JP2001504710A - 植物細胞培養物の増殖を高める方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、植物細胞の増殖を再誘導および剌激することによりインビトロ培養植物細胞の増殖速度および細胞濃度を高める方法であって、ａ）植物細胞培養物を栄養培地中で増殖の開始に適した増殖条件下に増殖させ；そしてｂ）細胞培養物に、初期増殖段階と細胞培養物の死の前との間のいずれかの時点で、培養物にとって有毒でなく増殖を再誘導するのに十分である量の追加の多量養素を補充し；これにより、培養物の植物細胞濃度を高めるために細胞分裂を再誘導、刺激、維持および増大させる工程を含む方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 植物細胞培養物の増殖を高める方法 発明の背景 （ａ）発明の分野 本発明は、植物由来の経済的に重要な複雑な化学物質（ファイトケミカル、ｐ ｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を工業レベルで産生させるために、植物細胞培養 物の増殖を高める方法に関する。 （ｂ）先行技術の記述 ファイトケミカルは、従来の化学的方法では妥当な収率および価格で合成ずき ず、また複雑でありかつ関与する生化学的経路がほとんど理解されていない場合 が多いため微生物の遺伝子操作によっても製造できない、非タンパク質生体分子 である。これらの貴重な分子の製造は、大部分は輸入された外来植物バイオマス の抽出および精製により行われ、収率が低い（＜１〜５％）。それらのバイオマ スの繁殖農業および長期的供給は、不可能でないとすれば保証するのが困難な場 合が多い。したがってこれらの供給問題のため、これらのユニークな生体分子を 薬剤、栄養および化粧品などの工業に有効利用するのが著しく妨げられてきた。 植物細胞の培養は１９６０年代以来、工業的に重要な複雑なファイトケミカル （二次代謝産物）の産生に代わる実用的方法として検討されてきた。しかし、よ り良い性能をもつ細胞系の選択や、特異的な増殖培地および生産培地の開発、な らびに固定化培養法、器官培養法および形質転換培養法の開発を含めたこの研究 は、経済的生産性レベルを達成するのに実際に成功してはいない。これらの研究 は大部分が小規模の、制御および監視のなされない固形および液体フラスコ培養 を用いて行われ、一般に再現性のない低い産生レベルが得られた（１４〜２８日 で＜１００〜２００ｍｇ Ｌ^-1）。さらに、二次代謝産物は大部分が細胞内に保 持され、産生を向上させる遺伝子操作は成功していない。 それでもやはり、一定数の価値ある前進がここ数年にわたって達成された。工 業的に重要な数種類の二次代謝産物につき、生産性の高い正常および形質転換植 物細胞系ならびに製造プロトコールが開発された。適切に設計された組換えタン パク質および抗体がクローン化され、植物中および培養植物細胞中で産生された 。従来のバイオリアクターを用いると、植物細胞を大規模（２０，０００〜７５ ，０００Ｌ）で培養することにより、達成される容量生産性（ｖｏｌｕｍｅｔｒ ｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）が低いのを補うことができるが、ファイトケ ミカル産生はフラスコ内で得られるより常に低い。 したがって価値あるファイトケミカルを製造するための植物細胞ベースのバイ オプロセスは、基本的培養法の生産性が低く、低い生産速度を補うのに必要な大 型バイオリアクターシステムへの投資が高いため、現在でもなお非経済的である 。このタイプのバイオプロセスは基本的に３段階を含む：１）植物細胞バイオマ スを増殖させて高濃度にする第１段階；２）このバイオマスを刺激または攻撃し て目的の二次代謝産物を高率かつ高濃度で生合成させる生産段階；ならびに３） ファイトケミカルを培養ブロスから抽出および精製する最終段階。この最終段階 （下流処理）は従来の化学工学技術を用いて行われる。 この分野の大部分の研究は、このバイオプロセスにおいてより華々しい第２段 階の改良、すなわち植物細胞バイオマスにおける二次代謝を誘導してそれによる ファイトケミカル産生を最大にするための培養法（産生培地、形質転換培養およ び器官培養、誘発（ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）、遺伝子操作など）の開発に集中 し、ある程度成功した。