CN117859651A - 一种繁殖多花黄精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药用植物组织培养领域，为解决目前多花黄精组培中存在的根状茎用量大且催芽过程中常因伤口感染导致长出新芽之前就已经腐烂的问题，本发明提供一种繁殖多花黄精的方法，包括以多花黄精的幼胚作为外植体，通过诱导愈伤组织与体细胞胚诱导获得体细胞胚，使所述体细胞胚萌发为带有根系的幼苗的步骤。利用本发明的方法可实现多花黄精的工厂化育苗，加快分子育种时代的推进。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物组织培养领域，尤其涉及一种繁殖多花黄精的方法。
背景技术
目前，多花黄精(Polygonatum cyrtonema)的繁殖方法主要包括无性繁殖和有性繁殖两种，即根状茎繁殖和种子繁殖。然而，种子繁殖存在发芽率低、育苗周期长等问题。因此，在目前的人工栽培中，主要依赖根状茎的进行无性繁殖，但该方法也存在一些缺点。例如，根状茎用量大以及在催芽过程中常因伤口受微生物感染，导致其在长出新芽之前就已经腐烂，从而造成巨大的经济损失。然而，随着多花黄精现代药理学的深入研究，多花黄精广泛应用于食品、医药、化妆品等行业中，市场需求进一步加大。在市场需求增大以及存在诸多育苗缺陷的大环境下，传统中草药种植行业的发展面临着极大的挑战。
植物体细胞可以在外源植物生长调节剂(PGRs)的诱导下，通过体细胞胚发生实现基因的重新编程并分化为体细胞胚。通过这一生物学过程获得的再生植株存在数量多、遗传特性相对稳定和变异系数低等诸多效益。就目前作物遗传改良而言，体细胞胚是较其他材料相对容易接受外源基因的靶材料，这在多项研究中均已得到证实。迄今为止，体细胞胚在多种植物的离体再生研究中得到报导，但是目前关于多花黄精体细胞胚发生体系的建立尚未有报导的案例。
发明内容
本发明针对目前多花黄精组培中存在的根状茎用量大且催芽过程中常因伤口感染导致长出新芽之前就已经腐烂的问题，通过利用幼胚作为外植体，构建了一种优质、高效的再生体系，利用体细胞胚进行多花黄精组培苗的繁育。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种繁殖多花黄精的方法，所述方法包括以多花黄精的幼胚作为外植体，通过诱导愈伤组织与体细胞胚诱导获得体细胞胚，使所述体细胞胚萌发为带有根系的幼苗的步骤。
上述方法中，所述幼胚为花期结束后50～60天内的幼胚。
上述方法中，所述体细胞胚为球形胚时期的体细胞胚。
上述方法中，所述诱导愈伤组织所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：1.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的2,4-D。
上述方法中，所述诱导愈伤组织在温度25±1℃的黑暗条件下培养，具体可培养30天。
上述方法中，所述体细胞胚诱导所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：1.0mg/L的6-BA和1.0mg/L的2,4-D。
上述方法中，所述体细胞胚诱导在温度25±1℃的黑暗条件下培养，具体可培养30天。
上述方法中，所述体细胞胚萌发所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：2.0mg/L的6-BA和1.0mg/L的NAA。
上述方法中，所述体细胞胚萌发在温度25±1℃、光照强度2000Lux，光照时间为14h/d的条件下培养，具体可培养40天。
上述方法中，所述诱导愈伤组织所用的培养基、所述体细胞胚诱导所用的培养基和所述体细胞胚萌发所用的培养基均为向MS基本培养基中加入蔗糖、凝固剂和植物生长调节剂得到的固体培养基。
上述方法中，所述方法还包括如下步骤：将所述带有根系的幼苗进行壮苗培养后炼苗移栽。
上述方法中，所述壮苗培养所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：0.5mg/L的IAA和1.0mg/L的IBA。
上述方法中，所述壮苗培养在温度25±1℃、光照强度2000Lux，光照时间为14h/d的条件下培养，具体可培养20天。
上述方法中，所述壮苗培养所用的培养基为向MS基本培养基中加入蔗糖、凝固剂和植物生长调节剂得到的固体培养基。
上述方法中，所有的培养基中凝固剂为琼脂。
上述方法中，所有的培养基中蔗糖的含量均为30g/L，琼脂的含量均为7g/L，所有的培养基的pH值均为6.1±0.1。
上述方法中，所述外植体需经过消毒。
本发明还提供繁殖多花黄精的组合物，所述组合物由所述的诱导愈伤组织所用的培养基、体细胞胚诱导所用的培养基、体细胞胚萌发所用的培养基和所述的壮苗培养所用的培养基组成。
本发明以多花黄精未成熟幼胚作为外植体，构建了一项关于多花黄精体细胞胚的再生体系。这个体系的建立将作为体细胞胚发生的首次报道，并填补这一技术性空白，为多花黄精商业化育苗、遗传改良奠定提供了技术支撑。
附图说明
图1为本发明实施例1中幼胚接种到PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上0天时的照片。
