JPS63245687A

JPS63245687A - プロトピンの製造方法

Info

Publication number: JPS63245687A
Application number: JP8019087A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Inagaki; 稲垣　伸行; Minoru Okada; 稔岡田; Kaoru Nakajima; 薫中島; Heihachiro Taguchi; 平八郎田口
Original assignee: Tsumura and Co
Current assignee: Tsumura and Co
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1987-04-01
Publication date: 1988-10-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はコリダリス（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）属植物の根
の培養によるプロトピンの製造方法に関するものである
。

［従来の技術および問題点コプロトピンは、植物中に広汎に含まれているアルカロイ
ドの一種で、血小板′ｌｉ集抑制作用など顕著な生理作
用を有し、医薬品として、またその中間原料として有用
である。

プロトピンの工業的生産は、合成法では極めて難しくコ
ストもかかるため、野生の植物、または栽培した植物か
らの抽出に依存せざるを得ない。

しかしながら、野生植物は資源的に限界があり、また植
物を栽培する場合には、その生育に時間がかかるばかり
でなく天候など自然条件の影響を受は易く、原料の安定
した供給が難しいのが実情である。

一方、数種のケシ科植物において、未分化細胞を培養す
ることによってプロトピンが生産できることが報告され
ている。しかし、未分化培養細胞によって生産できるプ
ロトピンは極めて微量であり、この手法により、効率的
でかつ大量にプロトピンを生産するのは難しい。

従って、本発明の目的は従来の方法と全く異なる方法に
より工業的に有利にプロトピンを製造しうる方法を提供
せんとするものである。

［問題点を解決するための手段］本発明者等は、効率的かつ安定してプロトピンを製造す
る方法について研究を重ねた結果、コリダリス（Ｃｏｒ
ｙｄａｌｉｓ）属植物の根を培養した培養根に多量のプ
ロトピンが存在する。ことを見いだし、この知見に基づ
いて本発明を完成した。即ち本発明はコリダリス属植物
の根を培養し、該培養根からプロトピンを分離採取する
ことを特徴とするプロトピンの製造方法である。

［実施例］以下に本発明のコリダリス属植物の根の培養によるプロ
トピンの製造方法について詳細に説明する。

本発明のコリダリス属植物の具体例としてはケシ科コリ
ダリス属のエンゴサク（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓｔｕｒｔｓ
ｃｈａｎｉｎｏｖｉｉ　ｒ、　ｙａｎｈｕｓｕｏ）、コ
ウライエンゴサク（Ｃ，ｎａｋａｉ）　、エゾエンゴサ
ク（Ｃ，ａｍｂｉｇｕａ）、ジロボウェンゴサク（Ｃ，
ｄｅｃｕｓｂｅｎｓ）　、ヤマエンゴサク（Ｃ，１ｉｎ
ｅａｒｉｌｏｂａ）　、タイトウケマン（Ｃ，ｃａｍｐ
ｕｌｉｃａｒｐａ）、ミャマキケマン（Ｃ，ｐａｌｌｉ
ｄａ）　、ムラサキケマン（Ｃ，１ｎｃｉｓａ）、ツル
キケマン（Ｃ，ｏｃｈｏｔｅｎｓｉｓ）　、ヤマキケマ
ン（Ｃ，ｏｐｈｉｏｃａｒｐａ）等が挙げられる。

コリダリス属植物から培養に用いる根を得るには、まず
、コリグリス属植物の塊茎、葉部、葉柄部、茎部、根部
、生殖器官または種子等の組織を通常用いられる一般的
な滅菌法（例えば、エタノール水溶液、次亜塩素酸水溶
液、滅菌水等を用いる方法）により滅菌し、適当な大き
さに裁断した後、培地に置床し、温度２０〜３０℃で、
３〜５週間培養を行いカルスを誘導する。次に、該カル
スを、オーキシン類を０．５ｐｐｍ以下の濃度にした培
地に移植することにより、不定根、不定芽または不定胚
等を再分化させる。これをさらに培養することによって
培養に用いる根を得ることができる。また、前述の植物
組織を一般的な滅菌法（例えば、エタノール水溶液、次
亜塩素酸水溶液、滅菌水等を用いる方法）により滅菌し
、適当な大きさに裁断した後、オーキシン類を０　、５
　ｐｐｍ以下の濃度にした培地に置床し、該組織より直
接、不定根、不定芽または不定胚等を再分化させ、これ
をさらに培養することによっても、培養に用いる根を得
ることができる。また、コリダリス属植物の種子を通常
用いられる一般的な滅菌法（例えば、エタノール水溶液
、次亜塩素酸水溶液、滅菌水等を用いる方法）により滅
菌した後、無菌的に発根させることにより、培養に用い
る根を得ることができる。