このバイオプロセスの第１段階、すなわち二次代謝産物 の生産性の鍵となるものにつき、深く研究されたことはほとんどない。すべての 場合、高濃度（乾燥バイオマス約３０〜５０⁺ｇ Ｌ^-1）の生産性バイオマスは 高い糖濃度を用いて達成された。従来の静的（バッチ式）条件下でのこれらの培 養のバイオマス増殖は緩慢である（分裂時間約２４〜７２時間）が、高い湿潤バ イオマス濃度（＞３００ｇ Ｌ^-1）を達成できる。 しかしインビトロ培養した植物細胞の基本的な有効増殖行動は、別個の２期、 すなわち細胞分裂とこれに続く細胞拡張からなる。植物細胞培養の分野で、培養 において両期を明りょうに区別して別個に測定したグループはない。通常はバイ オマス濃度の上昇によって初めて増殖を定量測定する。本発明者らの研究（Ｐｅ ｐｉｎ，Ｍ．Ｆ．ら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４７：１３１−１３８）によれば、炭水化物および溶 存酸素の利用が制限されない普通の（バッチ式）増殖条件下で、培養植物細胞の 分裂は典型的な１４〜２１日のバイオマス増殖期の間の最初の３〜７日後に停止 する。これにより培養の特徴的な呼吸パターンが生じ、細胞分裂が終了するとプ ラトーに達する。 その後、水、炭水化物、硝酸塩および他の多量養素（ｍａｃｒｏｎｕｔｒｉｅ ｎｔ）を取り込んだ際に、細胞およびバイオマスの拡張のみによって培養物増殖 が起きる。この現象は３種の異なる植物細胞につき観察された：ビチス・ビニフ ェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）（Ｐｅｐｉｎ，Ｍ．Ｆ．ら（１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４７： １３１−１３８）、エシュショルチア・カリフォルニカ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｔ ｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）およびギンゴ・ビロバ（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉ ｌｏｂａ）。これは、この現象がインビトロで培養した植物細胞の多く（すべて ではないとしても）の増殖行動の特徴であることを示す。 これに関して、第１（増殖）段階の期間を短縮し、植物細胞ベースのバイオプ ロセスにおける細胞濃度を最大にするためには、インビトロ培養植物細胞の細胞 増殖を改良する新規な培養法を提供するのがきわめて望ましいであろう。次いで 、きわめて高い経済的生産性レベルを植物細胞ベースのバイオプロセスにより得 るために、この培養法を二次代謝産物ならびに組換えタンパク質および抗体の産 生を誘導するために開発された他の培養技術と組み合わせることができる。発明の概要 本発明の目的のひとつは、培養植物細胞の、より速い真の（細胞の）増殖速度 を提供することである。 本発明の他の目的は、従来の（バッチ式）培養を用いて得られるもの（細胞数 ＜２〜２．５×１０⁶個ｍｌ^-1）よりはるかに高い、植物細胞培養の細胞濃度（ 少なくとも約２０〜６０×１０⁶個ｍｌ^-1）を提供することである。 本発明の他の目的は、これらの高い細胞濃度（約２０〜６０×１０⁶個ｍｌ^-1 ）を、植物細胞ベースのバイオプロセスによる二次代謝産物、組換えタンパク質 および抗体の産生に提供することである。 本発明の１態様によれば、インビトロ培養植物細胞の細胞分裂を再誘導および 刺激する新規な動的培養法が提供される。きわめて高い経済的生産性レベルを植 物細胞ベースのバイオプロセスにより得るために、この培養法を二次代謝産物な らびに組換えタンパク質および抗体の産生を誘導するために開発された他の培養 技術と組み合わせることができる。 本発明方法の１態様は、培養物中の植物細胞濃度を高めるために、まずバッチ 式で増殖させた植物細胞培養物にさらにアンモニウムイオンを動的に供給して、 細胞分裂を再誘導、刺激、維持し、その速度を高め、かつ細胞増殖の程度を高め ることにある。