CN114231529A

CN114231529A - 一种人pkmyt1ar基因及其应用

Info

Publication number: CN114231529A
Application number: CN202111364796.5A
Authority: CN
Inventors: 杨翠萍; 陈勇彬; 熊秋霞
Original assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-11-17
Also published as: CN114231529B

Abstract

本发明公开了一种人PKMYT1AR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明将检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂应用在制备非小细胞肺癌临床诊断试剂中，人PKMYT1AR基因表达水平高低与非小细胞肺癌临床预后呈负相关性，实验结果显示人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌细胞系中较正常肺上皮细胞表达高；PKMYT1AR基因敲低后，非小细胞肺癌细胞系的增殖受到显著抑制，细胞周期阻滞在G0/G1期；可明显增加非小细胞肺癌临床铂类化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用；本发明揭示了PKMYT1AR基因是非小细胞肺癌的潜在风险基因，PKMYT1AR表达抑制与放疗或化疗药物DDP联用，加强非小细胞肺癌的临床治疗效果。

Description

一种人PKMYT1AR基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因及其新用途，尤其是人PKMYT1AR基因及其在肿瘤临床诊断以及药物筛选中的用途，具体涉及人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌临床诊断以及药物筛选中的应用。

背景技术

肺癌是一种起源于支气管粘膜或腺体的致命恶性肿瘤，可分为小细胞肺癌(SCLC：small cell lung cancer)和非小细胞肺癌(NSCLC：non-small cell lung cancer)。SCLC和NSCLC约分别占肺部的20％和80％癌症病例，而NSCLC可以进一步细分为腺癌(LUAD)、鳞状细胞癌(LUSC)和大细胞肺癌。肺癌早期治疗方案是基于手术的综合治疗，多学科治疗在晚期非小细胞肺癌治疗中发挥重要作用，放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗或联合治疗是目前主要的治疗策略。NSCLC的发病率相对较高，近年来，随着诊断和治疗策略的提升，非小细胞肺癌的治疗有了很大的改善，但5年生存率低于17％。因此，仍然有必要研究调节肺癌进展的分子机制，以期发现新的治疗靶点，改善临床结果。

长链非编码RNA(lncRNA：Long non-coding RNAs)是超过200个核苷酸且几乎没有蛋白质编码潜力的核苷酸链，虽然这些lncRNA的功能重要性和分子机制还有待进一步研究。LncRNA可通过不同的机制调节肿瘤进展，其中LncRNA作为竞争内源性RNA(ceRNA)的功能，作为"微RNA(miRNA)海绵"消除miRNA介导的对靶向基因的抑制而备受关注。微RNA是一类短(平均18-25核苷酸)内源性RNA，可以通过与目标mRNA 3'非翻译区(3’-UTR)结合，抑制目标mRNA的稳定性和转化效率从而调节基因表达的RNA。因此，miRNA可以减少抑癌基因的表达，或增加促癌基因表达促进肺癌的发生或进展。基于非编码RNA参与调节化疗或放射治疗敏感性，以及靶向药物的治疗，已经开发了以核酸为基础的策略，要么通过控制lncRNA的表达水平或针对靶向RNA修改原生结构。其中，基于RNA干扰(RNAi)技术和抗顺义寡核苷酸(ASO)被广泛应用。

越来越多的研究表明，肿瘤干细胞具有干细胞的生物学特性，例如，其有自我更新和分化能力，并与肿瘤的转移和耐药有重要的关系，具有重要的临床意义。然而其潜在的分子机制尚不明确。另外，许多有案可查的发现表明，在肿瘤的进展过程中，lncRNA或miRNA在肿瘤干细胞中发挥着至关重要的作用。分子机制研究发现，在正常干细胞自我更新中发挥重要功能的多条信号通路，如Wnt/b-catenin、Hedgehog和Notch信号通路等在肿瘤干细胞的干性维持中都发挥了关键作用，并挖掘到了各种肿瘤干细胞的标志物基因，如CD133、CD44、ALCAM and CD90等。

PKMYT1是一种膜相关酪氨酸/苏氨酸1蛋白激酶，是WEE家族激酶的成员之一，在细胞周期转换过程中抑制Cdk1磷酸化。之后，多项研究发现PKMYT1在不同类型的人类癌症中发挥致癌作用。然而在肺癌中PKMYT1表达如何上调，及其特异的下游靶基因的潜在机制仍然不清楚。

发明内容

本发明提供一种人PKMYT1AR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因是长链非编码RNA(lncRNA)。

本发明另一目的是将上述基因应用在非小细胞肺癌临床诊断中，即将检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂应用在制备非小细胞肺癌临床诊断试剂中；人PKMYT1AR基因作为非小细胞肺癌关联基因，应用于非小细胞肺癌检测，检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂是检测人PKMYT1AR基因高表达量的试剂，即将人PKMYT1AR基因高表达作为诊断非小细胞肺癌的标志。

检测人PKMYT1AR基因表达量可以利用人PKMYT1AR基因序列设计人PKMYT1AR的引物序列，并通过实时定量PCR法检测人PKMYT1AR的RNA的水平；所述引物序列为：

SEQ ID NO:2：CCACGGCACCAACACTAGTA；

SEQ ID NO:3：ATCTCAGCACTTTGGGAGGC。

针对非小细胞肺癌中PKMYT1AR高表达的情况，本发明另一目的是将以抑制人PKMYT1AR基因高表达为目的，筛选用于制备治疗非小细胞肺癌的药物。

针对非小细胞肺癌中人PKMYT1AR高表达的表型，将非小细胞肺癌的作用靶点---PKMYT1AR基因作为RNA干扰作用靶标，所述RNA干扰作用靶点选自下述核苷酸序列：

SEQ ID NO:4：GCTTAGCTTCCTCTTGAAGGA；

SEQ ID NO:5：GCCTTCCTTACGCAGAGAATG。

将抑制人PKMYT1AR基因表达的shRNA序列克隆入慢病毒载体后获得RNA干扰慢病毒，RNA干扰慢病毒感染非小细胞肺癌细胞后，用于筛选非小细胞肺癌治疗药物的细胞系；表达shRNA的序列包括两个靶向人PKMYT1AR基因编码DNA的反向重复序列，中间由一茎环序列分隔；其中，两个反向重复序列分别为人PKMYT1AR基因的shRNA靶点序列及其互补序列。

所述表达shRNA的序列的正义链序列如SEQ ID NO:6所示，反义链序列如SEQ IDNO:7所示；或者正义链序列如SEQ ID NO:8所示和反义链序列如SEQ ID NO:9所示。

Forward oligo:PKMYT1AR FO1(SEQ ID NO:6)

CCGGGCTTAGCTTCCTCTTGAAGGACTCGAGTCCTTCAAGAGGAAGCTAAGCTTTTTG；

Reverse oligo:PKMYT1AR RO1(SEQ ID NO:7)

AATTCAAAAAGCTTAGCTTCCTCTTGAAGGACTCGAGTCCTTCAAGAGGAAGCTAAGC；或者

Forward oligo:PKMYT1AR FO2(SEQ ID NO:8)

CCGGGCCTTCCTTACGCAGAGAATGCTCGAGCATTCTCTGCGTAAGGAAGGCTTTTTG；

Reverse oligo:PKMYT1AR RO2(SEQ ID NO:9)

