CN108077075B

CN108077075B - 一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法

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Publication number: CN108077075B
Application number: CN201711407323.2A
Authority: CN
Inventors: 王昱淇; 马剑平; 满多清; 刘克彪; 高松涛
Original assignee: Gansu Desert Control Research Institute
Current assignee: Gansu Desert Control Research Institute
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108077075A

Abstract

本发明涉及一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法，属于无性繁殖技术领域。本发明通过对种子浸泡和消毒、无菌苗培养、诱导愈伤组织培养、不定芽分化培养和生根培养各条件的设置，得到的霸王柴生根率高、增殖倍数高的霸王柴，解决了霸王柴种子育苗效率低下且易受环境因素影响繁殖慢的难题，该方法简单易行，成本低廉，增殖与生根效率高，适用于工厂化大规模生产。

Description

一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法

技术领域

本发明涉及无性繁殖技术领域，具体涉及一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法。

背景技术

霸王柴为多年生小灌木，耐旱性极强，主要分布于我国西北和内蒙古荒漠地区，是荒漠干旱沙地覆沙地上灌丛植被的主要建群种和优势种之一，霸王柴对环境条件有很好的适应性，耐旱、耐寒、耐贫瘠，而且根系发达，对防沙固沙、防止水土流失、改善环境具有十分重要的作用，根可入药，也是天然的优良牧草，其枝条和嫩叶是荒漠区骆驼和羊的食物来源。因此，该植物不仅在改善环境方面具有很好的生态效益，而且也具有良好的经济效益。

由于生长的外界环境条件恶劣，霸王柴种子在自然条件下难以萌发，所以在霸王柴母株周围很难发现生长的实生苗，是干旱荒漠区面临濒危灭绝的物种之一。霸王柴通常采用种子播种育苗的方法进行苗木繁殖，但这种有性繁殖方法虽然可在较短时间内获得大量苗木，但在种子繁殖过程中容易受外界环境、人为操作、化学药品等不良因素的影响，母本植物的优良的遗传性状容易发生变异、分离，影响霸王柴优良种质资源的保存。而常用普通的无性繁殖方法(扦插繁殖)，霸王柴难以生根，成活率低；且常规主要采用霸王柴无菌苗的叶片进行愈伤组织诱导，而将无菌苗的茎秆及下胚轴丢弃，原料浪费严重。现有技术并没有报道一种高效扩繁霸王柴的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法。经本发明方法对霸王柴进行培养，能够获得生根率高、增殖倍数高的霸王柴，解决了霸王柴种子育苗效率低下且易受环境因素影响繁殖慢的难题，该方法简单易行，成本低廉，增殖与生根效率高，适用于工厂化大规模生产。

本发明提供了一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法，包括以下步骤：

1)采用GA₃溶液和水对霸王柴种子依次进行浸泡，所述浸泡重复2次，得到浸泡种子；

2)将步骤1)得到的浸泡种子在体积浓度为75％的乙醇溶液中进行消毒，所述消毒的时间为40s，得到消毒种子；

3)将步骤2)得到的消毒种子在无菌苗培养基中进行无菌苗培养15～20d，得到无菌苗；所述无菌苗培养基以改良MS培养基为基准，包括0.3mg/L的GA₃、5g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；

4)由所述步骤3)得到的无菌苗获得外植体，将所述外植体在诱导愈伤组织培养基上进行诱导愈伤培养25～30d，得到愈伤组织；所述外植体包括茎段、叶片和/或胚轴；所述诱导愈伤培养基以改良MS培养基为基准，包括0.1～0.2mg/L的6-BA、0.3～0.5mg/L的NAA和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；

5)将所述步骤4)得到的愈伤组织在第一不定芽分化培养基中进行第一分化培养6～8d，再将所述第一分化培养产物在第二不定芽分化培养基中进行第二分化培养25～30d，得到不定芽；所述第一不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；所述第二不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；

