JPH01153086A - サフランの生長点細胞組織培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は植物生長調整物質であるオーキシン及びサイト
カイニンを栄養培地中に存在させたサフランの生長点か
らのカルス誘導及び増殖カルスの細胞培養方法に関する
。

［従来の技術・問題点］ サフラン（学名Ｃｒｏｃｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ　Ｌ、）
はアヤメ科の多年生球根植物で、ヨーロッパ原産の薬草
、香辛料であるが、真紅のめしべの柱頭に薬用成分クロ
シンを含み、強い芳香のあるのが特徴である。

その薬効は鎮静、鎮痛、通経、止血、強壮であり、生薬
として、主に婦人票に用いられている。ところが栽培あ
るいは自生しているサフランでは気候、場所、栽培条件
などによって生産性が異なると共に薬用成分クロシンを
含むめしべの柱頭は小さなものなので生産性が劣り、非
常に高価になっている。

このため、近年、植物細胞組織培養によって工業的に安
価に大量生産することが研究開発されている。具体的に
は、サフランの球根から２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ　）０．５　ｍｇ／　ｌ、ゼアチン０．
３ｖｂｇ／ｌを添加したムラシゲ−スクーグ（ＭＳ）ジ
ェランガム固形培地でカルスを誘導培養すること（伊佐
隆、小笠原健：日本植物組織培養学会主催第１０回植物
組織培養シンポジウム講演要旨集、１９８７、第１４７
頁）、サフランの幼めしべあるいは幼子房からめしべ様
新生器官を分化誘導すること（佐野孝之輔、姫野俵太二
日本植物生理学会昭和６２年度大会講演要旨集、１９８
７）が行なわれている。しかし、これらはまだ基礎的研
究段階であり、実用開発には至っていないのが実状であ
る。

従って、本発明の目的はサフランを季節や環境に依らず
、工業的に所望の量を所望の時に得られる方法を提供す
るにある。

［問題点を解決するための手段］ すなわち、本発明はサフランの生長点からのカルスの誘
導工程で濃度０．５〜２０ｍｇ／ｌのカイネチン（Ｋｉ
）及び濃度５〜２０ｍｇ／ｉ’のα−ナフタリン酢酸（
ＮＡＡ）を含有する寒天固形栄養培地を使用し、カルス
増殖工程及びサフラン細胞増殖工程で濃度０．５〜２０
ＩＩ１ｇ／ｌのカイネチン（Ｋｉ）及び濃度５〜２０ｍ
ｇ／ｆのα−ナフタリン酢酸（ＮＡＡ）を含有する液体
栄養培地を使用することを特徴とするサフランの生長点
細胞組織培養法に係る。

［作　用］ 本発明は上記のサフランの器官すなわち球根、幼めしべ
、幼子層を用いるのと違い、サフランの生長点を用いる
ことによって、クロシン含有細胞を大量に増殖培養する
ものである。

すなわち、本発明はサフラン細胞の二次代謝産物であっ
て、色素で且つ薬用成分であるクロシンを生産するため
のものであって、栄養培地に添加する植物生長調整物質
を選別することによって、サフランの生長点からカルス
を誘導し、増殖カルスの細胞培養を可能としたものであ
る。生長点からカルスを誘導したのは、クロシンはサフ
ランの花の柱頭で生産されるが、生長点が生長して柱頭
などを分化するのでクロシン生産カルスを得やすいと考
えたためである。

そこでＭＳ培地、リンスマイヤー−スクーグの培地、ホ
ワイトの培地、ヘラ−の培地などの栄養培地に植物生長
調整物質である種々のオーキシンすなわち２．４−Ｄ、
インドール酢酸、α−ナフタリン酢酸（ＮＡＡ）、イン
ドール酪酸なと、サイトカイニンすなわちアデニン、カ
イネチン（Ｋ　ｉ）、ベンジルアデニン、ゼアチン、イ
ソペンチルアデニンなどを添加してサフランの生長点か
らカルスを誘導することを検討した。その結果、濃度０
．５〜２０ｒｍｇ／ｌのＫｉ及び濃度５〜２０餉ｇ／ｌ
のＮＡＡを含有する栄養培地が、サフランの生長点から
のカルス誘導及び増殖カルスの細胞培養に適しているこ
とを見出した。