AATTCAAAAAGCCTTCCTTACGCAGAGAATGCTCGAGCATTCTCTGCGTAAGGAAGGC

将抑制人PKMYT1AR基因表达的ASO序列用于筛选制备非小细胞肺癌治疗的药物，ASO核苷酸序列选自下述序列：

SEQ ID NO:10：GGCCTTGAAGCTGGAGTGCA；

SEQ ID NO:11：GCCATATCTGTATTTCTGGT。

本发明在研究中发现人PKMYT1AR基因与非小细胞肺癌的发生发展的相关性，通过肿瘤芯片染色结果及网络数据库分析发现，人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌中高表达，且其表达量高低与预后呈负相关。因此，我们通过NCBI数据库，找到人PKMYT1AR的序列，人PKMYT1AR基因的核苷酸序列见genebank中位于19号染色体的chr19:57477649-57482996位，所示RNA序列见57477649-57482996，具体染色体位置就是：chr19:57477649-57482996。Description:AC003005.2(from geneSymbol)；Gencode Transcript:ENST00000595422.1；Gencode Gene:ENSG00000268266.1。

根据人PKMYT1AR基因的序列，我们利用实时定量PCR发现人PKMYT1AR基因确实在多个非小细胞肺癌细胞系中高表达，因此我们将靶向人PKMYT1AR的shRNAs转染非小细胞肺癌细胞，构建稳转细胞系，观察其在肿瘤细胞中的定位及对增殖能力的影响。我们首先评估了所设计的shRNA的敲低效率，实时定量PCR结果显示，shRNAs降低PKMYT1AR表达及其下游靶蛋白PKMYT1的表达，与对照相比，差异有显著性(P<0.001)。PKMYT1AR基因敲低的非小细胞肺癌细胞的生长显著较对照组慢，过表达PKMYT1AR，则反之。进一步检测其细胞周期分布，发现敲低PKMYT1AR基因的表达可以将细胞阻滞在G0/G1期，促进非小细胞肺癌细胞的凋亡，抑制非小细胞肺癌的裸鼠移植瘤形成能力，降低非小细胞肺癌细胞体内增殖，促进非小细胞肺癌细胞在体内凋亡。

深入的研究发现PKMYT1AR敲低表达的细胞在顺铂和放疗处理时，这些非小细胞肺癌细胞表现出对顺铂和放疗更加敏感，细胞凋亡更加显著，裸鼠移植瘤体内实验进一步证实敲低PKMYT1AR基因的表达，非小细胞肺癌对顺铂更加敏感，表明敲低或抑制PKMYT1AR的表达的方法或药物在未来可与其他治疗方式联合使用，用于增强非小细胞肺癌患者的治疗效果。

总之，实验结果显示：PKMYT1AR基因在体外对非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡和放化疗耐受有调节作用；PKMYT1AR基因敲低后，肿瘤细胞的增殖受到显著抑制，凋亡显著增加，对化疗药物顺铂和放疗更加敏感。本发明首次揭示了人PKMYT1AR基因是非小细胞肺癌发生发展的潜在风险基因，为非小细胞肺癌的临床诊断提供新的生物标志物；本发明明确了PKMYT1AR基因的表达与非小细胞肺癌发生发展的相关性，通过降低PKMYT1AR基因的表达，以及与顺铂或放疗联合用于非小细胞肺癌的治疗，本发明具有较大的应用价值和前景。

附图说明

图1为LncRNAENST00000595422(PKMYT1AR)、LINC01124、NEAT1在非小细胞肺癌网络数据库GSE144520、GSE81089、GSE157427中的表达情况；

图2为TCGA数据库中人PKMYT1AR在肺腺癌(LUAD，左图)和肺鳞癌(LUSC，右图)中的表达情况；

图3为人PKMYT1AR表达高低与病人总生存期之间的关联性分析；

图4为人PKMYT1AR主要定位在细胞质中，其中A图通过LncLocater软件分析的细胞内的定位情况；B图为核质分离实验检测人PKMYT1AR在细胞内的定位情况；C图为免疫荧光染色检测人PKMYT1AR(上排图)在细胞内的定位情况；下排图为18s RNA对照组；

图5为人PKMYT1AR在非小细胞肺癌病人中的表达情况，A图为非小细胞肺癌的临床组织样本中的表达情况；B图为人PKMYT1AR在非小细胞肺癌的患者的血清样本中的表达情况；

图6为人PKMYT1AR在正常肺上皮细胞(Beas-2b)、非小细胞肺癌细胞系(H358、H1975、H1299、H1650、A549和SPC-A1)中RNA表达水平检测结果；

图7为非小细胞肺癌细胞株A549(左图)和SPC-A1(右图)在贴壁培养和悬浮培养条件下PKMYT1AR基因及肿瘤干细胞生物标志物CD133、SOX2和CD44的表达情况；

图8为人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌细胞系A549和SPC-A1及其对应耐药细胞株中的表达情况；

图9为miR-485-5p mimics处理后细胞内其下游靶基因PKMYT1及肿瘤干细胞标志物(CD44、OCT4、SOX2和Nanog)mRNA表达的情况，A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图10为PKMYT1AR ASO处理的细胞内人PKMYT1AR的RNA表达情况，左图为A549稳转细胞株，右图为SPC-A1稳转细胞株；

图11为在非小细胞肺癌细胞系A549和SPC-A1中敲低或过表达人PKMYT1AR基因构建稳转细胞株的检测结果；其中A图为A549细胞中稳转细胞株的PKMYT1AR RNA的表达情况，B图为SPC-A1细胞中稳转细胞株的PKMYT1AR RNA的表达情况；图中Ctrl shRNA为scrambleshRNA对照细胞株；MYT1AR sh#1为敲低PKMYT1ARshRNA#1的稳转细胞株；MYT1AR sh#2为敲低PKMYT1ARshRNA#2的稳转细胞株；pCDH-Vec是对照组细胞；MYT1AR ove是过表达PKMYT1AR稳转细胞株；

图12为人PKMYT1AR基因敲低稳转细胞系细胞中肿瘤干细胞标志物(CD44、OCT4、SOX2和Nanog)mRNA的表达情况；其中A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图13为在非小细胞肺癌细胞系A549和SPC-A1中敲低或过表达人PKMYT1AR基因拯救PKMYT1AR敲低的稳转细胞株的细胞生长结果统计图；其中A图为A549细胞，B图为SPC-A1细胞；

图14为PKMYT1AR ASO处理的细胞生长曲线实验结果，左图为A549稳转细胞株，右图为SPC-A1稳转细胞株；

图15为非小细胞肺癌细胞系A549(A图)和SPC-A1(B图)中敲低和敲低后过表达人PKMYT1AR基因拯救敲低的细胞中克隆球形成实验结果及统计图；

图16为人PKMYT1AR基因敲低以及敲低后过表达PKMYT1的稳转细胞系细胞克隆球形成实验检测及定量结果，其中A图为A549稳转细胞株(上排)和SPC-A1稳转细胞株(下排)染色展示图，B图为A图的定量结果；