以上の培養に用いる培地としては、各種既知の無機合成
培地を基本とし、これに糖類、植物生長調整物質、ビタ
ミン類および天然物質を添加した培地に、寒天またはジ
ェランガム等を加えて固化させた固体培地を用いること
ができる。

代表的な合成培地としては、ホワイト（ｌｈｉ、ｔｏ）
の培地、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆
Ｓｋｏｏｇ）の培地（以下、ＭＳ培地と称する）、リン
スマイヤー−スクーグ（Ｌｉｎｓｍｅｉｅｒ　Ａ　Ｓｋ
ｏｏｇ）の培地、ニッチ（Ｎ１ｔｓｃｈ）の培地、Ｂ５
培地、その他これらの培地を基本として、その組成を変
更したもの等が挙げられる。

無機合成培地の無機成分の具体例としては、銅、窒素、
リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、
鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ナト
リウム、ヨウ素、コバルト等、更にくわしくは、硝酸カ
リウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモ
ニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウ
ム、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、塩化カリウム
、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム
、硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マ
ンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナト
リウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバ
ルト等が挙げられる。

糖類の具体例としては、シュークロース、イノシトール
、グルコース等の炭水化物、その誘導体等が挙げられる
。

植物生長調整物質の具体例としては、インドール酢酸（
ＩＡＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２．４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、インドール酪酸
（Ｉ　ＢＡ）等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン
、ジヒドロゼアチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、イソ
ペンテニルアデニン等のサイトカイニン類が挙げられる
。

またビタミン類の具体例としては、ビオチン、チアミン
（ビタミンＢ、）、ピリドキシン（ビタミンＢ・）、パ
ントテン酸、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ニコチン
酸等が挙げられ、アミノ酸の具体例としては、グリシン
、アラニン、グルタミン、システィン等が挙げられる。

天然物質の具体例としては、カゼイン加水分解物、ココ
ナツトミルク、酵母エキス等が挙げられ、上述した具体
例の他、適宜培養に必要な物質を加えても良い。

以下に、本発明の培養に用いるコリダリス属植物の根の
作出方法の具体例を示す。

具体例エンゴサクの塊茎を洗浄し、流水でよく濯ぎ、７０％エ
タノール中に１分間浸漬し、更に１％次亜塩素酸ナトリ
ウム水溶液で７分間殺菌した後、滅菌水で３回洗浄した
。この塊茎の表面を２１１Ｉ１１の小片に切断し、ＭＳ
培地（ナフタレン酢酸ｌ　ｐｐｌＩｌｑカイネチン３　
ｐｐｍ、シュークロース３％、ジェランガム０．２％含
有）に置床し、２５℃暗黒条件下で培養することによっ
て、およそ１週間後に小片の肥大、ならびに４週間後に
直径ｌａ程度のカルスを得た。該カルスを５■程度の小
片に切断し、植物生長調整物質として、ベンジルアデニ
ンを０．０１ｐｐｍ添加したＭＳ固体培地に移植し、２
５°ＣＩ６時間の日照下（約３０００１ｕｘ）で培養を
行った。約４週間後、カルス表面に多数の不定根、不定
芽または不定胚等の分化が認められ、さらに培養を続け
ることにより多数の根を得た。

以上のようにして得たコリダリス属植物の根を、オーキ
シン類を含む液体培地に移植し、好気的な条件の下で、
温度！５〜３５℃好ましくは２０〜３０℃で２〜８週間
培養する。この際、必ずしら先の照射を必要としないが
、場合によっては光を照射してもかまわない。以上の操
作を繰り返すことによりプロトビンを多量に含むコリダ
リス属植物の根を効率よく安定して生産することができ
る。

培地としては、各種既知の無機合成培地を基本とし、こ
れに無機成分、糖類、植物成長調整物質、ビタミン類お
よび天然物質を添加した液体培地を用いることができる
。

代表的な合成培地としては、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）の
培地、ＭＳ培地、リンスマイヤー・スクーグ（Ｌｉｎｓ
ｍｅｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培地、ニッチ（Ｎ１ｔ
ｓｃｈ）の培地、Ｂ５培地、その他これらの培地を基本
として、その組成を変更したもの等が挙げられる。