6)将所述步骤5)得到的不定芽在生根培养基中进行生根培养，得到霸王柴植株；所述生根培养基以改良MS培养基为基准，包括0.3mg/L的IBA和10g/L的蔗糖；

所述改良MS培养基为无机盐减少1/3的MS培养基。

优选的是，步骤1)所述GA₃溶液中GA₃的质量浓度为100mg/L；所述水的温度为40℃。

优选的是，步骤1)采用GA₃溶液对霸王柴种子进行浸泡的时间为2h。

优选的是，步骤2)采用水对霸王柴种子进行浸泡的时间为1h。

优选的是，步骤2)所述消毒后，还包括冲洗种子的步骤，所述冲洗的次数为7～8次。

优选的是，步骤3)所述无菌苗培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d，暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度为1500～1800lx、光照时间为12h/d。

优选的是，步骤4)所述诱导愈伤培养包括依次进行的暗培养、振荡培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d，暗培养后进行振荡培养，所述振荡培养为25℃、20r/min培养7d；振荡培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。

优选的是，步骤5)所述第一分化培养为暗培养，所述第一分化培养的时间为7d。

优选的是，步骤5)所述第二分化培养为光照培养，所述光照培养的条件为：25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。

优选的是，步骤6)所述生根培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为4d，暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度2000～2200lx、光照时间14h/d。

本发明提供了一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法。本发明方法接种前用GA₃溶液与水交替浸泡对霸王柴种子进行短期浸泡，能够刺激使种子快速生长为无菌苗，且萌发率高；接着在愈伤组织培养阶段采用液体培养基培养，愈伤组织诱导率均达到90％以上；不定芽分化先采用无糖的第一分化培养基进行第一分化培养，将暗培养和无糖缺营养处理进行结合，随后转入含糖的第二分化培养基中进行第二分化培养，大大提高了霸王柴不定芽增殖与生根的速度和增殖倍数；最后，本发明生根培养采用低糖的的生根培养基，保证试管苗生长质量的情况下能使不定芽迅速生根，生根率达到100％。本发明提供的增殖培养无性系方法霸王柴种子萌发率高，愈伤组织诱导率高，且生根率高，实现了霸王柴的高效扩繁。

具体实施方式

所述改良MS培养基为无机盐减少1/3的MS培养基。

本发明采用GA₃溶液和水对霸王柴种子依次进行浸泡，所述浸泡重复2次，得到浸泡种子。本发明对所述霸王柴种子的来源没有特殊的规定，采用本领域技术人员熟知的霸王柴种子，在本发明中，所述霸王柴种子优选饱满、大小一致、没有破损。本发明在进行上述浸泡操作前，优选用水浸泡种子3～5h，使种子充分吸水膨胀，所述水优选为蒸馏水。在本发明中，所述GA₃溶液中GA₃的质量浓度为100mg/L；所述GA₃溶液浸泡的时间优选为2h；在本发明中，所述水的温度为40℃，所述水浸泡的时间优选为1h。在本发明中，GA₃溶液和水依次浸泡重复的次数优选为2次。在本发明中，所述浸泡条件的设置能够使种子萌发快，且提高种子萌发率。在本发明中，所述浸泡过程优选进行搅拌，本发明对所述搅拌的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规搅拌方法即可，如采用玻璃棒不断搅拌。

得到浸泡种子后，本发明将浸泡种子在体积浓度为75％的乙醇溶液中进行消毒，所述消毒的时间为40s，得到消毒种子。本发明消毒处理使种子接种后不会对培养基产生污染，避免对培养基的浪费以及制作培养基过程中人力资源的浪费。由于乙醇具有易挥发的特点，排出后不会对土壤及水源等环境资源造成污染。在本发明中，所述消毒过程中优选进行搅拌，本发明对所述搅拌的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的搅拌方法即可，如采用玻璃棒对乙醇溶液中的种子进行搅拌。

在本发明中，所述消毒后，还包括冲洗种子的步骤，所述冲洗的次数为7～8次。本发明从乙醇溶液中取出种子后，优选用水对种子进行冲洗，所述冲洗的次数优选为7～8次。本发明所述冲洗的过程优选也进行搅拌，所述搅拌的方式与消毒过程中的搅拌相同。冲洗后，本发明优选将吸干种子表面的水渍，本发明对所述吸干的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可，如采用滤纸吸干的方法。