图17为PKMYT1AR ASO处理的细胞克隆球形成实验及定量结果，其中A图为A549细胞株，B图为SPC-A1细胞株；

图18为细胞周期检测结果，其中A图为A549稳转细胞系中细胞周期流式检测及统计结果，B图为SPC-A1稳转细胞株中细胞周期的流式检测及统计结果；

图19为细胞周期相关蛋白免疫印迹结果，其中A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图20为细胞迁移相关蛋白免疫印迹结果，其中A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图21为PKMYT1AR基因敲低稳转细胞系细胞在顺铂用药时细胞凋亡相关蛋白检测结果，其中左图为A549稳转细胞株，右图为SPC-A1稳转细胞株；

图22为PKMYT1AR基因敲低稳转细胞系细胞中肿瘤干细胞标志物的蛋白表达情况，其中A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图23为PKMYT1AR ASO处理的细胞中PKMYT1及肿瘤干细胞标志物(SOX2和CD44)表达结果，其中左图为A549稳转细胞株，右图为SPC-A1稳转细胞株；

图24为PKMYT1AR基因敲低以及敲低后过表达PKMYT1AR的稳转细胞系细胞划痕实验检测及定量结果，其中A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图25为PKMYT1AR基因敲低以及敲低后过表达PKMYT1AR的稳转细胞系小室迁移实验检测及定量结果，其中A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图26为PKMYT1AR ASO处理的细胞小室迁移实验及定量结果，其中A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图27为不同稳转株的裸鼠移植瘤形成实验结果，其中A图为裸鼠移植瘤展示图，B图为裸鼠移植瘤肿瘤重量统计结果，C图为裸鼠移植瘤肿瘤体积大小及增长情况统计结果；

图28为PKMYT1AR基因敲低以及敲低后过表达PKMYT1的稳转细胞系裸鼠移植瘤形成实验结果，其中A图为裸鼠移植瘤展示图，B图为裸鼠移植瘤肿瘤重量统计结果，C图为裸鼠移植瘤肿瘤体积大小及增长情况统计结果；

图29为PKMYT1AR ASO处理的细胞裸鼠移植瘤形成实验结果，其中A图为裸鼠移植瘤展示图，B图为裸鼠移植瘤肿瘤重量统计结果，C图为裸鼠移植瘤肿瘤体积大小及增长情况统计结果；

图30为不同稳转株的裸鼠移植瘤体内增殖实验Ki67免疫组化染色及统计结果，其中Ctrl shRNA为scramble shRNA对照细胞株，MYT1AR sh#1为敲低PKMYT1ARshRNA#1的稳转细胞株，MYT1AR sh#2为敲低PKMYT1ARshRNA#2的稳转细胞株；

图31为不同稳转株的裸鼠移植瘤体内凋亡实验Cleaved-Caspase 3(CC3)免疫组化染色及统计结果，其中Ctrl shRNA为scramble shRNA对照细胞株，MYT1AR sh#1为敲低PKMYT1ARshRNA#1的稳转细胞株，MYT1AR sh#2为敲低PKMYT1ARshRNA#2的稳转细胞株；

图32为PKMYT1AR基因敲低以及敲低后过表达PKMYT1的稳转细胞系裸鼠移植瘤体内增殖(Ki67)和凋亡(CC3)实验免疫组化染色结果和定量统计结果，A图为免疫组化染色实验结果，B图为免疫组化染色统计结果；

图33为PKMYT1AR ASO处理的细胞裸鼠移植瘤体内PKMYT1蛋白表达及移植瘤增殖(Ki67)和凋亡(CC3)实验免疫组化染色结果和定量统计结果；

图34为miR-485-5p是PKMYT1AR的靶基因，A图为miR-485-5p和PKMYT1AR互作序列示意图，B图为荧光素酶活性实验；

图35为PKMYT1是miR-485-5p的靶基因，A图为miR-485-5p和PKMYT1互作序列示意图，B图为荧光素酶活性结果；

图36为PKMYT1表达与PKMYT1AR表达的相关性分析；

图37为PKMYT1表达与miR-485-5p表达的相关性分析；

图38为PKMYT1AR基因敲低稳转细胞系细胞在顺铂用药时的IC50检测结果，左图为A549稳转细胞株，右图为SPC-A1稳转细胞株；

图39为PKMYT1AR基因敲低稳转细胞系细胞在顺铂用药时的细胞凋亡检测结果，A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图40为PKMYT1AR基因敲低稳转细胞系细胞在放疗后的克隆球形成实验检测及定量结果，A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图41为PKMYT1AR基因敲低稳转细胞系细胞悬浮培养形成肿瘤微球的情况，A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图42为miR-485-5p mimics处理的细胞被PKMYT1AR(上)和PKMYT1(中)过表达拯救及PKMYT1AR敲低后过表达PKMYT1拯救(下)的肿瘤微球形成情况及定量分析，A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

图43为PKMYT1AR ASO处理的细胞肿瘤微球形成实验及定量结果，A图为A549稳转细胞株，B图为SPC-A1稳转细胞株；

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。

实施例1：网络数据库应用

1、研究对象PKMYT1AR筛选

通过下载GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)数据库中3个数据集，数据集及其研究对象分别是(1)GSE81089肺癌与癌旁组织的转录组测序基因表达数据集；(2)GSE144520:A549 cells and cisplatin-resistance A549/DPP cells的转录组测序基因表达数据集；(3)GSE157427:肺癌细胞与肺癌干细胞的转录组测序基因表达数据集，分别筛选数据集中logFC>2，p<0.01，获取的显著上调的lncRNA在取其共同交集。

结果如图1所示，一共获得3个lncRNA，包括LINC01224、NEAT1和ENST00000595422(PKMYT1AR)，去除已经有多篇文献报道的LINC01224和NEAT，选择ENST00000595422作为后续研究对象。

2、人PKMYT1AR基因表达及其与生存情况关联性分析

本研究中使用的所有数据集均可供公众使用。表达miRNAs，GEO数据集中的mRNAs和TCGA数据集是从GEO网站、TCGA官方网站和StarBase获得，数据集由GEO2R分析。生存分析通过GEPIA网站和Kaplan-Meier Plotter进行分析。两个实验组之间的数据的重要性是由t测试进行分析，多个组比较则由单向ANOVA分析，分别以P<0.05(*)、P<0.01(**)、P<0.001(***)代表显著差异。

结果如图2所示，TCGA数据库中下载的肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)样本数据显示，在两类肺癌样本中PKMYTIAR的表达较正常组织中的表达高。PKMYTIAR的表达与患者生存相关性分析结果如图3所示，PKMYTIAR表达与病人的生存呈负相关，表达高的病人生存时间短，表达低的病人生存时间更长。

3、PKMYT1AR细胞亚定位分析

通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)数据库获取PKMYT1AR的全长序列，然后将序列粘贴至lncLocator:lncRNA subcellular localization predictor(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)数据库，即可获取PKMYT1AR的细胞定位分布情况；

结果如图4A所示，PKMYT1AR在细胞中普遍存在，如细胞质，细胞核，外泌体，核糖体等中普遍存在，其主要定位于细胞质中。

实施例2：荧光定量PCR(qRT-PCR)