この独自の方法は、適切に選ばれた植物成長調節剤を培地に補充 すると持続性細胞分裂が誘導されるであろうという点で、この分野の従来の考え および方法と著しく異なる。 本発明方法の他の態様は、同様に植物細胞培養物にＮＨ₄を動的に供給し、同 時にそれらの生存にとって重要な他の多量養素（主に炭水化物、溶存酸素、ホス フェートおよびカリウム）を供給することからなる。その理由は、アンモニウム 添加に際し細胞分裂再誘導の前または途中でこれらの多量養素が欠乏すると、予 想される細胞増殖増大が制限され、事実、増殖が低下し、おそらく培養物が死ぬ 可能性があるからである。 本発明方法の他の態様は、細胞増殖を高めるために、植物細胞培養物に培養物 の特定の生理学的状態でこれら特定の多量養素を同様に動的に供給することから なる。その理由は、これらの多量養素が過剰である場合には毒性の問題や望まし くない代謝が生じるので、経験による多量養素添加では細胞増殖が予想した最大 にまで増大しない可能性があり、事実、遅滞期の延長および増殖低下が起きる可 能性があるからである。 本発明方法の他の態様は、細胞増殖を高めるために、植物細胞培養物に適切に プログラミングされた添加方式でこれら特定の多量養素を同様に動的に供給する ことからなる。その理由は、これらの多量養素の初期濃度を高めると、または培 養物に経験によりにバッチ添加すると、これらの多量養素が過剰である場合には 毒性の問題や望ましくない代謝が生じるので、細胞増殖が予想した最大にまで増 大しない可能性があり、事実、遅滞期の延長および増殖低下が起きる可能性があ るからである。 本発明方法の他の態様は、本発明方法に従って高い細胞濃度（２０〜６０×１ ０⁶個ｍｌ^-1）にまで増殖させた一定容量の植物細胞培養物を、従来の植物細胞 培養法を用いてこれまで可能であった培養容量（３〜６０倍）よりはるかに多量 （２０〜６０倍）の新たな培養容量に接種するのに使用することにあり、これに より植物細胞ベースの培養法をはるかに簡単に、少ない経費で、速やかに工業的 規模にまで拡大できる。 本発明方法をフラスコ内で実施してもある程度は成功するが、最高の結果を得 るのに必要な効率的制御計画での管理下に高い溶存酸素伝達速度および栄養素の 連続添加が可能である適切な培養器またはバイオリアクターを用いて実施するの が最良である。 植物細胞の固定化、形質転換および器官植物細胞培養が増殖効率の改善という 点でプラスの反応を示すが、本発明方法の１態様は植物細胞懸濁培養にもより良 好に適用できる。 培養植物細胞の前記の効果的増殖パターン、ならびにプログラミングされたＮ Ｈ₄および他の重要な多量養素の添加に際し細胞分裂が再誘導および最大化され る可能性は、多くの植物細胞種に特徴的であるので、本発明はすべての培養植物 細胞種に適用できる。本発明に従って使用できる植物細胞種には以下のものが含 まれるが、これらに限定されない：ビチス・ビニフェラ、エシュショルチア・カ リフォルニカ、ギンゴ・ビロバ、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔ ａ）、ダチュラ・ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）、リ コペルシコン・エスキュレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎ ｔｕｍ）、リコペルシコン・ピンピネリフォリウム（Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉ ｆｏｌｉｕｍ）、メデイカゴ・サテイバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、 フィザリス・エキソカルパ(Ｐｈｙｓａｌｉｓ ｅｘｏｃａｒｐａ)、ソラナム・ メラノセラスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌａｎｏｃｅｒａｓｕｍ）、タゲテス・ パチュラ（Ｔａｇｅｔｅｓ ｐａｔｕｌａ）、タゲテス・エレクタ（Ｔ．