA的稳定性修饰以及高效递送系统的开发进一步加快了siRNA药物的研发进展。
冠心病(Coronary heart disease,CHD)严重威胁着人类的健康。随着对心血管疾病的不断深入研究，人们发现内皮功能障碍在心血管疾病发生和发展中具有重要作用，内皮功能与心血管疾病的密切相关性受到广泛关注。内皮功能障碍的特征在于正常内皮细胞功能的失调，包括血管张力的控制、内皮细胞增殖、迁移等能力的紊乱。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于开发治疗冠心病的药物的信号通路，所述信号通路是双链siRNA与LINC00926结合，从而上调miR-3194-5p的表达，miR-3194-5p表达的上调又使得JAK1蛋白表达下调，同时下调STAT3磷酸化水平。
本发明还提供所述信号通路在开发用于治疗冠心病的药物中的应用，所述应用可以是：(1)开发抑制LINC00926表达的siRNA，通过上调miR-3194-5p水平，从而抑制JAK1/STAT3信号通路，改善人脐静脉血管内皮细胞功能障碍，治疗冠心病；
(2)开发JAK1抑制剂，从而抑制JAK1/STAT3信号通路，改善人脐静脉血管内皮细胞功能障碍，治疗冠心病；
(3)开发STAT3抑制剂，改善人脐静脉血管内皮细胞功能障碍，治疗冠心病。
本发明还提供一种双链siRNA(Small Interfering RNA)，能够沉默LINC00926，从而上调miR-3194-5p的表达，miR-3194-5p表达的上调又使得JAK1蛋白表达下调，同时下调STAT3磷酸化水平，提高人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，抑制细胞凋亡，从而高效地改善人脐静脉血管内皮细胞的功能障碍，起到治疗冠心病的作用。所述双链siRNA分子的双链核苷酸序列如下：
正义链：5’-GGCAGAUGAUCCAUCAGAAAAGA-3’(SEQ ID No:13)，
反义链：5’-UCUUUUCUGAUGGAUCAUCUGCC-3’(SEQ ID No:27)。
所述双链siRNA分子在3’末端还增加“dTdT”修饰。
本发明还提供一种药物组合物，用于改善人脐静脉内皮细胞功能障碍或治疗冠心病，以双链siRNA为核心成分，复配或添加其他药物载体和/或药用辅料。所述双链siRNA分子的双链核苷酸序列如下：
正义链：5’-GGCAGAUGAUCCAUCAGAAAAGA-3’(SEQ ID No:13)，
反义链：5’-UCUUUUCUGAUGGAUCAUCUGCC-3’(SEQ ID No:27)。
所述双链siRNA分子在3’末端还增加“dTdT”修饰。
所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒以及脂质体。
所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
所述药物组合物中，所述双链siRNA的浓度为30pmol，可以获得更好的技术效果。
本发明还提供所述上述药物组合物在开发抑制人脐静脉内皮细胞功能障碍或治疗冠心病的药物中的应用。
有益效果：
本发明披露了LINC00926和miR-3194-5p之间存在结合位点，沉默LINC00926后，miR-3194-5p的表达上调，从而抑制JAK1/STAT3信号通路，改善人脐静脉血管内皮细胞功能障碍。
本发明披露了LINC00926可抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，促进细胞凋亡；而LINC00926沉默可以提高人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，抑制细胞凋亡。因此LINC00926为治疗CHD提供了一个新的潜在靶点，具有显著的应用前景和经济价值。
本发明披露的si-LINC00926可抑制LINC00926的表达，能提高人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，抑制细胞凋亡。
本发明披露的si-LINC00926可用于制备治疗冠心病的药物，具有重要应用前景。
附图说明
图1实时荧光定量PCR和蛋白印迹实验检测常氧培养(Normal)的HUVECs和低氧处理(Hypoxia)的HUVECs细胞中LINC00926、miR-3194-5p、JAK1、STAT3表达的结果图。
图2实时荧光定量PCR检测三种si-LINC00926沉默效率的结果图。
图3实时荧光定量PCR和蛋白印迹实验检测各组miR-3194-5p、JAK1、STAT3表达结果图；以及双荧光素酶活性检测鉴定LINC00916与miR-3194-5p、miR-3194-5p与JAK1的结合的结果分析图。
图4实时荧光定量PCR和蛋白印迹实验检测各组低氧诱导的HUVEC细胞中JAK1、STAT3表达的结果图。