得到消毒种子后，本发明将消毒种子在无菌苗培养基中进行无菌苗培养15～20d，得到无菌苗；所述无菌苗培养基以改良MS培养基为基准，包括0.3mg/L的GA₃、5g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0。在本发明中，所述无菌苗培养基配制完成后进行灭菌操作，灭菌后本发明优选倒掉培容器内侧或上方冷却后凝结的水分，以减小接种后的污染率。在本发明中，所述无菌苗培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d。暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度为1500～1800lx、光照时间为12h/d。在本发明中，进行2d暗培养，结合之前种子浸泡消毒处理，种子5d即可萌发，且萌发率为100％。本发明经15～20d的无菌苗培养后，得到的无菌苗长度为5～8cm，本发明优选采用此长度的无菌苗进行后续处理。

得到无菌苗后，本发明由所述无菌苗获得外植体，将所述外植体在诱导愈伤组织培养基上进行诱导愈伤培养25～30d，得到愈伤组织；所述外植体包括茎段、叶片和/或胚轴；所述诱导愈伤培养基以改良MS培养基为基准，包括0.1～0.2mg/L的6-BA、0.3～0.5mg/L的NAA和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0。本发明所述茎段和胚轴的长度优选独立为0.5cm；所述叶片优选进行切块，所述切块优选为：切除叶片的边缘后，将叶片切成0.5cm×0.5cm大小的方块。当将叶片进行接种时，叶片的正面优选朝上放置。在本发明中，所述外植体放于培养基中后，优选轻轻按压使外植体与培养基充分接触。

在本发明中，当所述外植体选用茎段时，所述诱导愈伤组织培养基优选以改良MS培养基为基准，包括0.2mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；当所述外植体选用叶片时，所述诱导愈伤组织培养基优选以改良MS培养基为基准，包括0.1mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；当所述外植体选用胚轴时，所述诱导愈伤组织培养基优选以改良MS培养基为基准，包括0.1mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0。

在本发明中，所述诱导愈伤培养包括依次进行的暗培养、振荡培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d。所述暗培养后进行振荡培养，所述振荡培养为25℃、20r/min培养7d；所述振荡培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。在本发明中，振荡培养时所用的培养基中不加琼脂，即为液体培养基，液体培养基采用振荡培养有利于愈伤组织的快速诱导。

得到愈伤组织后，本发明将愈伤组织在第一不定芽分化培养基中进行第一分化培养6～8d，再将所述第一分化培养产物在第二不定芽分化培养基中进行第二分化培养25～30d，得到不定芽；所述第一不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8-6.0，在本发明中，所述第一不定芽分化培养基为无糖培养基；所述第二不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0。在本发明中，所述第一分化培养基和第二分化培养基配制完成后优选进行灭菌操作，灭菌后使用；所述灭菌后，本发明优选倒掉培容器内侧或上方冷却后凝结的水分，以减小接种后的污染率。

在本发明中，所述第一分化培养为暗培养，所述暗培养的时间为7d。在本发明中，所述第二分化培养为光照培养，所述光照培养的条件为：25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。本发明将愈伤组织在无糖培养基中进行暗培养，使愈伤组织经过黑暗结合缺营养饥饿处理，再转接至含糖培养基进行正常培养，能够使得不定芽迅速增殖，30d增殖倍数达40以上。

得到不定芽后，本发明将不定芽在生根培养基中进行生根培养，得到霸王柴植株；所述生根培养基以改良MS培养基为基准，包括0.3mg/L的IBA和10g/L的蔗糖。在本发明中，所述生根培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为4d。暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度2000～2200lx、光照时间14h/d。在本发明中，所述生根培养用不定芽优选带有2～3个茎节，长度优选为2～3cm。在本发明中，生根培养中暗培养的设置使得不定芽最早在6d时生根，且主根粗壮、须根较多，根苗颜色嫩绿，生长旺盛。本发明在生根培养后，优选进行炼苗和移栽，本发明对所述炼苗和移栽的条件没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的炼苗、移栽方法即可。