ｅｒｅ ｃｔａ）、トリフォリウム・プラテンセ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓ ｅ）、カタランタス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、 トリプテリギウム・ウィルフォルデイ（Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏ ｒｄｉｉ）、タキサス属（Ｔａｘｕｓ）種、パパベル・ソムニフェルム（Ｐａｐ ａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）およびニコチニア・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉ ｎｉａ ｔａｂａｃｕｍ）。 しかしすべての場合、考慮している特定の植物細胞種の増殖行動と栄養状態お よび生理学的状態との関係を評価するためには、また本発明方法によりさらに利 益（高い細胞増殖）を得るのに適した栄養素（糖類および溶存酸素を含む）添加 計画を開発するためには、さらに栄養の研究が必要であろう。 ファイトケミカル産生のための植物細胞の改変には、本発明による増殖方法の 実施中および／または実施後に行う物理的、化学的および／または生物学的スト レス下での培養；生産培地の使用；誘発；固定化、器官または形質転換培養法の 使用；ならびに遺伝子操作が含まれるが、これらに限定されない。 適切に計画された組換えタンパク質および抗体のための植物細胞培養の改変に は、遺伝子操作；本発明による増殖方法の実施中および／または実施後に行う物 理的、化学的および／または生物学的ストレス下での培養；生産培地の使用；な らびに固定化、器官または形質転換培養法の使用が含まれるが、これらに限定さ れない。 本発明の１態様によれば、植物細胞の細胞増殖を再誘導および刺激することに よりインビトロ培養植物細胞の増殖速度および細胞濃度を高める方法であって、 ａ）植物細胞培養物を栄養培地中で細胞分裂の開始に適した増殖条件下に増殖 させ；そして ｂ）細胞培養物に、初期増殖段階と細胞培養物の死の前との間のいずれかの時 点で、細胞培養物にとって有毒でなく細胞分裂を再誘導するのに十分である量の 追加のアンモニウムイオンを補充し；これにより、培養物の植物細胞濃度を高め るために細胞分裂を再誘導、刺激、維持および増大させる 工程を含む方法が提供される。 本発明の１態様によれば、工程ａ）の増殖を、培養物の酸素取込み速度を監視 しながら行わせることができる。 本発明の１態様によれば、工程ｂ）のアンモニウムイオンを、酸素取込み速度 が実質的にプラトーに達したときに添加できる。 アンモニウムイオンには、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＮＨ₄ＮＯ₃、（ＮＨ₄）₂ＰＯ₄、 酢酸アンモニウムおよびグルタミンが含まれるが、これらに限定されない。 炭水化物、溶存酸素、ホスフェートおよびカリウムを含めた他の栄養素（これ らに限定されない）も添加できる。炭水化物にはショ糖、グルコースおよびフル クトースが含まれるが、これらに限定されない。 本発明の１態様によれば、工程ａ）の増殖を、フラスコ、いずれか適切な培養 器、またはバイオリアクター内で行わせることができる。好ましくは、工程ａ） の増殖を培養器またはバイオリアクター内において、バッチ式、供給バッチ（ｆ ｅｄｂａｔｃｈ）式または連続式で行わせ、より好ましくはバイオリアクター内 においてバッチ式で行わせる。 “適切な増殖条件”という表現は、本明細書中で用いる場合、無菌性、混合速 度、温度、光、酸素供給および栄養培地に関するものとする。 本発明の１態様によれば、本方法はさらに工程ｂ）の後に実施する２工程： ｃ）ファイトケミカル産生のために植物細胞培養物を改変すること；そして ｄ）ファイトケミカルを産生させ、産生したファイトケミカルを増殖した植物 細胞バイオマスおよび培地から単離すること； を含むことができる。 “ファイトケミカル”という表現は、本明細書中で用いる場合、アルカロイド 類、タキサン類、タキシン類、テルペン類、ステロイド類、キノン類、フラボノ イド類、タンニン類、サポニン類、クマリン類、カロテノイド類、およびその任 意の生合成中間体を表すものとする。 本発明の他の態様によれば、本方法はさらに工程ｂ）の後に実施する２工程： ｃ）組換えタンパク質および抗体の産生のために植物細胞培養物を改変するこ と；そして ｄ）組換えタンパク質および抗体を産生させ、産生した組換えタンパク質およ び抗体を増殖した植物細胞バイオマスおよび培地から単離すること； を含むことができる。 