本発明において、サフランの生長点からカルスを誘導し
、増殖カルスを細胞培養する操作としては、公知の方法
を採用することができ、例えば第１工程として濃度０．
５〜２０ｍｇ／ＮのＫｉ及び濃度５〜２Ｏｎ＋ｇ／ｌの
ＮＡＡを含有する寒天固形培地上に、滅菌処理したサフ
ランの生長点を置床し、数週間静置培養してカルスを誘
導する。第２工程は第１工程で得られたカルスを好気的
に液体培養して細胞を培地中懸濁させ、更に、増殖させ
るものである。増殖カルスを上記組成成分の液体培地に
移植し、往復振どう培養機を用いて細胞懸濁培養した後
、ファーメンタ−を用いて上記組成成分の液体培地中に
空気を通気しながら培養してクロシンを生産するサフラ
ンの細胞を増殖する。

本発明による濃度０．５〜２０　ｍｇ／　１のＫｉ及び
濃度５〜２０ｍｇ／ｌのＮＡＡを含有する寒天固形培地
にサフランの生長点を置床し、静置培養すると、培養約
２０日で黄土色ないし黄橙色を呈しているカルスが誘導
される。このときＫｉ及びＮＡＡの濃度が上述の濃度範
囲外であるとカルスを誘導せずに、小球根様物とか、芽
や根を分化誘導したり、誘導されたカルスが大きくなら
ずに枯死したりする。また、培養温度は１５〜２５℃が
適当であり、温度が低過ぎるとサフランの生長点が凍眠
状態となったり、カルスの誘導がなされても、その後の
細胞の増殖が遅れ、大きなカルスに生長しない０反対に
、温度が高過ぎるとサフランの生長点が褐変・枯死する
。照明は明所でも暗所でもカルスが誘導される。

カルスが誘導され、細胞が増殖したカルスを濃度０．５
〜２０ｅｇ／ｌのＫｉ及び濃度５〜２０ＩＩｇ／ｌのＮ
ＡＡを含有する液体培地に移植し、往復振とう機やファ
ーメンタ−で数週間細胞培養すると、色素で且つ薬用成
分であるクロシンを含有する細胞が増殖する。このとき
のＫｉ及びＮＡＡ濃度が上述の濃度範囲外であると細胞
の増殖速度が著しく遅くなる。また、培養温度は１５〜
２５°Ｃが適当であり、照明は明所でも暗所でもよい。

［実　施　例］ 以下にＭＳ培地にＫｉ及びＮＡＡ濃度を種々変化させた
１６種の培地へサフランの生長点を植え込み、カルスを
誘導し、増殖カルスの細胞培養を行なった例を説明する
。

アヤメ科の多年生Ｎ物であるサフラン（学名：Ｃｒｏｃ
ｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ　Ｌ、）の球根から生長点近傍を
採取し、２時間流水で良く洗い、７０％エタノール水溶
液に５秒間浸け、１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に浸
けて２０分間軽く振とうして殺菌処理した。殺菌処理後
、クリーンベンチ内で、滅菌水で３回洗浄した後、実体
ｍ微鏡下で滅菌したビンセットとナイフを用いて大きさ
約０．５＋ｓｍの生長点を切り出した。