图2为本发明实施例1中幼胚接种到PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上20天时的照片。
图3为本发明实施例1中幼胚接种到PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上30天时的照片。
图4为本发明实施例1中显微镜下的愈伤组织照片。
图5为本发明实施例1中显微镜下的愈伤组织中球形胚的照片。
图6为本发明实施例1中显微镜下的愈伤组织中心形胚的照片。
图7为本发明实施例1中显微镜下的愈伤组织中鱼雷形胚的照片。
图8为本发明实施例1中显微镜下的愈伤组织中子叶形胚的照片。
图9为本发明实施例1中体细胞胚-愈伤组织嵌合体上的体细胞胚萌发后仅叶发生的异常现象的照片。
图10为本发明实施例1中体细胞胚-愈伤组织嵌合体上的体细胞胚萌发后根叶同步发生的正常现象的照片。
图11为本发明实施例1中体细胞胚(接种时发育阶段为球形胚)接种到C-3的体细胞胚萌发培养基上培养1周的照片。
图12为本发明实施例1中体细胞胚(接种时发育阶段为球形胚)接种到C-3的体细胞胚萌发培养基上培养20天的照片。
图13为本发明实施例1中体细胞胚(接种时发育阶段为球形胚)接种到C-3的体细胞胚萌发培养基上培养40天的照片。
图14为本发明实施例1中体细胞胚(接种时发育阶段为球形胚)接种到C-3的体细胞胚萌发培养基和对照MS基础培养基上培养30天的萌发率统计结果，其中**代表显著性分析结果为P<0.01。
图15为本发明实施例1中壮苗培养20天的照片。其中，图15的A为整个培养瓶的侧面照片，图15的B为下半个培养瓶的侧面照片，图15的C为培养瓶的底面照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的所有培养基均按照常规方法配置，且经过116℃高压蒸汽灭菌30分钟，pH值使用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节至6.1±0.1。基质需经过121℃条件下灭菌20分钟。所涉及培养皿均为一次性无菌培养皿。
下述实施例中所用培养基、植物激素、琼脂均购于索莱宝生物科技有限公司。培养基所用植物激素缩写与全名对照表见表1。
表1所用植物激素缩写与全名对照表
| 缩写 | 全名 |
| 6-BA | 6-苄氨基腺嘌呤 |
| NAA | 萘乙酸 |
| 2,4-D | 2,4-二氯苯氧乙酸 |
| IBA | 吲哚丁酸 |
下述实施例中的多花黄精采集自湖南省怀化市洪江市雪峰镇桐溪村，采集时间：2023年7月15日。
实施例1
多花黄精组培方法具体如下：
S1、采集花期结束后50～60天内的未成熟果实，消毒、剥取幼胚
S1-1、采集花期结束后50～60天内的未成熟果实，用5％的碱性洗涤剂(立白洗洁精)搓洗5分钟，自来水洗净洗涤剂残留，在自然条件沥干果实表面残留的自来水。
S1-2、消毒：将果实转移至超净工作台，使用75％酒精消毒30秒，无菌水冲洗2-3次，然后使用0.1％HgCl2消毒30分钟，无菌水冲洗4-5次。
S1-3、消毒完成后，在超净工作台中，将果实中的幼胚分离出来，分离的幼胚应注意保湿，并在30分钟内接种愈伤组织诱导培养基中。
S2、愈伤组织诱导
以MS培养基作为基础培养基，在此基础培养基中添加不同浓度的6-BA(0.2mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L)和2,4-D(0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L)，进行了2因素3水平正交实验。6-BA和2,4-D添加后的浓度见表1。以PGRs组合为A-1的愈伤组织诱导培养基为例(其它PGRs组合的愈伤组织诱导培养基以此类推)：
PGRs组合为A-1的愈伤组织诱导培养基为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为0.2mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。其配制方法(以1L为例)可为：以水溶解4.74g的MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，LotNo.104P031，Cat#M8526)、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加6-BA和2,4-D，加水定容至1L，使得在PGRs组合为A-1的愈伤组织诱导培养基中的6-BA含量为0.2mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到PGRs组合为A-1的愈伤组织诱导培养基。
将步骤S1获得的幼胚在无菌条件下分别接种于上述9种不同PGRs组合的愈伤组织诱导培养基上。
设置3个重复，每重复每种PGRs组合的愈伤组织诱导培养基5个培养皿，每培养皿接种9个幼胚。置于25±1℃条件下暗培养30天。
接种30天时统计愈伤组织总质量和愈伤组织诱导率(每种培养基每重复45个幼胚诱导的愈伤组织总质量和愈伤组织诱导率)。
诱导率＝愈伤组织数/外植体数
表1愈伤组织诱导培养基中的植物生长调节剂(PGRs)浓度及其对愈伤组织总质量和愈伤组织诱导率的影响