本発明の他の態様によれば、植物ベースの培養法を工業的規模にまで拡大する 方法であって、 ａ）植物細胞培養物を本発明方法に従って増殖させて、高い細胞濃度の第１容 量の培養物を得て；そして ｂ）植物細胞培養を工業的規模にまで拡大するために、濃厚な第１容量の少な くとも一部を第２容量の培養物に接種し、その際第２容量は第１容量より大きく ； これにより、植物細胞培養物の接種容量比（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｉｎｏｃｕ ｌａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）が従来のバッチ式培養法を用いた場合より低くなる ； 工程を含む方法が提供される。 “高濃度”という表現は、本明細書中で用いる場合、細胞数約３×１０⁶〜６ ０×１０⁶個ｍｌ^-1の濃度を意味するものとする。 “接種容量比”という表現は、本明細書中で用いる場合、約１：２０〜１：６ ０の比率を意味するものとする。発明の詳細な記述 本発明によれば、下記の動的培養法が提供される： ａ）懸濁培養した特定の種の生存可能な植物細胞の十分な量の接種物を、適切 な培養器に入れた一定量の新鮮な無菌培地に添加する；この培地は最初はその植 物細胞の増殖に適したすべての多量養素、微量養素および植物成長調節剤を十分 な量含む； ｂ）この植物細胞懸濁培養物を適切な増殖条件下（必要に応じて無菌性、混合 速度、温度、必要ならば光、酸素供給など）に保持する； ｃ）この植物細胞懸濁培養物を、細胞分裂が開始して監視条件下（バイオマス および細胞濃度の上昇、主な多量養素（炭水化物、アンモニウムおよびホスフェ ートイオンなど）の取込み）で持続しうるのに適した期間、これらの適切な増殖 条件下に保持する； ｄ）この培養物の細胞増殖曲線に沿った適切な時点で（これは、細胞外ＮＨ₄ 取込み終了、細胞分裂終了、最大酸素取込み速度などと一致するであろう）、Ｎ Ｈ₄イオン、ならびに細胞の生存および分裂の継続に必須である他の多量養素(こ れには炭水化物、溶存酸素、ホスフェートおよびカリウムが含まれるが、これら に限定されない)を、必要に応じて細胞分裂の持続に適した速度で培養物に定期 的または連続的に供給する； ｅ）重要な多量養素（これには炭水化物および溶存酸素が含まれるが、これら に限定されない）が有害なほど枯渇することなく、または有毒となる可能性のあ る重要な多量養素（これにはＮＨ₄および供給無機塩類の対イオンが含まれるが 、これらに限定されない）を過剰供給することなく、細胞分裂を最大速度に維持 できるように、細胞の増殖、および細胞による主な多量養素（主に炭水化物、溶 存酸素、ホスフェートおよびカリウム、これらがすべてではない）の消費速度、 および培養条件（多量養素供給方式を含む）を頻繁に監視する；そして ｆ）最大細胞濃度が達成され、目的とするファイトケミカル、組換えタンパク 質または抗体の産生に培養物を使用できるようになるまで、この動的かつ適応性 の培養法を続ける。 本発明方法をビチス・ビニフェラおよびエシュショルチア・カリフォルニカ細 胞培養物につき２−Ｌおよび５−Ｌヘリカル・リボン・インペラー（ｈｅｌｉｃ ａｌ ｒｉｂｂｏｎ ｉｍｐｅｌｌｅｒ、ＨＲＩ）コンピューター監視および制 御バイオリアクターにより試験して成功した。従来のバッチ培養物（細胞数約２ 〜２．５×１０⁶個ｍｌ^-1）と比較して最高で約３倍（すなわちビチス・ビニフ ェラ培養物につき約７．２×１０⁶個ｍｌ^-1、実施例１参照）および約１０倍（ すなわちエシュショルチア・カリフォルニカ培養物につき約２０×１０⁶個ｍｌ^{- 1} ）が達成された。得られた培養法を適正に操作および制御することにより、少 なくとも最高約３０倍（約６０×１０⁶個ｍｌ^-1）の細胞増加が期待される。 本発明は以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解されるであろう 。これらは本発明を説明するために示したものであって、本発明の範囲を限定す るためのものではない。 実施例Ｉ バイオリアクター内で実施したビチス・ビニフェラ細胞培養の細胞濃度上昇植物細胞系および懸濁培養 ０．