JPH01165391A - ベルベリン型アルカロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は植物細胞あるいは組織あるいはその両者を培養
することによって、有効成分であるベルベリン型アルカ
ロイドを多量に効率よく生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

キンポウゲ科のオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉ
ｃａ）やアキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　ｍ１ｎ
ｕｓ）、ミカン科のキハダ（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏ
ｎ　ａｍｕｒｅｎｓｅ）　、メギ科のメギ（Ｂｅｒｂｅ
ｒｉｓ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）などの植物にはベルベ
リン型アルカロイドが含有されており、これらアルカロ
イドは、例えば整腸薬、細菌性腸疾患治療薬、染料など
に利用されその需要は大きい。

しかしながら、天然で生育したこれら植物からベルベリ
ン型アルカロイドを直接採取する方法は、植物体中のア
ルカロイド含量が極めて低いこと、また生育等が自然環
境や天候に左右される上に収穫までに長年月を要するこ
と、また該植物の収集にも時間と手間がかかるために有
利な方法とは言えない。

そこで、これに代わるものとして組織培養法によりベル
ベリン型アルカロイドの生産方法がこれまでに提案され
ており、例えばファイトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）　２３巻、２８１〜２８５頁には、植
物ホルモンとしてα−ナフタレン酢酸およびべンジルア
デニンを含有させたリンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎ
ｓｍａｉｅｒ−５ｋｏｏｇ）の液体培地を用いてオウレ
ンを組織培養する方法が提案されている。しかしこれら
従来の培地を用いる組織培養法を採用しても、細胞中の
アルカロイド含量は低く、工業生産に適しているとは言
えない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは、かかる点を認識した上で、工業生産が有
利になるように得られる細胞中のベルベリン型アルカロ
イドを高める方法を鋭意検討した結果、下記方法を採用
すれば高含量のベルベリン型アルカロイドを含む細胞が
得られることを見出し、本発明を完成するに到った。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち、本発明のベルベリン型アルカロイドの製造方
法は、植物の細胞及び又は組織を培養することによるベ
ルベリン型アルカロイドの製造方法において、アンモニ
ウムイオン濃度の割合が、総無機窒素濃度の５０％以上
である培地を用いて植物の細胞及び又は組織の培養を行
い、培養物からベルベリン型アルカロイドを採取するこ
とを特徴とする。

合がすべて５０％以下、多くは３４％以下であり、これ
らの培地を用いてもベルベリン型アルカロイドの生産は
可能であるが、得られる細胞のアルカロイド含量は本発
明の適用によって得られる細胞に比べてきわめて低いも
のである。

本発明に用いられる植物としては、例えばキンポウゲ科
のオウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ）等コプ
テイス属、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　ｍ１
ｎｕｓ）等タリクトラム属、Ｈｙｄｒａｓｔｉｓ　ｃａ
ｎａｄｅｎｓｉｓ等ヒドラステイス属、ミカン科のキハ
ダ（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ　ａｍｕｒｅｎｓｅ）
等フェロプントロン属、Ｆｉｖｏｄｉａ　ｍｅｌｉａｅ
ｆｏｌ−ｉａ等エボディア属、Ｔｏｄｄａｌｉａ　ａｃ
ｕｌｅａｔａ等トダリア属、Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　
ｃａｒｉｂａｅｕｍ等ザントキシラム属、メギ科のメギ
（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ　ｔｈｕｎｂｅｒｇｔｉ）等ベルベ
リス属、Ｍａｈｏｎｉａ　ａｃａｎｔｈｉｆｏｌｉａ等
マホニア属、Ｎａｎｄｉｎａ　ｄｏｍｅｓｔｉｃａ等の
ナンディア属、バンレイシ科のＸｙｌｏｐｉａ　ｐｏｌ
ｙｃａｒｐａ等ザイロピア属、ツヅラフジ科のＡｒ（、
ｈａｎｇｅｌｉｓｉａ　ｆｌａｖａ等アルカンゲリシア
属、Ｃｏｓｃｉｎｉｕｍ　ｂｌｕｍｅａｎｕｍ等コシニ
ウム属の植物を挙げられる。本発明ではこれら植物の中
では特にコプテイス属あるいはタリクトラム属の植物を
用いることが好ましい。

本発明の植物の細胞及びまたは組織の培養に用いられる
培地としては、従来から知られている植物の組織培養に
使用されている培地においてアンモニウムイオンの濃度
の割合が総無機窒素濃度の５０％以上であることを特徴
とする培地が使用される。すなわち、本発明の方法にお
いて使用される培地は無機窒素成分のうち５０％以上、
好ましくは７０％以上がアンモニウムイオンからなる培
地である。そして本発明では総無機窒素濃度に対するア
ンモニウムイオン濃度の割合が前記範囲内にある限り、
アンモニウムイオン以外の他の培地成分を１、必要に応
じて広い濃度範囲で変化させて使用することができる。