图5CCK-8法检测各实验组中HUVECs细胞增殖的结果分析图。
图6Transwell法检测各实验组中HUVECs细胞迁移的结果分析图。
图7管腔形成实验检测各实验组中HUVECs细胞成管能力的结果分析图。
图8流式细胞术检测各实验组中HUVECs细胞凋亡的结果分析图。
具体实施方式
术语
lncRNA，一般指长链非编码RNA，可参与心力衰竭、心肌肥厚、心脏代谢疾病、心肌梗死和动脉粥样硬化等各种心血管疾病的发生。包括下一代测序和微阵列分析在内的高通量技术，可以帮助筛选和发现参与CHD发展的差异表达lncRNA。LINC00926是一种lncRNA。
MicroRNA(miRNA)，是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA。miRNA被认为通过与靶mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)结合而发挥调节作用。从机制上讲，lncRNA 可以通过与miRNA结合上调mRNA来充当竞争性内源性RNA(ceRNA)。
信号通路(signal pathway)，是指当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应的现象。这些信号包括激素、生长因子、细胞因子、神经递质以及其它小分子化合物等。
JAK1-STAT3信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。
实施例1通过qRT-PCR和Western blot检测在常氧和低氧条件下HUVEC细胞中LINC00926、miR-3194-5p、JAK1和STAT3的表达。
1.细胞培养及处理：常氧(Normal)组：HUVEC细胞扩培，待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱内，培养24h。低氧(Hypoxia)组：HUVEC细胞扩培，待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/mL，接种于96孔培养板，每孔100μL，放入37℃，低氧(5％O2)培养箱中培养24h。
2.qRT-PCR检测：
(1)常氧和低氧组HUVEC细胞的总RNA抽提：(a)向上一步骤培养得到的每组细胞中加1mL Trizol溶液，充分混匀，冰上静置20min；(b)4℃10000g离心10min，吸取上清放入新的EP管中，不要吸到沉淀；(c)向离心管中加入预冷的氯仿(200μL氯仿/1mlL Trizol)，剧烈振荡15s，室温放置10min，离心(4℃，12000rpm)15min，离心液体分三层(下面是氯仿层，中间是油脂层，上面是含RNA的溶液层)，小心吸取上层液体(约600μL，约为所用TRIZOL试剂的60％)，转移到一个新的EP管中，不要吸到油脂层，可留少量上层液体不吸；(d)加入等体积(500μL)的异丙醇，颠倒混匀6-8次，-20℃冰箱放置6h；(e)4℃，10000rpm离心15min，可见RNA沉淀。弃上清，1mL 75％乙醇(75％乙醇的配置：1倍的DEPC处理水加3倍的无水乙醇)洗涤沉淀，4℃，8000rpm，离心5min，弃上清；(f)重复(e)步骤一遍，弃上清，吸净残存乙醇，自然干燥5-10min(注意切勿完全干燥)；(g)加入适量的Rnase-free H2O溶解RNA，-20℃冰箱，保存待用。
(2)cDNA合成：采用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，具体步骤如下：
(a)逆转录反应体系，在0.2mL PCR管中加入以下表1所示的试剂，
(b)混匀后37℃温浴5min，
(c)42℃温浴60min，
(d)70℃温浴10min，终止反应，
(e)将上述溶液-20℃保存。
表1逆转录反应体系
miRNA-R的序列如SEQ ID NO:28所示：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCCCTC。
(3)聚合酶链式反应PCR
(a)引物合成：Real-time PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0软件设计、合成，LINC00926和JAK1以管家基因Gapdh为内参，miR-3194-5p以U6为内参。引物序列见表2。
表2 RT-PCR所用的引物(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:10)
(b)Real time-PCR反应体系：根据Real time-PCR反应体系配制反应液。在PCR反应管中分别加入ddH2O、Sybr Green qPCR Master Mix、Forward primer、Reverse primer/统一反向URP、cDNA模板，充分混匀。反应体系按照表3配制。