１ｍｇ Ｌ^-1α−ナフタレン酢酸、０．２ｍｇ Ｌ^-1カイネチンおよび３ ０ｇ Ｌ^-1ショ糖を補充した植物細胞培養用標準ガンボルグＢ５増殖培地（Ｇａ ｍｂｏｒｇ，Ｏ．Ｌ．）ら（１９６８）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，５０：１ ５１−１５８）１００ｍｌを入れた綿栓付き５００ｍｌ広口三角フラスコ内で暗 所において、ビチス・ビニフェラ細胞系の懸濁培養を維持した。この培地を使用 前に２０分間、水蒸気滅菌した。１１５ｍｌの懸濁液を入れた５００ｍｌフラス コ内で、２５℃に維持し、１１５ＲＰＭで撹拌しながら振とうフラスコ懸濁培養 を行った。バイオリアクター培養のための接種物を同様に１−Ｌのフラスコ内で 調製した。バイオリアクター培養 コンピューターベースシステムを用いた温度、混合速度、溶存酸素濃度（ＤＯ ）および培地導電率（監視のみ）の連続監視および制御のために装備した２−Ｌ ヘリカル・リボン・インペラー（ＨＲＩ）バイオリアクター内で、培養を行った 。バイオリアクターおよび培地（前記と同じ）を１時間、水蒸気滅菌した。用い た細胞系独自の要件に従って、25℃において無光下で培養を実施した。接種容量 により、初期バイオマス濃度約１．６ｇ ｄｗ Ｌ^-1となった。初期混合速度を ６０ＲＰＭに設定した。 実験前に検量した予め分極させた（ｐｒｅｐｏｌａｒｉｚｅｄ）インゴールド （ＩＮＧＯＬＤ、商標）ポーラログラフプローブを用いて、バイオリアクター培 養物の溶存酸素濃度（ＤＯ）を測定した。 ０．２Ｌ ｍｉｎ^-1（約０．１ＶＶＭ）の速度で通気したバイオリアクターヘ ッドスペースの酸素分圧を操作することにより、溶存酸素濃度を５０％空気飽和 に制御した。適正な制御アルゴリズムに従ってコンピューター調節されたガス混 合システムにより、自動的にこの組成に調整した。明らかにこの培養システムの 初期酸素伝達速度（ＯＴＲ）は低かった。ＤＯ制御装置が飽和した時点で、バイ オリアクターの混合速度を培養物の酸素要求に適合するように次第に高めた。達 した最高速度は１００ＲＰＭであった。その結果生じたゆるやかな混合剪断力増 大は、実験中にみられた細胞屑の量が少ないことからみて（全バイオマス容量の ＜１〜２％）、細胞および懸濁液に影響を与えなかった。多量養素供給計画 （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄およびグルコースの濃厚水溶液を別個に調製し、水蒸気滅菌 （２０分）前に０．１Ｎ ＫＯＨによりそれらのｐＨを５．８に調整した。細胞 外炭水化物枯渇はビチス・ビニフェラ細胞の生存に著しい影響を与えるので（Ｐ ｅｐｉｎ，Ｍ．Ｆ．ら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉ ｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４７：１３１−１３８）、炭水化物制限を防ぎ、培 地が連続的細胞増殖を確実に持続しうるように、供給計画にはグルコースを含め た。これらの溶液を使用前に混合した。 供給計画は、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄＋グルコース溶液を８．５Ｌ ｈ^-1の一定速度 で添加することからなっていた。これは供給速度０．２２ｍＭ ＮＨ₄ ｈ^-1、 および全グルコース濃度上昇５ｇ Ｌ^-1に相当する。Ｐｅｐｉｎら（１９９５， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４７： １３１−１３８）にみられるように、培地の酸素取込み速度（ＯＵＲ）および細 胞分裂のレベル低下を利用して、バイオリアクター培養物への濃厚（ＮＨ₄）₂Ｓ Ｏ₄＋グルコース溶液添加を開始した。分析法 懸濁液試料１ｍｌの細胞凝集物を１０％（ｗ／ｖ）三酸化クロム溶液２ｍｌで 解離した後、フーシュ−ローゼンタール（Ｆｕｓｃｈ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）血 球計数器を用いて細胞数を測定した。この混合物を６０℃に６０分間保持した。 アセトン１Ｌに溶解したフルオレセインジアセテート５ｇの溶液で着色した後、 細胞生存性をアッセイした。