以下の第１表に記載するＭＳ培地にＫｉｏ、１．０．３
．０．６．１．１０．１７．２５．５０輪ｇ／ｌ、ＮＡ
Ａ０．１、１．３．６．１０．１７．２５．５０ｍｇ／
ｌを含有させた培地を公知の方法で調製し、オートクレ
ーブ（１２０℃、１　、２　ｋｇ／　ｃ＋ａ２．１５分
）殺菌した試験管寒天培地に、上記の生長点をそれぞれ
植込んだ、培養は３０００ルックス１６時間照明、８時
間暗黒下、２３℃、静置培養第　　１　　表 無　　　ＫＮＯ３１９００ ＮＨ４ＮＯ３１６５０ 機　　Ｋ８２Ｐ０．　　　　　　　　　　　１７０Ｃａ
Ｃ１ｚ・２Ｈ２０４４０ 成Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２０３７０ＦｅＳＯ，−７
Ｈ２０２７，８ 分　　ＮａｚＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　　　　　　　　　　　
３７．３Ｍｎ５Ｏ＋’　４　Ｏ２０２２，３ Ｚ　ｎＳ　Ｏ＝　・７　Ｈ２０８，６ Ｈ，Ｂｏ、　　　　　６．２ ＣｕＳ　Ｏ４・５　Ｈ２００，０２’５ＮａｚＭｏＯａ
　・２　Ｈ２００，２５ＫＩ　　　　　　Ｏ，８３ ＣｏＣ１２・６　Ｏ２００，０２５ 有　　ミオイノシトール　　　　　１００機　　ニコチ
ン酸　　　　　　　　　　０．５成　塩酸ピリドキシン
　　　　　　０．５分　塩酸チアミン　　　　　　　　
０．１グリシン　　　　　　　　　　２ 庶Ｎ　　　　　　　　３００００ 培養開始後４０日のそれぞれの培地における培養物の形
体を第２表に示す、カルスが誘導され、細胞が増殖して
大きなカルスになったのは、ＮＡＡ濃度６．１０．１７
１ｇ／ｌ且つＫｉ濃度０．６．１．１０．１７ｍｇ／ｌ
の培地であった。これらの場合には、培養約２０日で黄
土色ないし黄橙色のカルスが誘導されると共にその後の
細胞増殖も良好で大きさ約２０ｍｍのカルスを得ること
ができた。ＮＡＡ濃度が０．１．１．３ｖｍｇ／ｌ且つ
Ｋｉ濃度が０．１．０．３．０．６．１．１０．１７．
２５．５０＋ｎｇ／ｌの培地、ＮＡＡ濃度が２５．５０
ｍｇ／ｌ且つＫｉ濃度が０．１．０．３．０．６．１．
１０．１７．２５．５０ｍｇ／ｌの培地、ＮＡＡ濃度が
６．１０．１７ｒ＊ｇ／ｌ且つＫｉ濃度が０．１．０．
３ｖｍｇ／ｌの培地、及びＮＡＡ濃度が６．１０．１７
Ｉ１ｇ／ｌ且つＫｉ濃度が２５．３０輸ｇ／ｌの培地で
は、第２表中に示す通り、小球根様物とか、根や芽が分
化誘導された。第２表に枯死と記したものは、カルスが
誘導されたが、その後の細胞増殖がなくて細胞が枯死し
たものである。

上述の実験結果から、本発明におけるＮＡＡとＫｉの濃
度がＮＡＡ５〜２０＋＊ｇ／ｊ！且つＫ　ｉｏ　、５〜
２０＋ｓｇ／Ｎの範囲で含有する培地を使用した場合に
良好な結果が得られることが明らかとなった。

次に、前記実験で得られたカルスを前記の培地と同組成
成分の液体培地に移植し、往復振どう培養を行なった。

往復振どう培養は３０００ルックス１６時間照明、８時
間暗黒下、２３℃、振幅４０ｍｍ、振とう数６Ｑｒｐｍ
で２０日間行なった。

得られた懸濁培養細胞を前記の培地と同組成成分の液体
培地に移し、２１容ファーメンタ−で細胞増殖を行なっ
た。細胞増殖培養は通気空気量１００ｍ１／分−１、培
地のｐＨ５，６〜５．９で、室内で１箇月間行なった。

得られた培養液から培養細胞を分離採取したところ、湿
重量７２ｇのサフラン培養細胞が得られた。培養細胞は
エーテルで脱脂後、７０％エタノールで抽出し、抽出液
にエーテルを加えてクロシンを析出させることによって
培養細胞中にクロシンが生産されていることが確認され
た。

［発明の効果］ サフラン中のクロシンは従来はサフランを自然栽培して
花の柱頭から得られていたが、気候、場所、栽培条件に
よっては生産性が異なるので安定に供給することがてき
ず、高価であったが、本発明方法によれば季節や環境に
依らず工業的に所望の量を所望の時に安価に生産するこ
とが可能になる。

特許出願人　株式会社　日本製鋼所

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. サフランの生長点からのカルスの誘導工程で濃度０．５
   〜２０ｍｇ／ｌのカイネチン及び濃度５〜２０ｍｇ／ｌ
   のα−ナフタリン酢酸を含有する寒天固形栄養培地を使
   用し、カルス増殖工程及びサフラン細胞増殖工程で濃度
   ０．５〜２０ｍｇ／ｌのカイネチン及び濃度５〜２０ｍ
   ｇ／ｌのα−ナフタリン酢酸を含有する液体栄養培地を
   使用することを特徴とするサフランの生長点細胞組織培
   養法。