| PGRs组合 | 6-BA(mg/L) | 2,4-D(mg/L) | 总质量(g) | 诱导率(％) |
| A-1 | 0.2 | 0.5 | 4.63±0.67df | 100.00±0.00a |
| A-2 | 0.2 | 1 | 4.60±0.95df | 100.00±0.00a |
| A-3 | 0.2 | 1.5 | 7.27±0.80c | 100.00±0.00a |
| A-4 | 1 | 0.5 | 15.80±1.32a | 100.00±0.00a |
| A-5 | 1 | 1 | 12.53±1.21b | 100.00±0.00a |
| A-6 | 1 | 1.5 | 6.10±0.87cd | 100.00±0.00a |
| A-7 | 1.5 | 0.5 | 5.73±1.40cdf | 100.00±0.00a |
| A-8 | 1.5 | 1 | 3.90±0.30f | 100.00±0.00a |
| A-9 | 1.5 | 1.5 | 4.60±0.26df | 100.00±0.00a |
注：数据分析采用spss软件，Waller-Duncan(W)a,b,c检验显著性，同列数据后不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。
结果见表1，9种不同PGRs组合的愈伤组织诱导培养基的诱导率均达100％，其中接种到PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基(即以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为1.0mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基)上的愈伤组织总质量最重，显著高于其它愈伤组织诱导培养基上的愈伤组织总质量，诱导效果最佳。
幼胚接种到PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上0天时的照片见图1，接种到PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上20天时的照片见图2，接种到PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上30天时的照片见图3。
选择PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上的愈伤组织继续后续试验。
S3、体细胞胚诱导
以MS培养基作为基础培养基，在此基础培养基中添加不同浓度的6-BA(0.2mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L)和2,4-D(1.0mg/L，1.5mg/L，2.0mg/L)，进行了2因素3水平正交实验。6-BA和2,4-D添加后的浓度见表2。以PGRs组合为B-1的体细胞胚诱导培养基为例(其它PGRs组合的体细胞胚诱导培养基以此类推)：
PGRs组合为B-1的体细胞胚诱导培养基为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为0.2mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。其配制方法(以1L为例)可为：以水溶解4.74g的MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，LotNo.104P031，Cat#M8526)、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加6-BA和2,4-D，加水定容至1L，使得在PGRs组合为B-1的体细胞胚诱导培养基中的6-BA含量为0.2mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到PGRs组合为B-1的体细胞胚诱导培养基。
将步骤S2获得的PGRs组合为A-4的愈伤组织诱导培养基上的愈伤组织在无菌条件下分别接种于上述9种不同PGRs组合的体细胞胚诱导培养基上。
设置3个重复，每重复每种PGRs组合的体细胞胚诱导培养基45个培养皿，每培养皿接种1个愈伤组织。置于25±1℃条件下暗培养30天。
显微镜下，愈伤组织(见图4)上的体细胞胚随着时间增长，按照球形胚(见图5)——心形胚(见图6)——鱼雷形胚(见图7)——子叶形胚(见图8)的规律发育，先后得到体细胞胚为不同发育阶段的体细胞胚-愈伤组织嵌合体。在接种第30天时，统计体细胞胚诱导率，因球形胚是最早的体细胞胚，体细胞胚的诱导率是按照球形胚诱导率算的。
体细胞胚的诱导率＝含有球形胚的材料/愈伤组织数。
表2体细胞胚诱导培养基中的植物生长调节剂(PGRs)浓度及其对体细胞胚诱导率的影响
注：数据分析采用spss软件，Waller-Duncan(W)a,b,c检验显著性，同列数据后不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。