待细胞A549和SPC-A1培养至密度达到80-90％后，弃去培养基，用PBS清洗一次后置于冰上加入1mL Trizol，充分裂解后用移液枪吹打均匀，并转移至无RNA酶的1.5mL离心管；将收集的Trizol裂解细胞液置于4℃、12000g离心5min，将上清用移液枪转移至新的1.5mL离心管；加入200μL氯仿，充分混匀后静置5min，后置于4℃离心机、12000g离心15min，离心后分为三层，将上层RNA转移至新的1.5mL离心管；加入750μL异丙醇，混合均匀后置于冰上沉淀RNA 10min，后置于4℃离心机，12000g离心10min；弃上清，加入1mL用DEPC水配置的75％无水乙醇上下颠倒混匀后，4℃离心机，7500g离心5min；弃上清，将沉淀干燥至透明，加入适量无RNA酶水溶解RNA，利用Nanodrop测RNA的浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并将RNA保存于-80℃保存。之后利用诺维赞反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，首先去除基因组DNA，在RNase-free的离心管中配制如下混合液:RNase-free ddH₂O、4×gDNAwiper Mix(4μL)、模板RNA(1μg)，以上混合液充分混合后42℃反应2min；之后在混合液中分别加入逆转录试剂5×HiScript III qRT SuperMix(4μL)，充分混匀后利用PCR仪进行反转录，程序为：37℃，15min；85℃，5s；获得的cDNA进行荧光定量PCR：在PCR管中加入cDNA(1μL)、10μM Forward primer(0.4μL)、10μM Reverse primer(0.4μL)、2×SYBR qPCR MasterMix(10μL)、RNase-free ddH2O(8.2μL)，充分混匀后放入PCR仪按照以下程序进行PCR：50℃，2min；95℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min；40cycles；

结果如图5所示，在24对人非小细胞肺癌样本中，肿瘤组织中PKMYT1AR的表达较正常对照组织中表达高(A图)。血清中检测结果同样显示，在30对人非小细胞肺癌病人血清样本中，肿瘤病人血清中PKMYT1AR的表达较正常人血清中表达高(B图)。在细胞中PKMYTIAR的表达检测结果如图6所示，在不同的非小细胞肺癌的细胞系(H358、H1975、H1299、H1650、A549和SPC-A1)中检测PKMYT1AR的表达较肺上皮细胞(BEAS-2B)显著中高表达。

对不同培养条件下，对细胞内的PKMYT1AR以及各种干细胞标志物(CD133、SOX2和CD44)表达的检测结果如图7所示，在悬浮培养状态下，细胞内PKMYT1AR、CD133、SOX2和CD44的表达均显著升高，而在非小细胞肺癌细胞株(A549和SPC-A1)及其对应的耐药株(A549-DDP和SPC-A1-DDP)中检测PKMYT1AR的表达，结果如图8所示，在耐药株A549-DDP和SPC-A1-DDP)中PKMYT1AR的表达显著升高。有意思的是，当我们用与PKMYT1AR互作的miR-485-5p的mimics(模拟物)去处理细胞时，结果如图9所示，细胞内的PKMYT1以及各种干细胞标志物(CD44、OCT4、SOX2和Nanog)表达的都得到了显著的抑制；图10所示表明当A549和SPC-A1细胞用PKMYT1AR的两个不同的antisense oligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理细胞时，lncRNA-PKMYT1AR的表达受到显著抑制。

实施例3：RNA核质分离实验

准备约10⁷个A549和SPC-A1细胞，弃掉培养基，PBS清洗后，胰酶消化细胞，PBS重悬后放在冰上，加入500μL细胞裂解液处理后，静置在冰上约10min，离心样本5min(500g、4℃)后静置在冰上，以实现细胞胞质与胞核的部分分离，其中上清为胞质部分，沉淀则为胞核部分，将500μL冰浴的细胞裂解液加入到核沉淀部分中，剧烈震荡混匀以使核裂解，待核内物质溶解后进行RNA抽提以及PCR分析，后续qPCR分析中，U1作为细胞核对照，β-actin作为细胞质对照；结果如图4B所示，所示为A549细胞中PKMYT1AR同时存在于细胞质和细胞核中，但主要定位于细胞质中。

实施例4：FISH荧光原位杂交

设计PKMYT1AR、18sRNA、U6特异的分子探针，将肺癌细胞H1975种于8孔板内，待细胞密度达到约75％时进行RNA原位杂交实验。细胞固定与通透，先用1×PBS清洗细胞5min.，4％多聚甲醛室温固定10min；1×PBS清洗细胞5min，共3次；每孔加入1mL预冷的通透液，4℃静置5min；弃去通透液后，加入1×PBS清洗细胞5min，3次。每孔加入200μL预杂交液，37℃封闭30min；预杂交同时，将杂交液在37℃中预热；避光条件下，把2.5μL20μM lncRNA FISHProbe Mix储存液或内参(18sRNA、U6)FISH Probe Mix储存液加入到100μL杂交液中；弃去每孔细胞中的预杂交液，加入100μL含有探针的探针杂交液，避光，37℃杂交过夜；避光、42℃，杂交洗液I清洗每孔细胞3次，每次5min，以降低背景信号；避光，42℃，杂交洗液Ⅱ清洗细胞1次；避光，42℃，杂交洗液Ⅲ清洗细胞1次；避光，1×PBS清洗细胞，室温5min。DNA染色，避光，1×DAPI染色液染色10min，染色液用量以覆盖待杂交区域所有细胞为宜；避光1×PBS清洗细胞3次，每次5min。封片：避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂将其固定于载玻片上，进行荧光检测。lncRNA FISH Probe Mix(Red)使用了Cy3标记，最大激发光长为555nm，最大发射波长为570nm，采用共聚焦显微镜进行检测；

结果如图4C所示，PKMYT1AR同时存在于细胞质和细胞核中，但主要定位于细胞质中。

实施例5：建立敲低和过表达细胞系

敲低及过表达质粒病毒制备：将HEK-293T传代至10cm皿，待细胞密度达到60-70％后利用磷酸钙转染的方法，将敲低和过表达质粒导入HEK-293T制备病毒。磷酸钙法转染液配制：A液包括CaCl₂(2mol/L)60μL、pMD2.G 5μg、psPAX 27.5μg、ddH₂O 420μL、质粒12.5μg；B液为2×HEPES 500μL。制备好以上混合液后将A液通过漩涡振荡的方法逐滴加入B液中，室温静置30min后滴入提前准备的HEK-293T，8-12h后将转染质粒的HEK-293T换新鲜培养基，分别于转染48和72h收集病毒。

将A549和SPC-A1细胞种于6孔板，待细胞密度到60-70％后利用已经准备好的病毒感染细胞，并在提前准备的病毒中加入4μg/mL polybrene促进感染效率，感染24h后换新鲜培养基。利用嘌呤霉素筛选阳性细胞，待筛选至稳定细胞系后利用qRT-PCR和western鉴定敲低或过表达效率。

结果如图11，在A549(A图)和SPC-A1(B图)细胞敲低稳转细胞系中，PKMYT1AR的表达水平显著降低，而过表达细胞系中PKMYT1AR的表达水平显著升高。在稳转细胞株中检测非小细胞肺癌的肿瘤干细胞生物标志物(CD44、OCT4、SOX2和Nanog)，结果如图12所示，发现这些干细胞的生物标志物的表达与PKMYT1AR的表达一致，其表达显著受到抑制。