在本发明中，上述技术方案所述改良MS培养基为无机盐(即大量元素)减少1/3的MS培养基。

所述改良MS培养基具体包括：

1)大量元素：硝酸铵1100mg/L、硝酸钾1266.7mg/L、磷酸二氢钾113.3mg/L、氯化钙293.3mg/L、硫酸镁246.7mg/L(以上试剂分别溶解后混合定容至1000mL母液，每制作1L培养基吸取50ml母液)；

2)微量元素：硫酸锰22.30mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化钾0.83mg/L(以上试剂分别溶解后混合定容至500mL母液，每制作1L培养基吸取5ml母液)；

3)铁盐：Na₂—EDTA37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L(同2)；

4)有机成分：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.4mg/L、甘氨酸2.0mg/L(同2)；

在本发明中，所述改良MS培养基配制完成后进行灭菌操作，灭菌后本发明优选倒掉培容器内侧或上方冷却后凝结的水分，以减小接种后的污染率。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

挑选当年采收的饱满、大小一致、没有破损的霸王柴的种子，用蒸馏水中浸泡5h使种子充分吸水膨胀，之后用浓度100mg/L的GA₃溶液浸泡2h，然后用40℃温水浸泡1h，之后再重复GA₃与40℃温水浸泡的操作2次，浸泡期间用玻璃棒不断搅动，之后倒掉温水将种子放在超净工作台上进行消毒处理。

种子消毒采用75％的乙醇浸泡40s(常规方法采用乙醇结合氯化汞消毒，氯化汞不能重复利用，处理后对水源、土壤等环境资源造成很大污染)，浸泡期间用已灭菌的玻璃棒不断搅动，40s后迅速倒掉乙醇，用无菌水冲洗8次；冲洗期间用已灭菌的玻璃棒不断搅动，之后将种子放置在铺有灭菌滤纸的培养皿中，吸干种子表面的水渍，得到消毒后的种子。

将吸干水渍处理完成的霸王柴消毒后的种子接种到无菌苗培养基上，所述无菌苗培养基以改良MS培养基为基准，包括0.3mg/L的GA₃、5g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0，每60mL培养基接种5粒种子，接种前倒掉培养基经高温灭菌后冷却凝结的水分，减小接种后的污染率。

接种后置于黑暗条件下培养2d，之后在温度25℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d的培养室培养。

生长情况：由于之前种子消毒处理前进行浸泡，充分吸胀吸水，通过2d的黑暗环境培养后，种子5d即可萌发，萌发率为100％(常规播种育苗种子萌发率为81％)。15d左右，无菌苗长至5～8cm，剪取其子叶、茎段、胚轴用于愈伤组织诱导。

分别剪取生长15～20d无菌苗的茎段、叶片、胚轴作为诱导愈伤组织的材料，其中茎段和胚轴剪至0.5cm，叶片切除四周边缘后剪成0.5×0.5cm大小的方块，以便于愈伤组织充分诱导，正面朝上平铺接种到诱导愈伤组织培养基中，之后用镊子轻轻按压，以便外植体和培养基充分接触，每100mL培养基接种10个外植体茎段。

当外植体为茎段时，诱导愈伤组织培养基配方为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA0.5mg/L，当外植体为叶片时，诱导愈伤组织培养基配方为MS+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.3mg/L，当外植体为胚轴时，诱导愈伤组织培养基配方为MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L，培养基中均为不加琼脂，为液体培养基，附加蔗糖30g/L、培养基的pH值为5.8～6.0。

接种后置于黑暗条件下培养2d，之后放置在恒温震荡培养箱中，温度25℃、震荡频率20r/min，震荡培养7d后进行光照培养，温度25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。