结果见表2，9种不同PGRs组合的体细胞胚诱导培养基的中，接种到PGRs组合为B-4的体细胞胚诱导培养基(即以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为1.0mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基)上的体细胞胚诱导率为97.78％±3.85％，效果显著优于其它体细胞胚诱导培养基。
选择PGRs组合为B-4的体细胞胚诱导培养基上的带有体细胞胚的愈伤组织继续后续试验。
S4、体细胞胚萌发
S4.1体细胞胚萌发预试验
以MS培养基作为基础培养基，在此基础培养基中添加不同浓度的6-BA(2.0mg/L，3.0mg/L，4.0mg/L)和NAA(0.2mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L)，进行了2因素3水平正交实验。6-BA和NAA添加后的浓度见表3。以PGRs组合为C-1的体细胞胚萌发培养基为例(其它PGRs组合的体细胞胚萌发培养基以此类推)：
PGRs组合为C-1的体细胞胚萌发培养基为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为0.2mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。其配制方法(以1L为例)可为：以水溶解4.74g的MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，LotNo.104P031，Cat#M8526)、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加6-BA和NAA，加水定容至1L，使得在PGRs组合为C-1的体细胞胚萌发培养基中的6-BA含量为2.0mg/L、NAA的含量为0.2mg/L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到PGRs组合为C-1的体细胞胚萌发培养基。
将步骤S3获得的PGRs组合为B-4的体细胞胚诱导培养基上的体细胞胚-愈伤组织嵌合体在无菌条件下分别接种于上述9种不同PGRs组合的体细胞胚萌发培养基上。
设置3个重复，每重复每种PGRs组合的体细胞胚萌发培养基30个培养皿，每培养皿接种1个体细胞胚-愈伤组织嵌合体。置于温度25±1℃、光照强度2000Lux，光照时间为14h/d，的条件下培养30天，此时体细胞胚-愈伤组织嵌合体中的体细胞胚萌发后可观察到仅叶发生的异常现象(见图9)和根叶同步发生的正常现象(见图10)，异常萌发率率(正常萌发率＝仅叶发生数/30)和正常萌发率(异常萌发率＝根叶同步发生数/30)。
表3体细胞胚萌发培养基中的植物生长调节剂(PGRs)浓度及其对叶发生率和根叶同步发生率的影响
注：数据分析采用spss软件，Waller-Duncan(W)a,b,c检验显著性，同列数据后不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。
结果见表3，9种不同PGRs组合的体细胞胚萌发培养基的中，接种到PGRs组合为C-4的体细胞胚萌发培养基(即以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基)上的体细胞胚-愈伤组织嵌合体的正常萌发率(正常现象)显著高于其它体细胞胚萌发培养基，达73.33％±6.67％，而其上的异常萌发率(异常现象)仅为26.67％±6.67％。
S4.2体细胞胚萌发
以PGRs组合为C-3的体细胞胚萌发培养基(即以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基)作为本发明选择的体细胞胚萌发培养基。其配制方法(以1L为例)可为：以水溶解4.74g的MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，LotNo.104P031，Cat#M8526)、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加6-BA和NAA，加水定容至1L，使得在PGRs组合为C-3的体细胞胚萌发培养基中的6-BA含量为2.0mg/L、NAA的含量为1.0mg/L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到PGRs组合为C-3的体细胞胚萌发培养基。
以不加植物生长调节剂(PGRs)的MS基本培养基中添加糖源(蔗糖)和凝固剂(琼脂粉)为空白对照。其配制方法(以1L为例)可为：以水溶解4.74g的MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，LotNo.104P031，Cat#M8526)、30g蔗糖和7g琼脂粉，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到空白对照培养基。
设置3个重复，每重复PGRs组合为C-3的体细胞胚萌发培养基或空白对照培养基3个培养皿，每培养皿接种10个球形胚(从步骤S3获得的PGRs组合为B-4的体细胞胚诱导培养基上的体细胞胚-愈伤组织嵌合体中切取的发育阶段为球形胚的体细胞胚)。