表3 Real time-PCR反应体系
(c)PCR扩增条件：94℃10min，(94℃20秒、55℃20秒、72℃20秒)40个循环。
(4)Real-Time PCR数据处理
PCR扩增后，实时荧光定量PCR仪自动分析结果，根据阴性对照调整阈值和基线以确定各个标本的Ct值，并根据熔解曲线确定该Ct值是否有效。将结果导出，采用2-△△CT法分析目的基因在对照组和各实验组之间的表达差异，计算公式如下：△Ct＝Ct目的基因－Ct内参，记为△Ct对照，用各组的△Ct分别减去△Ct对照平均，求得△△Ct值，再计算各组2-△△CT值，即为各组中基因的相对表达量。
3.Western blot检测:
(1)样品准备：向细胞样本中加入预冷的已加PMSF的RIPA裂解液，充分裂解后12000g离心10min，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。
(2)蛋白定量：根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；各孔加入200μl BCA工作液；把酶标板放在振荡器上振荡30s，37℃放置30min，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为纵坐标，蛋白浓度(mg/ml)为横坐标，绘标准曲线；在酶标板中加入2.5μl待测蛋白和17.5μl PBS(稀释8倍)，加入200μl BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30s，37℃放置30min，然后在562nm下测定吸光度；根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(mg/ml)，根据样品浓度确定上样量。
(3)蛋白样品的制备：在提取的蛋白中加入5×SDS上样缓冲液，混合均匀后，放入沸水中水浴5min，使蛋白变性，12000r/min离心5min，所得蛋白样品直接上样检测或置于-80℃保存。
(4)制备合适的聚丙烯酰胺凝胶，装好电泳装置，倒入电泳缓冲液，用移液器分别将marker和25μg蛋白注入样品孔。
(5)电泳：浓缩胶恒定电压80V，30min；分离胶恒定电压120V，60min，至溴酚蓝接近凝胶底部时停止电泳，进行转膜。
(6)切胶：将玻璃板轻轻撬开，取出凝胶，以marker为对照进行切胶。
(7)转膜：将滤纸、PVDF膜剪成与凝胶尺寸大小相同，用甲醇浸泡PVDF膜15s。使膜由白色变为半透明后放入超纯水中，静置2min，将处理好的PVDF膜放入转膜缓冲液中平衡15min。按海绵垫，滤纸，凝胶，PVDF膜，滤纸，海绵垫的顺序叠加在一起，用玻璃棒赶走各层之间的气泡，放入转膜槽中，倒入转移缓冲液。
(8)封闭：将膜用TBST漂洗3次，每次5min，然后用5％的脱脂奶粉37℃缓慢震荡2h。
(9)孵育一抗：根据说明书确定一抗稀释比例，用封闭液稀释抗体至合适浓度，4℃过夜孵育。
(10)二抗孵育：待一抗孵育结束后，TBST冲洗3次，每次1min。将PVDF膜放入以1∶5000稀释的HRP标记的兔二抗或者鼠二抗溶液中，37℃缓慢振荡孵育l h。TBST冲洗3次，每次5min。
(11)显色：在膜上加入适量的ECL发光液，利用一体式化学发光仪拍摄照片。
如图1的A所示，HUVEC细胞中在常氧和低氧条件下LINC00926的mRNA表达差异显著，低氧条件下LINC00926表达量显著提高。miR-3194-5p在常氧和低氧条件下的表达差异显著，低氧条件下miR-3194-5p表达量显著降低。
如图1的A、B所示，与常氧组相比，低氧组JAK1的mRNA表达和蛋白表达明显升高。此外，p-STAT3/STAT3的比值也显著上升。
这些结果表明LINC00926、miR-3194-5p、JAK1和STAT3可能参与了冠心病的进展。
实施例2 qRT-PCR检测验证LINC00926 siRNA干预效率。
1.设计合成三种LINC00926 siRNA(si-LINC00926)，序列如下：
siRNA-1:GUGACCUUAAGCAAGUUACUUAAdtdt(SEQ ID No:11)
siRNA-2:CACUUUCCAUGGAUGAACAUUGU dtdt(SEQ ID No:12)
siRNA-3:GGCAGAUGAUCCAUCAGAAAAGAdtdt(SEQ ID No:13)
si-Ctrl序列如下：
UUCUCCGAACGUGUCACGUdtdt(SEQ ID No:14)
ACGUGACACGUUCGGAGAAdtdt(SEQ ID No:15)。
2.细胞转染：
(1)培养HUVEC细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/mL，接种于24孔培养板，每孔500μL，37℃，5％CO2培养箱内培养24h，观察细胞80％粘连。