植物細胞懸濁液試料のｐＨおよび導電率を、慣用さ れるｐＨプローブおよび導電率プローブにより測定した。既知容量(約１０ｍｌ) の植物細胞懸濁液をガラス繊維フィルター（ワットマンＮｏ．４１、無灰分、５ μｍ）でろ過することにより、バイオマス濃度を測定した。培地試料をその後の 分析のために凍結した（−２０℃）。細胞を脱イオン水で洗浄し、湿潤バイオマ ス濃度（ｗｗ）測定のために秤量し、乾燥バイオマス濃度（ｄｗ）測定のために ６０℃で２４時間乾燥させた。細胞外炭水化物濃度を、高性能液体クロマトグラ フシステム（ウォーターズ・アソシエーツ社からのポンプモデル６０００Ａ、ギ ルソン社からの自動インゼクターモデル２３１／４０１および屈折率検出器モデ ル１３２、マンデル社からのブロックヒーターモデル７９８０、ならびにヒュー レット・パッカード社からの積分計モデル３３９４Ａ）で測定した。炭水化物の 分離は、８０℃に保持したバイオラッド・アミネックス、カーボハイドレートＨ ＰＸ−８７Ｃ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ＨＰＸ−８７Ｃ、商標）を用いて行 われた。移動相は１．０ｍｌ ｍｉｎ^-1の速度で流れる水であった。濃度をすべ て水の蒸発および湿潤バイオマス容量につき補正し、したがって初期培養物容量 基準で報告する。 バイオリアクター培養の酸素取込み速度(ＯＵＲ)は、同時に溶存酸素濃度(Ｄ Ｏ)制御装置の動作を止め、かつバイオリアクター混合速度を１２ＲＰＭに低下 させることにより、定期的に測定された。これらの操作条件で、ＤＯ測定の動態 および植物細胞懸濁液の混合に過度の影響を与えずに、培養物への酸素伝達速度 （ＯＴＲ）が最小になった。得られたＤＯ低下は方程式１で表される。 ｄＤＯ＝ＯＴＲ−ＯＵＲ （１） ｄｔ これらの一時的操作条件で得られたＯＴＲレベルは、微分値ｄＤＯ／ｄｔの５ ％未満であった。したがって得られたＯＵＲは、経時的に低下するＤＯの傾斜か ら方程式２により判定された。 対数乾燥バイオマスおよび細胞濃度増殖曲線の直線部分についての線形回帰を 用いて、平均比増殖速度を計算した。結果と考察 プログラミングされたグルコース富化（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄溶液添加を伴う供給バ ッチ式バイオリアクター培養に関する細胞数および乾燥バイオマスの増殖曲線を 、図１Ａに示す。７．９日目から９．７日目までのＮＨ₄添加により、最初のＯ ＵＲレベル低下（図１Ｂ：６．３日目）後も細胞分裂が持続し、細胞濃度が上昇 した。 ２８ ｈ^-1、すなわち培養開始以来同じ値に、一定に保持された。細胞増殖期間 の延長により、バイオリアクター培養につき生存細胞数７．２×１０⁶個ｍｌ^-1 の濃度に達することができた。一方、振とうフラスコによる対照培養については 、６．５日目に生存細胞数２．３×１０⁶個ｍｌ^-1で細胞濃度レベルが低下した （図２）。ＯＵＲがその最大値に達した時点で濃厚な栄養素溶液を供給するのは 、細胞増殖を高めるための有効な計画であることが証明された。 追加ＮＨ₄イオンの供給後、最初の２４時間の間に、容量酸素取込み速度は１ ．５〜２．０ｍｍｏｌ ｈ^-1から２．６〜２．８ｍｍｏｌ ｈ^-1に上昇し、その 後プラトーに達した。細胞分裂再誘導の２４時間後、生存細胞濃度低下のため、 相対ＮＨ₄添加量は９．９ｍｍｏｌ ＮＨ₄（細胞数１０⁶個 ｈ）^-1から５．５ ｍｍｏｌ ＮＨ₄（細胞数１０⁶個 ｈ）^-1に低下した。これはより高い酸素取込 み速度および細胞分裂増大を持続させるには不十分であったかもしれない。 ＯＵＲがその最大値に達した時点で濃厚な栄養素溶液を供給するのは、ビチス ・ビニフェラ細胞培養の細胞分裂を高めるための有効な計画であることが証明さ れた。グルコース富化（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄水溶液添加により、細胞増殖期間を持続 させることができた。対照振とう培養についての細胞数２．３×１０⁶個ｍｌ^-1 と比較して、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄補充培養については生存細胞濃度が７．