本発明において培地を構成する必須成分−として使用さ
れるアンモニウムイオンの形態は、硝酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸水素アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素−アンモニウ
ム、リン酸三アンモニウム、リン酸三アンモニウム、炭
酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウムなどの無機塩類
、乳酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、クエン酸
アンモニウムなどの有機カルボン酸のアンモニウム塩、
または、各種アミノ酸のアンモニウム酸などの中から自
由に選ぶことができる。また、これらの塩類の中から二
種類以上を組合せて用いることもできる。本発明におい
ては工業生産に適用する見地から、培地のｐＨを大きく
変化させない点で硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウムなどの無機塩類の使用が好ましい。

本発明で使用される培地は、無機成分および炭素源を必
須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類および
アミノ酸類から選ばれる少なくとも１種類以上の成分を
添加した培地であり、更に必要に応じてこれ以外の他の
成分も併用使用することができる。

該培地の無機成分としては、前記アンモニウム塩の他に
硝酸塩、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、
イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン
、塩素、ナトリウム、ヨウ素およびコバルト等の元素を
含む無機塩を挙げることができ、具体的には硝酸カリウ
ム、硝酸ナトリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２
水素カリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ア
ンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸
第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデ
ン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、
硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示でき
る。

該培地の炭素源としては、シー！糖等の炭水化物とその
誘導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級ア
ルコール等を例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、インドール酢酸（Ｉ
ＡＡ）　、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ｐ−クロロフェ
ノキシイソ酢酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）等のオーキシン類およびカイネチン、ゼ
アチンおよびベンジルアデニン等のサイトカイニン類を
例示できる。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢｌ）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
ＢＺ）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、システィンおよびリジンなどを例示
できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μモル／ｌないし約１００ｍモル／！程度、前記炭素源
を約１ｇ／！ないし約１００ｇ／ｆ、前記植物ホルモン
類を約０．０１μモル／ｌないし約２０μモル／ｌ程度
および前記ビタミン類と前記アミノ酸類をそれぞれ約０
．１■／ｌないし約１５０ｍｇ／　ｌ程度含ませて使用
される。

本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒天を通常
０．５〜１％含有させた固体培地でもよいが、本発明で
は液体培地を用いることが好ましい。

本発明の方法においては、培地中のアンモニウムイオン
濃度の割合を前記範囲に保持しながら、かつ該培地中の
前記他成分の濃度を調整することにより、培養細胞また
は組織中のベルベリン型アルカロイドの生成量をさらに
増大させることができる。例えば、植物がキンポウゲ科
に属する場合には、本出願人が特開昭６１−９２２７号
で提案した方法である、培地中の銅イオンの濃度を０．
２モル／２以上にする方法を必要に応じて本発明の方法
に対して適用すると該アルカロイドの生成量を増すこと
ができるので好ましい。

本発明で用いられる前記培地として具体的には、従来か
ら知られている植物の組織培養に用いられている培地、
例えば、ムラシゲ・スクーグ（’６２）（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　）の培地、リンスマイヤー・
スクーグ（ＲＭ−１９６５）　　ＣＬｉｎｓｍａｉｅｒ
　＆　Ｓｋｏｏｇ　〕の培地、ホワイト（’６３）　（
Ｗｈｉｔｅ）の培地、ガンポルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）の
Ｂ−５培地、三井のＭ−９培地、ニッチ・エッチの培地
（Ｎｔｔｓｃｈ　＆　Ｎ１ｔｓｃｈ　：１等に前記した
炭素源および植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて
前記したビタミン類、アミノ酸類を添加して調製される
培地を例示できるが、本発明ではこの中でも特にエッチ
・エッチ、リンスマイヤー・スクーグ又はムラシゲ・ス
クーグの培地を用いて調製される培地が好ましい。なお
、上記した従来公知の培地の組成に関しては、例えば、
行内、中島、古谷著の「新植物組織培養Ｊ　Ｐ３８６〜
Ｐ３９１、朝食書店、１９７９年に記載されている。

本発明の方法において、前記培地を用いた植物の組織培
養の方法について以下に詳述する。先ず該植物の植物体
、例えば、根、生長点、葉、菫、果実、種子等から採取
された組織片を、例えば、新植物組織培養（朝食書店１
９７９年版）２１真に記載されている寒天で固めた、リ
ンスマイヤー・スクーグの培地（ＲＭ−１９６５）に置
床して、１０〜３５°Ｃで７〜３０日程度培養すること
によって該組織片の一部をカルス化させる。このように
して得られる該植物のカルスを、通常知られている方法
によって継代培養すると、カルスの生育速度が漸次高ま
る。