(2)制备转染复合物：(A)用10μL无血清培养基分别稀释siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及si-Ctrl，轻轻混匀；(B)Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用25μL无血清培养基稀释0.5μL Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5min；将A和B的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20min，形成LINC00926 siRNA转染复合物。
(3)将步骤(1)的24孔板中培养上清液吸掉，PBS清洗细胞。
(4)每孔分别加入50μL培养基，再分别加入50μL上述LINC00926 siRNA转染复合物，每孔终体积为100μL。其中siRNA转染浓度为30pmol，每组设置3个复孔。
(5)37℃，5％CO2培养箱内培养4-6h后，吸掉上清液，加入100μL的完全培养基，于培养箱内培养48h后备用。
设置Normal组：正常培养细胞，不做转染操作。
3.qRT-PCR检测验证干预效率。
如图2所示：比Normal组相比，si-Ctrl转染组LINC00926表达不变，siRNA转染组LINC00926表达明显降低，其中siRNA-3沉默效果最为显著，选择siRNA-3用于后续实验。
实施例3 LINC00926通过miR-3194-5p在低氧诱导的HUVEC中调节JAK1/STAT3信号传导
1.通过qRT-PCR和Western blot确定LINC00926对miR-3194-5p、JAK1、STAT3表达的影响。
(1)构建LINC00926过表达质粒(无缝克隆)：
(a)以NheI/BamHI作为双酶切位点将pcDNA3.1(+)载体进行双酶切线性化；
(b)使用设计好的引物进行目的DNA片段(LINC00926序列如SEQ ID NO:16所示)的PCR扩增；
(c)将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到试管中进行重组反应；
(d)混匀后在PCR仪中适当温度孵育30-60min，得到LINC00926过表达质粒，然后转移至冰上；
(e)克隆产物直接转化宿主菌，涂平板挑选出阳性克隆子。
(2)实验分组I：
Normal：HUVEC细胞培养在37℃，5％CO2培养箱中。
Hypoxia：HUVEC细胞培养在低氧条件下(5％O2培养箱)24h。
Hypoxia+NC：转染空载质粒的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+LINC00926：转染LINC00926过表达质粒的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+si-Ctrl：转染si-Ctrl的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+si-Linc00926：转染Linc00926 siRNA-3的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
(3)细胞转染：
(a)培养HUVEC细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/mL，接种于24孔培养板，每孔500μL，37℃，5％CO2培养箱内培养24h，观察细胞80％粘连。
(b)制备转染复合物：(I)用15μl无血清培养基稀释过表达LINC00926质粒，轻轻混匀；(II)用10μl无血清培养基稀释si-Ctrl、Linc00926 siRNA-3及空载质粒，轻轻混匀；(III)Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用25μL无血清培养基稀释0.5μLLipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5min；将I、II的液体分别和III的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20min，形成各组转染复合物。
(c)将步骤(a)的24孔板中培养上清液吸掉，PBS清洗细胞。
(d)每孔分别加入50μL培养基，再分别加入50μL上述转染复合物，每孔终体积为100μL。其中siRNA转染浓度为30pmol，质粒浓度为100ng/孔，每组设置3个复孔。
(e)37℃，5％CO2培养箱内培养4-6h后，吸掉上清液，加入100μL的完全培养基，于培养箱内培养48h后备用。低氧组将细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
(4)用qRT-PCR检测miR-3194-5p和JAK1的mRNA水平，用Western blot检测JAK1和STAT3的蛋白表达。