無機合成培地の無機成分の具体例としては、銅、窒素、
リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、
鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ナト
リウム、ヨウ素、コバルト等、更に詳しくは、硝酸カリ
ウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸アンモニ
ウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム
、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、塩化カリウム、
塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、
硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マン
ガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸鋼、モリブデン酸ナトリ
ウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバル
ト等が挙げられる。

植物生長調整物質の具体例としては、インドール酢酸（
以下、ＩＡＡという）、α−ナフタレン酢酸（以下、Ｎ
ＡＡという）、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（以下
、２．４−Ｄという）、インドール酪酸（以下、ＩＢＡ
という）等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジ
ヒドｄゼアチン、ベンジルアデニン（以下、ＢＡという
）、イソペンテニル、アデニン等のサイトカイニン類が
挙げられる。

また、オーキシン類の濃度を０．００１〜２０ｐＩ’ｌ
１１％特に好ましくは０．Ｏ１〜５　ｐｐｍに調整する
と、効率良く培養根を得ることができ、プロトピンの生
産性を高めるのに効果的である。更に各オーキシン類の
濃度について言及するならば、ＩＡＡは０．０１〜５ｐ
ｐｇ＋、ＮＡＡは０．０１〜２ｐｐｍ。

２．４−Ｄは０．０１〜２ＰＰｍ、　　Ｉ　ＢＡは０．
０１〜５　ｐｐｍの濃度に調整するのが好適である。

またビタミン類の具体例としては、ビオチン、チアミン
（ビタミンＢ、）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パ
ントテン酸、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、ニコチン
酸等が挙げられ、アミノ酸の具体例としては、グリシン
、アラニン、グルタミン、システィン等が挙げられる。

以上のようにして得られた培養根から、プロトピンを分
離採取するには、通常一般の抽出、単離、精製法により
容易に行うことができる。

［発明の効果コ本発明によれば、天候等の自然の条件の影響を受けるこ
となく、均質かつ大量のプロトピンの原料を効率良く安
定して供給することができ、プロトピンの大量生産が可
能となる。

［製造例］以下、製造例を示して本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれにより何ら制限されるものではない。

製造例！具体例で得たエンゴサクの根を培養物から切り取り、Ｍ
Ｓ液体培地（シュークロース３％含有）に移植し、２５
℃、暗黒条件下、７５　ｒｐｍで４週間、振盪培養を行
った。この根を上記と同じ条件で３代植え継いだ後、Ｉ
ＢＡを０　、１　ｐｐｍ含有するＭＳ液体培地に移植し
、２５℃、暗黒条件下、７５ｒｐｌで４週間振盪培養を
行った。その結果、培養根の増殖率は６．９倍であった
（ＩＢＡを含有しない培地で培養した場合の増殖率は５
．２倍であった。）。

以上のようにして得たエンゴサクの根を５０℃で乾燥し
粉砕した後、１０９をとり、メタノール！００１１ｉで
１時間ずつ２回還流抽出し、抽出液を合わせて濃縮した
。得られたメタノールエキス３．２４９を１０％酢酸に
溶解し、石油エーテルで脱脂した後、アンモニアガスを
飽和させジエチルエーテルで抽出した。ジエチルエーテ
ルエキス０．２４ｖを塩基性アルミナを用いたカラムク
ロマトグラフィーを行うことによって、メタノール：酢
酸エチル（５：ｌ）で溶出した。メタノール：酢酸エチ
ル（５：１）溶出部をさらにシリカゲルカラムクロマト
グラフィーに付し、ヘキサン−アセトン混合溶媒でアセ
トンの比率を順次増加して溶出した。ヘキサン：アセト
ン（１０：４）溶出部を分取薄層クロマトグラフィー［
プレート、メルク社製Ｋｉｅｓｅ１ｇｅｌ　６０　Ｆ　
２５４　；展開溶媒、クロロホルム：メタノール（３：
１）］に付し、プロトピンの標品と比較し、プロトピン
と同じＲｆ値の部分をかき取り、クロロホルム：メタノ
ール（ｌ：ｌ）の混合溶媒で抽出し、抽出液より溶媒を
除去することにより、プロトピン７１．３１９を得た。

製造例２〜４下記に示す条件以外は製造例１と同様に操作し、プロト
ピンを得た。条件および結果を第１表に示す。

第１表なお、植物生長調整物質無添加の場合は、増殖率が５．
２倍、プロトピンの収率は０．７８％であり、市販の延
胡索（中国産市場品）によるプロトピンの収率は０．０
１％であった。

Claims

【特許請求の範囲】

コリダリス属植物の根を培養し、該培養根からプロトピ
ンを分離採取することを特徴とするプロトピンの製造方
法。