实施例6：细胞增殖实验-生长曲线

将生长状况良好，密度合适的细胞消化后计数，根据不同细胞的大小以及生长速度，每个孔0.8-1.5×10⁴个细胞种于12孔板；将需要的细胞数制备成细胞悬液，每个孔加入500μL细胞悬液，加入12孔板后充分摇匀平铺在培养皿底，以防止细胞聚团生长影响实验结果可信度；24h后用移液枪吸去培养基，加入500μL胰酶，放入细胞培养箱充分消化3-5min后取出，用移液枪反复吹打10-15次后吸取20μL于细胞计数板，用细胞计数仪(Countstar)计数；每个样品计数6天后，绘制细胞生长曲线，并用Prism软件进行统计分析；

结果如图13所示，在PKMYT1AR敲低的两种细胞系中，细胞的生长较对照细胞受到显著抑制，而在敲低的细胞中过表达PKMYT1AR则可以回复细胞的生长，A图为A549细胞系中敲低和拯救后的细胞生长情况，B图为SPC-A1细胞系中敲低和拯救后的细胞生长情况。图14结果显示，当A549和SPC-A1的细胞用PKMYT1AR的两个不同的antisense oligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理细胞时，细胞的生长受到显著抑制。

实施例7：细胞增殖实验-克隆球形成实验

将对数生长期生长状况良好的的细胞，消化后计数，通过梯度稀释的方法，计算500个细胞种于6孔板；消化后的细胞800rpm离心5min，其上清，用5mL新鲜培养基重悬；利用细胞计数仪计数，取5×10⁵个细胞于新的15mL离心管，加培养基至体积为10mL；充分混匀后，取500μL细胞于新的15mL离心管，并加入4.5mL培养基；按照上一步的方法将细胞浓度稀释至5000个/mL；最后充分混匀后，取100μL细胞液(即500个细胞)于提前加2mL培养基的6孔板；将6孔板置于细胞培养箱，每隔2天换一次培养基，直到克隆球肉眼可见；弃培养基，用PBS洗一次，加入1mL 4％PFA(多聚甲醛)固定20min；弃固定液，用ddH₂O洗3次，加入1mL0.5％结晶紫(80％无水乙醇+20％ddH₂O溶解结晶紫粉末)染色5min；弃染色液，用ddH₂O洗3次后晾干；拍照后统计分析；

结果如图15所示，在PKMYT1AR敲低的两个细胞系中，克隆球形成能力较对照细胞受到显著抑制，而在敲低的细胞中过表达PKMYT1AR则可以恢复克隆球的生长。同样的，当我们在敲低细胞系中过表达PKMYT1AR下游靶蛋白PKMYT1时也可恢复其克隆球形成能力，结果如图16所示，A图为A549细胞系中敲低和拯救后的细胞克隆球形成情况，B图为SPC-A1细胞系中敲低和拯救后的细胞克隆球形成情况。如图17所示，当A549和SPC-A1的细胞用PKMYT1AR的两个不同的antisense oligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理细胞时，细胞的克隆球形成能力也受到显著抑制。

实施例8:细胞周期实验

A549和SPC-A1细胞密度至80％后消化，用细胞计数仪(Countstar)计数后，取4×10⁵个细胞种于6cm培养皿，24h后换为无血清培养基，根据不同种类细胞生长速度无血清饥饿8-12h，将细胞周期阻滞在G0/G1期，后将培养基换为完全培养基，释放8-12h后，将细胞消化后用5mL培养基终止消化，并将细胞转移至15mL离心管；800rpm离心5min，弃上清后用4℃预冷的1％BSA+PBS溶液重悬洗去培养基残液；弃上清；将细胞沉淀用500μL预冷PBS重悬后，逐滴加入提前准备的4℃预冷的4.5ml的75％无水乙醇，将混合液置于4℃冰箱固定12-72h；将固定结束的15mL样品管置于离心机1500rpm离心5min；弃上清，用预冷PBS重悬清洗固定液，后1500rpm离心5min；重复两次后，加入500μL预冷PBS(RNase:1:500、Trion X-100:1:1000，5μLPI:1:250)，室温孵育30min后使用流式细胞仪进行检测细胞周期的变化；数据分析并统计；

结果如图18所示，在A549和SPC-A1两个细胞系中敲低PKMYT1AR的表达，细胞周期阻滞在G0/G1期。

实施例9：蛋白免疫印迹实验

将待处理的细胞或组织用碧云天蛋白裂解液RIPA充分裂解，将裂解液转移至1.5mL离心管，4℃离心机中15000g离心20min；离心后将上清液转移至新的1.5mL离心管，并利用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，并制备蛋白样品：制备蛋白标准曲线，蛋白浓度测定如下表：

将标准曲线样品按照上述表格加入96孔板，并加入碧云天BCA反应液A液和B液的混合液每个孔200μL(A液：B液＝51:1)，先在96孔板中加入18μL H2O，后加入2μL待测蛋白样品，即测定定稀释10倍后蛋白浓度；后加入200μL反应液；将上述已加好样品96孔板放入37℃恒温箱反应30min后利用微孔检测酶标仪，测定562nm波长的吸光度。根据标准曲线计算蛋白样品浓度；根据测定的蛋白浓度，将蛋白样品稀释至相同浓度，并加入1/4蛋白体积的5×SDS，充分混匀后置于金属干热仪，100℃处理5min后12000g离心5min，将制备完成的蛋白样品保存于-80℃冰箱。

根据蛋白分子量大小配制不同分离胶(6％-15％)；参照制备蛋白样品的浓度，取适量蛋白样品加入胶孔，后将电泳仪电压调为150V，根据实验需要设定跑胶时间；准备转膜缓冲液，并置于4℃冰箱提前预冷，待跑胶结束后将胶上蛋白以恒流0.5A2h转至PVDF膜；转膜结束后取出PVDF，用洗膜缓冲液TBST洗一次，倒入提前配制的5％牛奶封闭；根据抗体种类用抗体稀释液稀释至合适浓度，一抗倒入抗体孵育盒，并按照蛋白标记mrker将PVDF裁剪后放入抗体孵育盒，置于4℃摇床孵育过夜；TBST洗膜三次，每次10min；TBST配置5％牛奶稀释HRP标记的二抗(1:2000)，后置于室温摇床孵育2h，孵育结束后TBST洗膜；避光条件下将显影液的A液和B液按1:1配置后混匀，将膜放入显影液中孵育适当时间，后将膜放入显影仪中进行图像采集；根据需要可将显影结果用Image J软件进行灰度值计算及定量分析；

结果如图19所示，在敲低了PKMYT1AR的表达后，对细胞周期相关蛋白CDK2、CDK6、Cyclin D1、p21和p27的蛋白表达水平进行了检测，发现CDK2、CDK6、Cyclin D1的蛋白表达在敲低细胞株中显著降低，而p21和p27的蛋白表达水平在敲低细胞株中显著升高。细胞迁移相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Slug)的检测结果如图20所示，E-cadherin蛋白表达在PKMYT1AR敲低细胞株中显著提高，而N-cadherin、Vimentin和Slug蛋白表达在PKMYT1AR敲低细胞株中显著降低。关于细胞凋亡相关蛋白的检测结果，如图21所示，BAX和cPARP蛋白的表达显著升高，而Bcl-2蛋白的表达显著降低，表明PKMYT1AR敲低细胞株对DDP更敏感。