具体操作同实施例1。
2.双荧光素酶活性检测鉴定LINC00916与miR-3194-5p、miR-3194-5p与JAK1的结合(1)构建报告质粒：
将含有miR-3194-5p结合位点的LINC00926–WT 3’UTR片段、LINC00926-MUT 3’UTR片段、JAK1-WT 3’UTR片段和JAK1-MUT 3’UTR片段插入到psiCHECKTM-2荧光素酶报告基因载体，分别构建LINC00926-3’UTR野生型(LINC00926-WT)及突变型(LINC00926-MUT)报告质粒，JAK1-3’UTR野生型(JAK1-WT)及突变型(JAK1-MUT)报告质粒。
LINC00926–WT 3’UTR片段(SEQ ID NO:17)：
GCCCCACCTACTAAGAACCAAGTCTGGTTCACCGGCTCCCAAGAGCTGGAACCCATTCTCAGCTAGCTGGGGGCCCAGGCCACCCCTTCCCTCCAGACCTGTGTGCCTTCTGCCCTGGCTCCAGGGCCCCCCACACCGTGACCAGGGCGGGATCCCTATGGGGCTGGCCAGGCGGCACCGTGCCAGGCCCACAGTGCCCTGGGCGTCCATGGAAGTCGTTCTGTGTCTTTAAAATCAGAAGGAAGACATTAACCTTTAGGCTGAAGAAAATGTTTTAGTACACAGCAATAACTTATTTGTCTTTATCCAACAGCCATAA
LINC00926-MUT 3’UTR片段(SEQ ID NO:18)：
GCCCCACCTACTAAGAACCAAGTCTGGTTCACCGGCTCCCAAGAGCTGGAACCCATTCTCAGCTAGCTGGGGGCCCAGGCCACCCCTTCCCTCCAGACCTGTGTGCCTTCTGCCCTGGCTCCAGGGCCCCCCACACCGTGACCAGGGCGGGATTTTCACAAAATCAATCAGGCGGCACCGTGCCAGGCCCACAGTGCCCTGGGCGTCCATGGAAGTCGTTCTGTGTCTTTAAAATCAGAAGGAAGACATTAACCTTTAGGCTGAAGAAAATGTTTTAGTACACAGCAATAACTTATTTGTCTTTATCCAACAGCCATAA
JAK1-WT 3’UTR片段(SEQ ID NO:19)：
ACTCCTCCTTGTGGAAAGAATATACCACCATTTCATCTGGCTAGTTCACCATCACAACTGCATTACCAAAAGGGGATTTTTGAAAACGAGGAGTTGACCAAAATAATATCTGAAGATGATTGCTTTTCCCTGCTGCCAGCTGATCTGAAATGTTTTGCTGGCACATTAATCATAGATAAAGAAAGATTGATGGACTTAGCCCTCAAATTTCAGTATCTATACAGTACTAGACCATGCATTCTTAAAATATTAGATACCAGGTAGTATATATTGTTTCTGTACAAAAATGACTGTATTCTCTCACCAGTAGGACTTAAAC
JAK1-MUT 3’UTR片段(SEQ ID NO:20)：
ACTCCTCCTTGTGGAAAGAATATACCACCATTTCATCTGGCTAGTTCACCATCACAACTGCATTACCAAAAGGGGATTTTTGAAAACGAGGAGTTGACCAAAATAATATCTGAAGATGATTGCTTTTCCCTGCTGCCAGCTGATCTGAAATGTTTTATCAATGCATTAATCATAGATAAAGAAAGATTGATGGACTTAGCCCTCAAATTTCAGTATCTATACAGTACTAGACCATGCATTCTTAAAATATTAGATACCAGGTAGTATATATTGTTTCTGTACAAAAATGACTGTATTCTCTCACCAGTAGGACTTAAAC
(2)将构建的报告质粒与miRNA mimics共转染细胞，miRNA mimics信息如下：
miR-3194-5p mimics：
sence:5‘-GGCCAGCCACCAGGAGGGCUG-3’(SEQ ID NO:21)
antisence:5‘-GCCCUCCUGGUGGCUGGCCUU-3’(SEQ ID NO:22)
mimics NC：
sence:5‘-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’(SEQ ID NO:23)
antisence:5‘-GUACUUUUGUGUAGUACAAUU-3’(SEQ ID NO:24)
(a)实验分组II如下：
psicheck2-LINC00926-WT+mimics NC，
psicheck2-LINC00926-WT+miR-3194-5p mimics，