置于温度25±1℃、光照强度2000Lux，光照时间为14h/d，的条件下培养。培养一周后照片见图11；接种后第20天，开始出现不完整的根茎和叶片结构，并出现微型根状茎，照片见图12；培养第40天，发育成幼苗，照片见图13。接种第30天统计萌发率，结果见图14，PGRs组合为C-3的体细胞胚萌发培养基上球形胚的正常萌发率为82.22％(萌发率＝根叶同步发生数/30)，显著高于空白对照培养基上的萌发率(31.11％)。
S5、壮苗与移栽
以MS基本培养基为基础培养基，IAA的含量为0.5mg/L、IBA的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基作为本发明的壮苗培养基。其配制方法(以1L为例)可为：以水溶解4.74g的MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，LotNo.104P031，Cat#M8526)、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加IBA，调pH值至6.1±0.1，加水定容至1L，使得在壮苗培养基中IBA的含量为1.0mg/L，装入容量为1L的螺口试剂瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后，待其冷却40分钟后，在超净工作台中加入无菌IAA，混匀后，使得在壮苗培养基中IAA的含量为0.5mg/L分装至无菌培养瓶，得到壮苗培养基。
每个培养瓶接种S4中得到的PGRs组合为C-3的体细胞胚萌发培养基上的体细胞胚培育40天后得到的带有根系的幼苗一株，共接种30株幼苗。
进行为期20天的壮苗培养，培养在温度25±1℃、光照强度2000Lux，光照时间为14h/d的条件下培养，培养20天时照片见图15。培养结束后，在培养室内打开培养瓶盖，进行为期3天的适应性培养(即炼苗)。随后，取出幼苗，用ddH2O清洗掉培养基。为了防止幼苗脱水，每株幼苗仅保留一片叶子，然后移栽至配方为营养土：珍珠盐＝3:1(v/v)的育苗基质中。移栽一个月后，30株苗成活28株，成活率为93.33％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、含量和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种繁殖多花黄精的方法，其特征在于，所述方法包括以多花黄精的幼胚作为外植体，通过诱导愈伤组织与体细胞胚诱导获得体细胞胚，使所述体细胞胚萌发为带有根系的幼苗的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述幼胚为花期结束后50～60天内的幼胚。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述体细胞胚为球形胚时期的体细胞胚。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述诱导愈伤组织所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：1.0mg/L的6-BA和0.5mg/L的2,4-D；
所述体细胞胚诱导所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：1.0mg/L的6-BA和1.0mg/L的2,4-D；
所述体细胞胚萌发所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：2.0mg/L的6-BA和1.0mg/L的NAA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述诱导愈伤组织所用的培养基、所述体细胞胚诱导所用的培养基和所述体细胞胚萌发所用的培养基均为向MS基本培养基加入中蔗糖、凝固剂和植物生长调节剂得到的固体培养基。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述诱导愈伤组织在温度25±1℃的黑暗条件下培养；所述体细胞胚诱导在温度25±1℃的黑暗条件下培养；所述体细胞胚萌发在温度25±1℃、光照强度2000Lux的条件下培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：将所述带有根系的幼苗进行壮苗培养后炼苗移栽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述壮苗培养所用的培养基中植物生长调节剂的种类和含量为：0.5mg/L的IAA和1.0mg/L的IBA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述壮苗培养所用的培养基为向MS基本培养基中加入蔗糖、凝固剂和植物生长调节剂得到的固体培养基。
10.繁殖多花黄精的组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求4中所述的诱导愈伤组织所用的培养基、体细胞胚诱导所用的培养基、体细胞胚萌发所用的培养基和权利要求8中所述的壮苗培养所用的培养基组成。
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