图22结果所示，肿瘤干细胞的标志物如Sox2和CD44的蛋白表达与PKMYT1AR的表达呈正相关。PKMYT1AR敲低细胞株中，Sox2和CD44的蛋白表达也随PKMYT1AR的表达下降而下降。图23的结果显示，当A549和SPC-A1的细胞用PKMYT1AR的两个不同的antisenseoligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理细胞时，PKMYT1的表达受到显著抑制，而肿瘤干细胞标志物蛋白Sox2和CD44的蛋白表达也显著降低。

实施例10：细胞划痕实验

将对数生长期的细胞消化后计数，根据不同细胞大小和生长速度，种1-2×10⁶个细胞于6孔板，24h后划横，挑选宽度一致的位置标记并拍照，拍照后置于细胞培养箱；根据不同种类细胞的愈合速度，在愈合24-48h后拍照，整理数据分析并用Image J软件进行定量和统计分析。

结果如图24所示，在A549和SPC-A1两个细胞系中敲低PKMYT1AR的表达，细胞迁移受到显著抑制，这种抑制在过表达PKMYT1AR后重新得到恢复。

实施例11：Transwell迁移实验

当细胞生长到80％覆盖度时，消化后800rpm离心，加入5mL新鲜培养基重悬，将Transwell小室取出，在24孔板中加入600μL完全培养基，将Transwell小室轻轻放于24孔板，小室底部不要产生气泡；消化后重悬的细胞计数后取2-4×10⁵个细胞于新的15mL离心管，1500rpm离心5min；弃上清，加入1mL无血清培养基重悬，取100μL缓慢加入Transwell小室；将细胞放于细胞培养箱培养24-36h；在24孔板中加入600uL 4％PFA(多聚甲醛)固定液；用移液枪吸出Transwell小室内培养基，并用PBS润湿棉签擦去Transwell小室上面未发生迁移的细胞；将Transwell小室放于提前加固定液的24孔板固定20min；在24孔板中加入600μL 0.5％结晶紫(80％无水乙醇+20％ddH2O溶解结晶紫粉末)染色1-2h；染色结束后用ddH2O洗三次，将染色液清洗干净；晾干后将Transwell小室在显微镜下拍照，并统计迁移细胞数；拍照后Transwell小室加入500μL 33％的醋酸，室温摇床溶解10min后，利用酶标仪在570nm波长处测定光吸收度值。

结果如图25所示，在A549和SPC-A1两个细胞系中敲低lncRNA-PKMYT1AR的表达，细胞小室迁移受到显著抑制，这种抑制在过表达lncRNA-PKMYT1AR后小室迁移能力重新得到恢复。图26结果显示，当A549和SPC-A1的细胞用PKMYT1AR的两个不同的antisenseoligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理时，细胞的小室迁移能力受到显著抑制。

实施例12：裸鼠移植瘤模型实验

提前准备生长状况良好的肿瘤细胞，消化离心后传代，根据实验需要扩增细胞量，根据预算订购裸鼠。实验当天消化细胞，800rpm离心5min，弃上清，用10mL培养基重悬细胞沉淀，用细胞计数仪测定细胞浓度，根据不同种类细胞的成瘤能力，取适量细胞于新的15mL离心管，800rpm离心5min；弃上清，用适量无血清培养基重悬，置于冰上；准备碘伏、消毒棉签、1mL注射器，将细胞注射至5-6周龄的BALB/C裸鼠皮下；每周测两次小鼠体重以及成瘤体积，待瘤子长到一定体积后处死小鼠，解剖出瘤子；将取出的瘤子称重、测量体积和拍照，并分为三份用于提取RNA、蛋白质、石蜡包埋；

结果如图27所示，在PKMYT1AR敲低后，裸鼠移植瘤的的形成能力(大小、重量和体积)受到显著的抑制；图28结果显示，PKMYT1AR敲低的细胞株的成瘤能力显著降低，而在敲低细胞株中过表达PKMYT1AR下游靶基因PKMYT1，细胞株的成瘤能力得到恢复；图29的结果表明当A549的细胞用PKMYT1AR的两个不同的antisense oligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理时，其在裸鼠体内的成瘤能力显著降低。

实施例13：免疫组化实验

将体内小鼠模型组织样本，以及收集的肿瘤组织样本(包括癌、癌旁和正常组织)浸泡于10％福尔马林；将收集的组织切成小块(长、宽1-1.5cm，厚0.2-0.5cm)，放于组织包埋盒中，并做好标记；将包埋盒放入烧杯中，流水冲洗30min，充分清洗干净；按照以下顺序进行脱水：75％乙醇，浸泡1h；85％乙醇，浸泡1h；90％乙醇，浸泡1h；95％乙醇，浸泡1h；95％乙醇，浸泡1h；100％乙醇，浸泡1h；100％乙醇，浸泡1h；二甲苯，浸泡35min；二甲苯，浸泡35min；石蜡，浸泡1h；石蜡，浸泡1h；脱水结束后进行透化处理：二甲苯中浸泡35min；换新鲜二甲苯浸泡35min；将透化后组织放入石蜡I中1h；石蜡II中1h；去除包埋盒，将组织转移至石蜡模具，将石蜡灌入模具充分包裹组织块，将模具放在组织包埋机制冷台上冷却；凝固后将蜡块从模具中取出，修片后放于室温储存，后可行HE或IHC染色。

1)HE染色

提前将包埋好的组织蜡块放入-20℃冰箱，预冷处理10-30min，将切片机厚度调为3μm，切片后于65℃水浴锅中展片，用载玻片将片子捞出，置于65℃烘箱烘干30分钟；二甲苯I中浸泡10min；换二甲苯II浸泡10min；二甲苯III浸泡10min；100％乙醇浸泡2min；100％乙醇浸泡2min；95％乙醇浸泡2min；85％乙醇浸泡2min；75％乙醇浸泡2min；流动的去离子水冲洗2min；苏木素染色5-10min；流动的去离子水冲洗1min；含1％HCl的75％乙醇分化直至颜色变为淡紫红色；用50℃的蒸馏水进行反蓝，自来水冲洗5-10min，直至颜色变蓝，而后用95％的乙醇浸泡1min；放入伊红燃料浸泡几秒，注意观察颜色变化；75％乙醇浸泡30s；85％乙醇浸泡30s；90％乙醇浸泡30s；95％乙醇浸泡30s；100％乙醇浸泡30s；100％乙醇浸泡30s；二甲苯浸泡2min；二甲苯浸泡2min；将玻片取出，在二甲苯未晾干前，滴加中性树脂，再将盖玻片轻轻盖上，置于通风处晾干后室温保存。