２×１０⁶ 個ｍｌ^-1に達した。 本発明をその特定の態様に関して記載したが、これらをさらに改変することが でき、本発明は一般に本発明の原理に従った本発明のいかなる変更、使用、また は応用をも包含することは理解されるであろう。本発明は本発明の開示から当業 者に自明の、および前記の本質的特色に適用できる、および以下の請求の範囲に 示す程度の逸脱は本発明に包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 アーチアンボールト，ジーン カナダ国ケベック エイチ９イー・１エス ２，イル・ビザー，リュー・サン―ラファ エル 248 (72)発明者 シャヴァリエ，クロード カナダ国ケベック ジェイ０アール・１エ ル０，サント―アデール，シュマン・デ ュ・ラク 1150

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物細胞の細胞増殖を再誘導および刺激することによりインビトロ培養植 物細胞の増殖速度および細胞濃度を高める方法であって、 ａ）植物細胞培養物を栄養培地中で細胞分裂の開始に適した増殖条件下に増殖 させ；そして ｂ）細胞培養物に、初期増殖段階と細胞培養物の死の前との間のいずれかの時 点で、細胞培養物にとって有毒でなく細胞分裂を再誘導するのに十分である量の 追加のアンモニウムイオンを補充し； これにより、培養物の植物細胞濃度を高めるために細胞分裂を再誘導、刺激、維 持および増大させる 工程を含む方法。 ２．工程ａ）の増殖を、培養物の酸素取込み速度を監視しながら行わせる、請 求項１記載の方法。 ３．工程ｂ）のアンモニウムイオンを、酸素取込み速度が実質的にプラトーに 達したときに添加する、請求項２記載の方法。 ４．工程ｂ）のアンモニウムイオンが、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＮＨ₄ＮＯ₃、（Ｎ Ｈ₄）₂ＰＯ₄、酢酸アンモニウムおよびグルタミンよりなる群から選択される、 請求項１記載の方法。 ５．工程ｂ）がさらに、炭水化物、溶存酸素、ホスフェートおよびカリウムよ りなる群から選択される栄養素を添加することを含む、請求項１記載の方法。 ６．炭水化物が、ショ糖、グルコースおよびフルクトースよりなる群から選択 される、請求項５記載の方法。 ７．工程ａ）の増殖を、フラスコ、いずれか適切な培養器、またはバイオリア クター内で行わせる、請求項５記載の方法。 ８．工程ａ）の増殖を、培養器またはバイオリアクター内において、バッチ式 、供給バッチ式または連続式で行わせる、請求項７記載の方法。 ９．適切な増殖条件が、無菌性、混合速度、温度、光、酸素供給および栄養培 地である、請求項７記載の方法。 １０．さらに工程ｂ）の後に実施する２工程： ｃ）ファイトケミカル産生のために植物細胞培養物を改変すること；そして ｄ）ファイトケミカルを産生させ、産生したファイトケミカルを増殖した植物 細胞バイオマスおよび培地から単離すること； を含む、請求項９記載の方法。 １１．ファイトケミカルが、アルカロイド類、タキサン類、タキシン類、テル ペン類、ステロイド類、キノン類、フラボノイド類、タンニン類、サポニン類、 クマリン類、カロテノイド類、およびその任意の生合成中間体よりなる群から選 択される、請求項１０記載の方法。 １２．さらに工程ｂ）の後に実施する２工程： ｃ）組換えタンパク質および抗体の産生のために植物細胞培養物を改変するこ と；そして ｄ）組換えタンパク質および抗体を産生させ、産生した組換えタンパク質およ び抗体を増殖した植物細胞バイオマスおよび培地から単離すること； を含む、請求項９記載の方法。 １３．植物ベースの培養法を工業的規模にまで拡大する方法であって、 ａ）植物細胞培養物を請求項１記載の方法に従って増殖させて、高い細胞濃度 の第１容量の培養物を得て；そして ｂ）植物細胞培養を工業的規模にまで拡大するために、濃厚な第１容量の少な くとも一部を第２容量の培養物に接種し、その際第２容量は第１容量より大きく ； これにより、植物細胞培養物の接種容量比が従来のバッチ式培養法を用いた場合 より低くなる； 工程を含む方法。 １４．高濃度が細胞数約３×１０⁶〜６０×１０⁶個／ｍｌである、請求項１３ 記載の方法。 １５．接種容量比が約１：２０〜１：６０である、請求項１４記載の方法。