次にこのカルスを増殖に適した液体培地、例えば、新植
物組織培養（朝食書店１９７９年版）、２１頁に記載さ
れているリンスマイヤー・スクーグの液体培地（培地Ａ
）に移して更に増殖させるとカルスの生育速度は更に高
められ安定化したカルスが得られる。本発明の方法では
、このようにして得られる安定化したカルスを本発明の
前記培地（液体培地Ｂ）に添加して更に培養が行われる
。

本発明の方法において、前記安定化したカルスを前記培
地Ｂ中で培養する際の該カルスの初期濃度としては、該
濃度を広い範囲で変えることができるが、通常は、本発
明の前記培地Ｂの１１に対して該カルスを新鮮なときの
重量で表示して約１ないし約２００ｇ程度、好ましくは
約１０ないし約１００ｇ程度添加するのが望ましい。

本発明の組織培養における培養温度としては、通常は、
約１０ないし約３５°Ｃ１この中でも特に約２３ないし
約２８°Ｃが好適であり、該温度を約１０°Ｃ未満にす
るとカルスの増殖速度は小さく、また該温度を３５°Ｃ
以上にしたときも同様にカルスの増殖速度は小さくなる
。本発明の組織培養を行うに当たっては、光は必ずしも
必要ではないが、光の照射はベルベリン等のアルカロイ
ドの生成を妨げない。

本発明の方法を用いて生産されるベルベリン型アルカロ
イドとしては、ベルベリン、パルマチン、コプチシン、
ヤトロリジン、コロンバミン、ウォレニン、エビベルベ
リン、ベルベラスチン、ゲロニンランデイシン、タリフ
エンジンなどが挙げられる。これらアルカロイドの組成
比は植物によって異なるが、本発明によって得られる効
果はアルカロイド組成比の違いによって制限されるもの
ではない。

本発明の方法においては、培養終了後カルスをデカンテ
ーションあるいは濾過等の方法によって培地Ｂから分離
し、次に該カルスから目的とするベルベリン等のベルベ
リン型アルカロイドを従来から知られている天然品のオ
ウレン、オウバク等に適用されている抽出等の方法によ
って分離することができる。このようにして得られる書
亥アルカロイドは必要に応じて更に再結晶等の方法によ
って純度を高めることができる。

本発明の方法は、液体培地を用いることもできるのでタ
ンク等を利用した大量培養が可能であり、更にカルスの
増殖が速やかで、かつベルベリン等のアルカロイドを確
実に大量生産することができる工業上有利な方法である
。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によって更に詳しく説明する。

実施例　１〜１２ 組織培養の培地成分が第１表に示す組成を有するリンス
マイヤー・スクーグの液体培地を寒天で固めた固体培地
（寒天１重量％）に、前もって２％アンチホルミン溶液
あるいは７０％エタノール溶液等で滅菌処理したセリバ
オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａ−ｐｏｎｉｃａ　Ｍａｋ
ｉｎｏ　ｖａｒ、　ｄｉｓｓｅｃｔａ　Ｎａｋａｉ）の
葉の一部を置床し、２５°Ｃで暗所にて静置培養してそ
れぞれのカルスを得た。次にこれらのカルスを、上記と
同様の条件で、リンスマイヤー・スクーグの液体培地で
、１４日毎に植えつぎ、ロータリーシェーカー上で旋回
培養（振幅２５ｍｍ、１０１００ｒｐ　して、該カルス
の生育速度を速め、安定化したセリバオウレンカルスを
得た。

一方、これとは別にリンスマイヤー・スクーグの窒素源
を塩化アンモニウムまたは塩化アンモニウムおよび硝酸
アンモニウムを用いて総無機窒素濃度が３０ｍＭおよび
９０ｍＭ、アンモニウムイオンの割合が５０％、７０％
、９０％、１００％になるように培地を調製し、各々の
２０−をそれぞれ別個の内容積１００ｄのエルレンマイ
ヤーフラスコに取り、これらを１２０°Ｃで１０分間保
持して滅菌処理を施した。次にそれぞれの液体培地に、
先に得た所の生育速度の高められた新鮮な安定化したセ
リバオウレンカルスをそれぞれ０．２０ｇ添加して、２
５°Ｃで１４日間ロータリーシェーカー上で旋回培養（
振幅２５ｍｍ、１０１００ｒｐ　した。

培養後のカルスは濾過により採取し、４０’Ｃで１昼夜
風乾したのちその重量（乾燥重量）を測定し、液体培地
ｉｆ当たりに換算した培養細胞の生育型Ｉを求めた。ベ
ルベリン等のアルカロイドは、得られた乾燥カルスをメ
タノール等を用いて抽出し、高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて、標準品と比較することによって測定した。