2)IHC染色

提前将包埋好的组织蜡块放入-20℃冰箱，预冷处理10-30min，将切片机厚度调为3μm，切片后于65℃水浴锅中展片，用载玻片将片子捞出，置于65℃烘箱烘干30分钟；二甲苯I中浸泡10min；二甲苯II浸泡10min；二甲苯III浸泡10min；100％乙醇浸泡2min；100％乙醇浸泡2min；95％乙醇浸泡2min；85％乙醇浸泡2min；75％乙醇浸泡2min；流动去离子水冲洗2min；将片子放入高压锅中，高温高压处理25min，关闭电源后恢复至室温；去离子水冲洗1min，将载玻片上水甩干，切片周围用油笔画圈，在圈内滴加3％的H₂O₂，室温封闭20min，用PBS洗一遍，后用10％的NGS封闭20min；用PBST(PBS+0.1％Tween-20)配置5％NGS，将一抗用5％NGS稀释后滴加于画圈组织上，置于4℃冰箱孵育过夜；将片子取出，PBS洗两次，每次3min，PBST洗一次，3min；HRP标记的二抗(Santa Cruz Biotechnology，Santa cruz，CA，USA)室温孵育1h；PBST洗一次；配置DAB显色液(1:50)，将载玻片上水甩干，滴加50μL显色液，根据着色情况(颜色变为棕色)，将片子放入蒸馏水中停止显色；将片子放入苏木素染色液染色3min；用流动去离子水冲洗1min；将片子放入含1％HCl的75％乙醇中，分化至组织变为淡紫红色即可停止；用50℃的去离子水蓝化片子5min；按75％乙醇浸泡30s；85％乙醇浸泡30s；90％乙醇浸泡30s；95％乙醇浸泡30s；100％乙醇浸泡30s；100％乙醇浸泡30s；二甲苯浸泡2min；二甲苯浸泡2min的顺序梯度脱水并在二甲苯未晾干前，滴加中性树脂，再将盖玻片轻轻盖上，置于通风处晾干后室温保存；用Olympus显微镜拍照。用全自动组织扫描仪进行扫描，结合病人详细信息进行数据分析，根据染色强度与阳性细胞比率进行评分，阴性(0分)、弱阳性(1分)、中等染色(2分)、强染色(3分)；无信号(0分)、阳性率分为0％、1-25％、26-50％、51-75％和76-100％五个等级，分别对应0、1、2、3、4分；染色强度与阳性细胞比率评分乘积为最终评分，小于等于8为低表达组，大于8为高表达组。

结果如图30所示，用Ki67检测移植瘤中的增殖情况，发现PKMYT1AR敲低后，肿瘤组织中的Ki67的阳性率显著降低，提示移植瘤中细胞的增殖能力降低。而图31中的CC3标记的细胞凋亡情况则相反，在PKMYT1AR敲低后，CC3阳性细胞显著增加，表明PKMYT1AR敲低显著促进肿瘤细胞的凋亡。在恢复实验中，图32所示PKMYT1AR敲低后，显著降低的Ki67的阳性率和升高的CC3阳性率在过表达PKMYT1AR后得到恢复。图33显示，用PKMYT1AR的两个不同的antisense oligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理的裸鼠移植瘤其下游靶基因PKMYT1蛋白表达水平和细胞增殖蛋白标志物Ki67的阳性细胞显著增加，而细胞凋亡的蛋白标志物CC3阳性细胞数显著增加。

实施例14：双荧光素酶报告实验

提前准备好生长状态良好的HEK-293T以备使用，查看luciferase试剂盒和瞬转LipofectamineTM 3000试剂是否充足。将细胞消化后种于6孔板，每个孔4×10⁵个细胞；将种于6孔板的细胞置于细胞培养箱培养24h，配置瞬转液，A液：4.5μg目的质粒、0.25-0.5μg内参质粒renilla、125μL无血清DMEM培养基、5μLP3000TM；B液：250μL无血清DMEM培养基、7.5μL LipofectamineTM 3000；A液和B液充分混匀后，将A液加入B液，室温静置15min；将AB混合液逐滴加入6孔板，置于培养箱培养48h；取出培养箱细胞，弃上清，加入500μL 1×PLBbuffer置于摇床充分裂解；将裂解细胞转移至1.5mL离心管，1500rpm离心30s；取10μL上清于96孔检测板待测；将Luciferase试剂盒种的50×Stop buffer稀释为1×Stop buffer；将96孔检测板放入化学发光分析仪，根据仪器设置程序检测，利用prism软件进行统计分析。

结果如图34所示，PKMYT1AR与miR-485-5p之间存在相互作用，将PKMYT1AR与miR-485-5p互作的碱基突变后，PKMYT1AR与miR-485-5p之间的相互作用被解除。而图35中显示miR-485-5p及其下游靶基因PKMYT1的相互作用也可以通过miR-485-5p上与PKMYT1互作的碱基突变来解除。

实施例15：PKMYT1AR结合的miRNA分析

PKMYT1AR结合的miRNA分析，通过数据库StarBase预测与PKMYT1AR结合的miRNA，得到3个潜在的miRNA，包括miR-216a-5p、miR-485-5p和miR-6884-5p，根据筛选条件：与PKMYT1AR表达呈负相关，且在肺癌里低表达，预后好。因此选择miR-485-5p作为后续与PKMYT1AR表达结合的研究对象；结果如图36所示，miR-485-5p与PKMYT1AR表达呈负相关。

实施例16：miR-485-5p下游靶基因分析

通过3个不同的数据库StarBase，Targetscan和miRWalk预测与miR-485-5p结合的mRNA，通过取各数据库预测结果的前50％进行共同交集，只获得PKMYT1一个靶基因，且PKMYT1与miRNA-485-5p表达呈现负相关，与上游lncRNA表达呈现显著正相关，PKMYT1在肺癌中显著高表达，高表达与肺癌不良预后相关；结果如图37所示，miRNA-485-5p与PKMYT1表达呈现负相关。

实施例17:细胞存活率实验-SRB实验

将细胞密度合适的细胞消化，种每个孔1×10⁴个细胞于96孔板，待细胞24h后完全贴壁，按照前期实验设置药物(cisplatin：DPP)浓度梯度，用细胞培养基稀释药物，弃去96孔板细胞培养基加入配置的药物，放入5％CO₂、37℃细胞培养箱药物处理48h，处理结束后取出96孔板；弃去贴壁培养细胞孔内液体，并用PBS清洗一次，每个孔加入100μL在4℃预冷的10％TCA(三氯醋酸)，置于4℃冰箱固定1h；弃固定液，用ddH₂O清洗5次，充分干燥。用1％醋酸溶解SRB粉末，配置0.4％SRB溶液；每个孔加入100μL的0.4％SRB溶液，室温摇床充分染色30min；弃去染色液，用1％醋酸液洗5次，洗去染色液后室温晾干；每个孔加入100μL10mM的Tris-base，置于室温摇床充分溶解30min；用酶标仪测定波长为515nm时的OD值；整理分析数据，制作图表并计算细胞存活率的IC50；

结果如图38所示，PKMYT1AR敲低的细胞株即MYT1AR sh#1和MYT1AR sh#2中细胞对DDP更加敏感，IC50的值较对照组细胞Ctrl shRNA显著降低。