生长情况：接种后10d三种外植体表面产生不规则突起，25d左右长出黄白色结构疏松的愈伤组织，茎段、叶片、胚轴愈伤组织诱导率均达到90％以上。

得到愈伤组织后，将愈伤组织在第一不定芽分化培养基中进行第一分化培养6～8d，再在第二不定芽分化培养基中进行第二分化培养25～30d，得到不定芽。所述第一不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；所述第二不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0。每次接种后，轻轻按压，使其充分接触，每60mL培养基接种2块愈伤组织，所述第一分化培养为暗培养，所述暗培养的时间为7d，所述第二分化培养为光照培养，所述光照培养的条件为：25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。经过黑暗结合缺营养饥饿处理，转接至含糖培养基正常培养后，不定芽迅速增殖，30d左右增殖倍数达40以上。接种前倒掉培养基经高温灭菌后冷却凝结的水分，减小接种后的污染率。

将得到的生长25d左右的不定芽(带有2～3个茎结、长2～3cm)转接入生根培养基中进行生根培养，得到霸王柴植株；所述所述生根培养基以改良MS培养基为基准，包括0.3mg/L的IBA和10g/L的蔗糖。培养基与激素组合接种前倒掉培养基经高温灭菌后冷却凝结的水分，减小接种后的污染率。首先，置于黑暗条件下培养4d，之后置于温度25℃、光照强度2000～2200lx、光照时间14h/d的培养室进行光照培养，不定芽生根率为100％。由于接种初期进行了暗培养，不定芽最早6d开始生根，且主根粗壮、须根较多，根苗颜色嫩绿、生长旺盛，有利于出瓶炼苗移栽。

本发明利用荒漠植物霸王柴整株无菌苗进行离体培养诱导无性系，较普通的无性扦插方法相比，在保证40倍左右扩繁系数的条件下，实现霸王柴试管苗全部生根。培养接种前用浓度100mg/L的GA3溶液与40℃温水交替的方法对霸王柴种子进行短期浸泡刺激使种子快速生长为无菌苗；采用液体培养基恒温震荡培养结合诱导愈伤组织培养基，使无菌苗的茎段、叶片、胚轴均能诱导产生大量愈伤组织，没有造成无菌苗的浪费(大多数植物只有叶片可以分化出愈伤组织)；另外，不定芽增殖先采用无糖缺营养结合暗处理，最后转入含糖培养基结合光照的方法，大大提高了霸王柴不定芽增殖速度和增殖倍数；生根培养采用暗处理结合低糖培养基，保证试管苗生长质量的情况下生根率达到100％。本发明采用无菌培养的方法，建立优质的霸王柴无菌培养体系，整个繁殖过程从愈伤组织至生根仅需60d左右，大大提高了霸王柴的成苗速度，对其植株的规模化、工厂化生产、扩繁具有重要作用，可为我国西北干旱荒漠区盐渍化土地改良及荒漠区植树造林源源不断地提供优质苗木。

实施例2

挑选当年采收的饱满、大小一致、没有破损的霸王柴种子，用蒸馏水中浸泡4h之后用浓度100mg/L的GA3溶液浸泡2h，然后用40℃温水浸泡1h，之后再重复GA3与40℃温水浸泡操作2次，浸泡期间用玻璃棒不断搅动，之后倒掉温水将种子放在超净工作台上进行消毒处理。

种子消毒只采用75％的乙醇浸泡40s，浸泡期间用已灭菌的玻璃棒不断搅动，40s后迅速倒掉乙醇，用无菌水冲洗7次；冲洗期间用已灭菌的玻璃棒不断搅动，之后将种子放置在铺有灭菌滤纸的培养皿中，吸干种子表面的水渍，得到消毒后的种子。

将吸干水渍处理完成的霸王柴种子接种到无菌苗培养基上，所述无菌苗培养基以改良MS培养基为基准，包括0.3mg/L的GA3、5g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0，每瓶培养基接种5粒种子，接种后置于黑暗条件下培养2d，之后在温度25℃、光照强度1800lx、光照时间12h/d的培养室培养。