psicheck2-LINC00926-MUT+mimics NC，
psicheck2-LINC00926-MUT+miR-3194-5p mimics，
psicheck2-JAK1-WT+mimics NC，
psicheck2-JAK1-WT+miR-3194-5p mimics，
psicheck2-JAK1-MUT+mimics NC，
psicheck2-JAK1-MUT+miR-3194-5p mimics。
(b)转染前一天，HEK293T细胞按2×104个/孔接种于96孔板上，每组3复孔，培养基为100μl含10％FBS的DMEM-高糖培养基，置于5％CO2、37℃培养箱中。
(c)转染当天，按下表4配制转染体系：
表4
室温下静置5min。
(d)将A液和B液混合后，室温下静置20min。
(e)每孔加入20μL(d)中的转染复合液，在5％CO2、37℃培养箱中培养。
(3)Lucifersae检测
用Promega公司Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1910)进行样品Luciferase活性检测。具体步骤为：
(a)转染48h后，吸去旧的培养基，每孔细胞加入100μL的PLB(Passive LysisBuffer)，摇床上室温裂解15min。
(b)将20μL细胞裂解液加入发光板后，用Thermo Scientific的Varioskan LUX多功能酶标仪读取背景值2s。
(c)每孔加入20μL的LAR II工作液，快速混匀，读值2s。
(d)读值完毕后，每样品再加入20μL的Stop&Reagent，快速混匀后，放入发光检测仪中，运行程序，读取荧光值2s，读值结束后，保存数据。
(4)检测结果分析：
分别读取背景值、内参萤火虫荧光素、海肾荧光素值，两个荧光值各自减去背景值后计算比值:(海肾-本底)/(内参萤火虫-本底)。
3.通过qRT-PCR和Western blot确定miR-3194-5p对JAK1、STAT3表达的影响。
(1)实验分组III：
Hypoxia：HUVEC细胞培养在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+mimics NC：作为模拟物对照组，转染mimics NC的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+miR-3194-5p mimics：为探究miR-3194-5p对低氧诱导的HUVEC细胞中JAK1、STAT3表达的影响，将转染miR-3194-5p mimics的HUVEC细胞置于低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+inhibitor NC：作为抑制剂对照组，转染inhibitor NC的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+miR-3194-5p inhibitor：为探究低氧诱导的HUVEC细胞中抑制miR-3194-5p对JAK1、STAT3表达的影响，将转染miR-3194-5p inhibitor的HUVEC细胞置于低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
mimics和inhibitor具体信息如下：
miR-3194-5p mimics：
sence:5‘-GGCCAGCCACCAGGAGGGCUG-3’(SEQ ID NO:21)
antisence:5‘-GCCCUCCUGGUGGCUGGCCUU-3’(SEQ ID NO:22)
mimics NC：
sence:5‘-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’(SEQ ID NO:23)
antisence:5‘-GUACUUUUGUGUAGUACAAUU-3’(SEQ ID NO:24)
miR-3194-5p inhibitor：5‘-CAGCCCUCCUGGUGGCUGGCC-3’(SEQ ID NO:25)
inhibitor NC：5‘-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO:26)
(2)细胞转染处理：
(a)培养HUVEC细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/ml，接种于6孔培养板，每孔3mL，37℃，5％CO2培养箱内培养24h，观察细胞80％粘连。
(b)转染步骤：配制A液和B液。A液:用不含血清的RPMI-1640(150μL)与9μL的RNAi MAX Reagent混匀，室温下孵育5min；B液:用不含血清的RPMI-1640培养基(150μl)与50nmol的mimics和inhibitor室温下混匀，孵育5min；将A、B两液混匀后加入到6孔板中，置于37℃恒温培养箱中培养4～6h，补液，继续培养48h后收样。转染后的细胞放入低氧培养箱继续培养24h。