实施例18：细胞凋亡实验

细胞密度至80％后消化，用细胞计数仪(Countstar)计数，取4×10⁵个细胞种于6cm培养皿，次日加入药物处理24-48h，细胞样品处理结束后取出细胞，将含有凋亡细胞的培养基收集于15mL离心管，PBS洗一次后消化3-5min，后用5mL培养基轻柔重悬于15mL离心管；2000rpm离心5min，弃上清，加入预冷PBS重悬后2000rpm离心5min，弃上清，根据细胞凋亡试剂盒说明书(Annexin V-FITC/PI)，加入500μL的1×binding buffer重悬细胞，取出三组对照细胞(阴性、FITC单标，PI单标)，后加入FITC(1:100)，PI(1:100)，缓慢充分混匀后37℃避光孵育15-30min后检测荧光标记，并进行统计分析；

结果如图39所示，lncRNA-PKMYT1AR敲低的细胞株即MYT1AR sh#1和MYT1AR sh#2中细胞对DDP更加敏感，凋亡细胞的百分比较对照组细胞Ctrl shRNA显著升高。

实施例19：细胞放疗克隆形成实验

将对数生长期生长状况良好的的细胞，消化后计数，通过梯度稀释的方法种细胞；分两组种细胞于6孔板，一组对照组，一组为辐照组；种于6孔板的细胞置于细胞培养箱中，培养48h后辐照组通过高能生物辐照仪CIX3X射线辐照仪，根据不同细胞的耐受能力选择1-10Gy辐照剂量；对照组不做任何处理；将细胞置于细胞培养箱培养2-3周，每隔2天换一次新鲜培养基；克隆球长到合适大小后，弃培养基，PBS洗一次后4％PFA(多聚甲醛)固定20min；弃固定液，ddH₂O洗3次；加入1mL 0.5％结晶紫(80％无水乙醇+20％ddH₂O溶解结晶紫粉末)染色5min；弃染色液，用ddH₂O洗3次后晾干；拍照后用Image J和prism软件进行定量和统计分析；

结果如图40所示，辐照前克隆球形成能力未见显著差异，而PKMYT1AR敲低的细胞株即MYT1AR sh#1和MYT1AR sh#2中细胞对辐照更加敏感，形成的克隆球数量显著降低。

实施例20：肿瘤干细胞微球形成实验

提前准备生长良好的细胞，肿瘤干细胞培养基和超低吸附培养皿；将细胞充分消化成单个细胞，800g离心5min，弃上清；用新鲜肿瘤干细胞培养基重悬，利用细胞计数仪测定细胞浓度，根据不同种类细胞的生长能力，取1-3×10⁵个细胞于新的15mL离心管，并用培养基补齐至10mL；将上述细胞充分混匀，取1mL种于6孔超低吸附板，每个孔种1-3×10⁴个细胞；将细胞置于细胞培养箱，每隔一天补充500μL新鲜培养基；培养7-14天后在显微镜下拍照，并统计肿瘤干细胞的微球形成个数；

结果如图41所示，PKMYT1AR敲低的细胞株即MYT1AR sh#1和MYT1AR sh#2中肿瘤干细胞微球形成能力较对照组细胞Ctrl shRNA的肿瘤干细胞微球形成能力显著降低。图42的结果显示，PKMYT1AR的互作分子miR-485-5p的mimics和inhibitor处理细胞，与对照miR-NC相比，mimics可以显著抑制肿瘤干细胞微球形成，而miR-485-5p的inhibitor则较其对照组Anti Ctrl肿瘤干细胞微球形成能力显著升高。而miR-485-5p的mimics可以显著抑制肿瘤干细胞微球形成的能力可以被PKMYT1AR和PKMYT1的过表达回复。图43的结果显示，当A549和SPC-A1的细胞用PKMYT1AR的两个不同的antisense oligonucleotide(ASO)(ASO#1和ASO#2)处理细胞时，细胞的肿瘤微球形成能力受到显著抑制。

序列表

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 一种人PKMYT1AR基因及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 539

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 1

gtagttccca cggcaccaac actagtaagc ggcgtctcgc ttcacctcca ggttaaaagc 60

ccagagaaga ccgccagggg cgcgtggaaa tggtgtccct cgtctccaag gcccagacgg 120

agcttagctt cctcttgaag gagccatatc tgtatttctg gtgaacgtcg tgtttgacat 180

caaaggaatg tttagagaca tgatttcagc cttccttacg cagagaatgc tcatcaaaaa 240

ataaaatgga cacaccatac actgacgtca ctcagatttc tatggctgga agttaacaaa 300

tattgttttc aaatgcgtgt agcctgatgc tccagagtta gtttggcgag cctcagcatt 360

ttctgtcagg cacaagaaag aaaagactcc agacaccatg atgtggaacg tggagtgggg 420

atgtttggtg gccttgaagc tggagtgcag tggcatgatc tcagctcgct acaacctcca 480

tctcccagcc gcctgccttg gcctcccaaa gtgctgagat tgcagcctct gcccggccg 539

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ccacggcacc aacactagta 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atctcagcac tttgggaggc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gcttagcttc ctcttgaagg a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

gccttcctta cgcagagaat g 21

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

ccgggcttag cttcctcttg aaggactcga gtccttcaag aggaagctaa gctttttg 58

<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

aattcaaaaa gcttagcttc ctcttgaagg actcgagtcc ttcaagagga agctaagc 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ccgggccttc cttacgcaga gaatgctcga gcattctctg cgtaaggaag gctttttg 58

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

aattcaaaaa gccttcctta cgcagagaat gctcgagcat tctctgcgta aggaaggc 58

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

ggccttgaag ctggagtgca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

gccatatctg tatttctggt 20

Claims

1.一种人PKMYT1AR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.检测权利要求1所述的人PKMYT1AR基因表达量的试剂在制备非小细胞肺癌临床诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂是检测人PKMYT1AR基因高表达量的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：试剂包括引物，引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

5.以抑制人PKMYT1AR基因表达或敲低人PKMYT1AR基因为目的的筛选用于制备非小细胞肺癌治疗药物的应用。

6.根据权利要求5述的应用，其特征在于：将抑制人PKMYT1AR基因表达的shRNA序列克隆入慢病毒载体后获得RNA干扰慢病毒，用于筛选非小细胞肺癌治疗药物，表达shRNA的序列包括两个靶向人PKMYT1AR基因编码DNA的反向重复序列，中间由一茎环序列分隔；其中，两个反向重复序列分别为人PKMYT1AR基因的shRNA靶点序列及其互补序列；所述人PKMYT1AR基因的shRNA靶点核苷酸序列选自下述核苷酸序列：

SEQ ID NO:4：GCTTAGCTTCCTCTTGAAGGA；

SEQ ID NO:5：GCCTTCCTTACGCAGAGAATG。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：表达shRNA的序列的正义链序列如SEQ IDNO:6所示，反义链序列如SEQ ID NO:7所示；或者正义链序列如SEQ ID NO:8所示，反义链序列如SEQ ID NO:9所示。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将抑制人PKMYT1AR基因表达的ASO序列用于筛选非小细胞肺癌治疗药物，ASO核苷酸序列选自下述序列：

SEQ ID NO:10：GGCCTTGAAGCTGGAGTGCA；

SEQ ID NO:11：CCATATCTGTATTTCTGGT。

9.以敲低或抑制人PKMYT1AR基因表达为目的的方法或药物在增加非小细胞肺癌治疗效果中的应用。