この結果を第２表に示した。

比較例　１〜３ 使用した液体培地が第１表に示したリンスマイヤー・ス
クーグ培地そのものである場合を比較例２、前記培地に
おける総無機窒素に対するアンモニウムイオンの割合は
変えずに、総無機窒素濃度を３０ｍＭまたは９０ｍＭに
変えた場合をそれぞれ比較例１及び３として、その他は
実施例１〜４と同様にしてリバオウレンの組織培養、産
生アルカロイドの抽出、含量の測定等を行った。この結
果を第２表に示した。

実施例　１３〜２４ 使用した植物がアキカラマツであること、および第１表
に示される培地組成のうちホルモン濃度がナフタレン酢
酸１００μＨ、ベンジルアデニン５μｈであること以外
は、実施例１〜４と同様にしてアキカラマツの組織培養
、産生アルカロイドの抽出、含量の測定等を行った。こ
の結果を第３表に示した。

比較例　４〜６ 使用した液体培地が第１表に示したリンスマイヤー・ス
クーグ培地そのものである場合を比較例５、前記培地に
おける総無機窒素に対するアンモニウムイオンの割合は
変えずに、総無機窒素濃度を３０ｍＭまたは９０＋ｗＭ
に変えた場合をそれぞれ比較例４及び６として、実施例
５〜８と同様にしてアキカラマツの組織培養、産生アル
カロイドの抽出、含量の測定等を行った。この結果を第
３表に示した。

（本頁以下余白） 第１表　リンスマイヤー・スクーグ培地ＮＨＪ（ｈ　　
　　　　　　　　　　１６５０ＫＮＯ３１９００ ＣａＣ１ｚ　・２Ｈｚ０　　　　　　　　　４４０Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２０３７０ ＫＨ２ＰＯ４１７０ Ｋｌ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，８３Ｈ：１
ＢＯ３６，２ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０２２，３ ＺｎＳＯ４’　７Ｈｚ０　　　　　　　　　　８．６Ｎ
ａｚＭｏ０４・２ＨｚＯＯ，２５ ＣＬＩＳＯ４・５ＨｚＯＯ，０２５ ＣＯＣ１２・６ｔｈＯＯ，０２５ Ｎａｇ　・　ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　３７．３ＦｅＳＯ４・７ＨｚＯ２７，
８ 蔗　　糖　　　　　　　　　　　　３００００イノシト
ール　　　　　　　　　１００チアミン・）ＩＣＩ　　
　　　　　　　　　Ｏ，４α−ナフタレン酢酸　　　　
　　１０　　μＨ６−ベンジルアデニン　　　　　　０
．０１μＨ第　　２　　表 実施例１　　　３０　　　　　５０　　　　　　　　７
．５〃２　３０　７０　　７．９ 〃３　３０　９０　　８．９ 〃４　３０　１００　　９．８ 〃５　６０　５０　　１０．０ 〃６　６０７０　　１０．２ 〃７　６０　９０　　１１．１ 〃８　６０　１００　　１２．０ 〃９　９０　５０　　８．８ 〃１０　９０　７０　　８．８ 〃１１　９０　９０　　１０．５ 〃１２　９０　１００　　１２．５ 比較例１　　　３０　　　　　３３　　　　　　　　６
．９〃２　６０　３３　　８．０ 〃３　９０　３３　　７．０ 第　　３　　表 実施例１３　　　３０　　　　　５０　　　　　　　　
２．０〃１４　３０　７０　　３．３ 〃１５　３０　９０　　６．１ 〃１６　３０　１００　　７．６ 〃１７　６０　５０　　１．８ 〃１８　６０　７０　　２．８ 〃１９　６０　９０　　６．６ 〃２０　６０　１００　　７．２ 〃２１　９０　５０　　１．６ 〃２２　９０　７０　　２．３ 〃２３　９０　９０　　７．０ 〃２４　９０　１００　　７．５ 比較例４　　　３０　　　　　３３　　　　　　　　０
．８〃５　６０　３３　　０．９ 〃６　９０　３３　　０．６ 培地中に放出されたアルカロイドと細胞に含まれるアル
カロイドをあわせて計算した。

〔発明の効果〕

本発明の方法を採用すれば、従来法に比べて細胞または
組織またはその両者に含まれるベルベリン型アルカロイ
ドの含量を増加させることができる。

出願者　生体機能利用化学品新製造技術研究組合代理人
　弁理士　平　木　祐　輔

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物の細胞及び又は組織を培養することによるベル
   ベリン型アルカロイドの製造方法において、アンモニウ
   ムイオン濃度の割合が、総無機窒素濃度の５０％以上で
   ある培地を用いて植物の細胞及び又は組織の培養を行い
   、培養物からベルベリン型アルカロイドを採取すること
   を特徴とするベルベリン型アルカロイドの製造方法。 ２、植物がキンポウゲ科植物である特許請求の範囲第１
   項に記載のベルベリン型アルカロイドの製造方法。