(3)qRT-PCR检测JAK1的mRNA水平。Western blot检测JAK1、STAT3的蛋白表达。
具体操作同实施例1。
实验结果：
如图3的A所示，与常氧组相比，低氧组miR-3194-5p的表达水平降低，LINC00926过表达进一步下调miR-3194-5p表达，而si-LINC00926上调miR-3194-5p的表达。相反，低氧使JAK1的mRNA水平升高，LINC00926过表达进一步上调JAK1的表达，而si-LINC00926下调JAK1的表达。
如图3的B所示，与常氧组相比，低氧组中JAK1蛋白水平和p-STAT3/STAT3的比值明显上升，而这些变化在过表达LINC00926后进一步增强，但沉默LINC00926抑制了这些变化。
如图3的C所示，miR-3194-5p mimics可直接与LINC00926 -3'UTR靶位点和JAK1 -3'UTR靶位点结合。
如图3的D所示，低氧条件下，miR-3194-5p mimics下调了JAK1的mRNA水平，而miR-3194-5p inhibitor逆转了以上变化。
如图3的E所示，低氧条件下，miR-3194-5p mimics降低了p-STAT3/STAT3的比值和JAK1的蛋白水平，而miR-3194-5p inhibitor逆转了以上变化。
这些结果表明LINC00926通过miR-3194-5p在低氧诱导的HUVEC中调节JAK1/STAT3信号传导。
实施例4 LINC00926通过miR-3194-5p调节低氧条件下HUVEC细胞增殖/迁移/凋亡/成管的影响
1.实验分组：
Hypoxia:HUVEC细胞培养在低氧条件下(5％O2培养箱)24h。
Hypoxia+NC:转染NC空载质粒的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+LINC00926:转染LINC00926过表达质粒的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+LINC00926+mimics NC:共转染LINC00926过表达质粒和mimics NC的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
Hypoxia+LINC00926+miR-3194-5p mimics:共转染LINC00926过表达质粒和miR-3194-5p mimics的HUVEC细胞在低氧条件下(5％O2培养箱)培养24h。
2.细胞转染：
(1)培养HUVEC细胞，待细胞长满后调整细胞浓度为1×105cells/ml，接种于24孔培养板，每孔500μL，37℃，5％CO2培养箱内培养24h，观察细胞80％粘连。
(2)制备转染复合物：(A)用15μL无血清培养基稀释过表达LINC00926质粒，轻轻混匀；(B)用10μL无血清培养基稀释miR-3194-5p mimic及NC空载质粒，轻轻混匀；(C)Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用25μL无血清培养基稀释0.5μL Lipofectamine2000，轻轻混匀，室温孵育5min；将A、B、C的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20min，形成转染复合物。
(3)将24孔板中培养上清液吸掉，PBS清洗细胞。
(4)每孔分别加入50μL培养基，再分别加入50μL上述转染复合物，每孔终体积为100μL。其中，mimics转染浓度为50nM，质粒浓度为100ng/孔，每组设置3个复孔。
(5)37℃，5％CO2培养箱内培养4-6h后，吸掉上清液，加入100μL的完全培养基，于培养箱内培养48h后备用。Hypoxia组细胞放入低氧培养箱培养24h。
3.qRT-PCR检测JAK1的mRNA水平。Western blot检测JAK1、STAT3的蛋白表达。
具体操作同实施例1。
4.CCK-8实验检测细胞增殖
(1)待各组细胞培养至相应时间点后，进行CCK8检测；
(2)每孔加入20μL的CCK-8，37℃，5％CO2培养箱内培养避光孵育3h。
(3)酶标仪450nm波长测出同一时间点OD值，用测得的OD值进行细胞生长影响的分析。
5.Transwell实验检测细胞迁移
(1)待细胞长满后调整细胞浓度，于上室加入200μL细胞悬液，按照分组进行培养，48h后在下室内加入600μL的含有血清的培养基，放入细胞培养箱，在37℃，5％CO2条件下分别培养48h。
(2)取出小室，吸弃上室液体，用棉签仔细擦净，37℃预温的PBS液漂洗两次，用冰预冷的4％多聚甲醛固定30min，0.1％结晶紫染色10min。
(3)小心将聚碳酯膜自上室基底切取下来，封片后在显微镜下拍照观察。
6.管腔形成实验检测细胞成管能力
(1)Matrigel基质胶4℃过夜溶解，枪头盒、EP管、24孔板均4℃过夜预冷；
(2)次日在冰盒上进行铺胶，将Matrigel基质胶250μL/孔加入24孔板，37℃孵箱放置30min；
(3)在胶凝固的过程中，可以开始准备细胞悬液(细胞按照之前的分组)，细胞消化后将细胞悬液浓度调整到2×105cell/mL。
(4)每孔接种50000细胞，然后放入孵箱中培养6h。
(5)6小时后加入钙黄绿素Calcein AM染色，Calcein AM终浓度为0.25μg/mL。
(6)钙黄绿素染色30min后于荧光显微镜下观察拍摄。
7.流式细胞术检测细胞凋亡
(1)收集各组细胞进行细胞凋亡检测：用不含EDTA的胰酶消化收集后(注:胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合)，在室温中，1500rpm离心5min，收集细胞；
(2)细胞洗涤：用预冷1*PBS(4℃)重悬细胞一次，1500rpm离心5min，洗涤细胞；
(3)加入300μL的1*Binding Buffer悬浮细胞；
(4)Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15min；
(5)PI标记：再加入10μL的PI染色，轻轻混匀细胞，于避光条件下室温孵育10min；
(6)流式细胞仪检测，FlowJo 7.6软件分析。
实验结果：
如图4的A所示：相比Hypoxia组，过表达LINC00926显著上调了JAK1的mRNA水平；相比Hypoxia+LINC00926+mimics NC组，转染miR-3194-5p mimic会显著降低JAK1的表达水平。
如图4的B所示：相比Hypoxia组，LINC00926过表达使p-STAT3/STAT3比值和JAK1蛋白表达显著升高；相比Hypoxia+LINC00926+mimics NC组，转染miR-3194-5p mimic显著降低了p-STAT3/STAT3比值和JAK1蛋白表达。
如图5所示：相比Hypoxia处理组，过表达LINC00926后细胞增殖能力显著降低，细胞状态更差，折光性显著变差，细胞形态不完整；转染miR-3194-5p mimic后细胞增殖能力显著增加，细胞状态显著改善。
如图6所示：相比Hypoxia处理组，过表达LINC00926后细胞迁移能力显著减弱；转染miR-3194-5p mimic后细胞迁移能力显著增加。
如图7所示：相比Hypoxia处理组，过表达LINC00926后细胞成管能力显著减弱；转染miR-3194-5p mimic后细胞成管能力显著增加。
如图8所示：相比Hypoxia处理组，过表达LINC00926后细胞凋亡比例显著增加；转染miR-3194-5p mimic后细胞凋亡率显著降低。
上述结果表明在低氧诱导的HUVEC细胞中，LINC00926通过miR-3194-5p调节对血管内皮细胞增殖/迁移/凋亡/成管的影响。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.药物组合物，其特征在于，包括作用于LINC00926的siRNA，所述siRNA正义链核苷酸序列如SEQ ID No:13所示；反义链核苷酸序列如SEQ ID No:27所示；
所述siRNA与LINC00926结合，从而上调miR-3194-5p的表达，miR-3194-5p表达的上调又使得JAK1蛋白表达下调，同时下调STAT3磷酸化水平。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中还包括药物载体，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒或脂质体。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括辅料，所述辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述siRNA的浓度为30pmol。
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Knockdown of lnc-KCNC3-3:1 Alleviates the Development of Atherosclerosis via Downregulation of JAK1/STAT3 Signaling Pathway;Limin Sun等;FRONTIERS IN CARDIOVASCULAR MEDICINE;第8卷;第1页摘要 *
冠心病血瘀证相关IncRNA-miRNA-mRNA调控网络研究;廖江铨;中国博士学位全文数据库 医药卫生科技辑(第8期);第73页"6.3.3 冠心病血瘀证相关差异基因筛选"项下，表6a *

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