由于之前种子消毒处理前进行浸泡，充分吸胀吸水，通过2d的黑暗环境培养后，种子5d即可萌发，萌发率为100％(常规播种育苗种子萌发率为81％)。15d左右，无菌苗长至5～8cm，即可剪取其子叶、茎段、胚轴用于愈伤组织诱导。

分别剪取生长15～20d无菌苗的茎段、叶片、胚轴作为诱导愈伤组织的材料，其中茎段和胚轴剪至0.5cm，叶片切除四周边缘后剪成0.5×0.5cm大小的方块，以便于愈伤组织充分诱导，正面朝上平铺接种到相应的培养基中，之后用镊子轻轻按压，以便外植体和培养基充分接触，每60mL培养基接种10个外植体茎段。

当外植体为茎段时，诱导愈伤组织培养基配方为MS+6-BA0.05mg/L+NAA 0.3mg/L，当外植体为叶片时，诱导愈伤组织培养基配方为MS+6-BA0.1mg/L+NAA 0.5mg/L，当外植体为胚轴时，诱导愈伤组织培养基配方为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.4mg/L，培养基中均为不加琼脂，为液体培养基，附加蔗糖30g/L、培养基的pH值为5.8～6.0；不加任何激素的MS培养基为对照。接种后置于黑暗条件下培养2d，之后放置在恒温震荡培养箱中，温度25℃、震荡频率20r/min，震荡培养7d后进入常规培养，温度25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。同时，设置相同组数、激素含量相同的有岛屿上组织培养基中进行培养，培养条件同液体培养基。

接种后10d三种外植体表面产生不规则突起，25d左右长出黄白色结构疏松的愈伤组织，在适宜的培养基中茎段、叶片、胚轴愈伤组织诱导率均达到90％以上。

表1愈伤组织诱导培养基6-BA和NAA添加量

根据表1不同配方进行叶片、茎段、胚轴三种外植体愈伤组织诱导培养，经过25d的培养结果见表2。

表2愈伤组织诱导培养结果

由表2可知，采用固体培养基进行霸王柴愈伤组织诱导时，诱导率最大为采用叶片作为外植体在第4组配方中的诱导，诱导率仅为54.33％。而采用液体培养基进行霸王柴不同外植体诱导，大大提高了诱导率。其中，外植体叶片采用第6组的配方愈伤组织诱导效果最好最好，诱导率为94.36％；茎段采用第10组的配方愈伤组织诱导效果最好最好，诱导率为92.47％；胚轴采用第7组的配方愈伤组织诱导效果最好最好，诱导率为92.13％。

得到愈伤组织后，将愈伤组织在第一不定芽分化培养基中进行第一分化培养6～8d，再在第二不定芽分化培养基中进行第二分化培养25～30d，得到不定芽。所述第一不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；所述第二不定芽分化培养基以改良MS培养基为基准，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0。第一分化培养基为无糖培养基，第二分化培养基为有糖培养基。每次接种后，轻轻按压，使其充分接触，每60mL培养基接种2块愈伤组织，所述第一分化培养为暗培养，所述暗培养的时间为7d，所述第二分化培养为光照培养，所述光照培养的条件为：25±2℃、光照强度1500～1800lx、光照时间14h/d。经过黑暗结合缺营养饥饿处理，转接至含糖培养基正常培养后，不定芽迅速增殖，30d左右增殖倍数达40以上。

表3不定芽分化培养基KT和NAA添加量

将生长良好的愈伤组织转接至表3中1～10组培养基中，经过30d的培养结果见表4。

表4不定芽增殖培养结果

表4中，综合不定芽30d的生长高度、生长情况以及不定芽增殖倍数三个指标进行分析，采用第9组培养基时，30d增殖倍数达到41.26，不定芽长至2.8cm，并且在这组培养基中不定芽增殖速度快，生长健壮，有利于进行后期的根系诱导。而采用其它培养基进行不定芽增殖培养时，效果较差。

将得到的生长25d左右的不定芽(带有2～3个茎结、长2～3cm)转接入附加不同浓度IBA(0.1～0.5mg/L)及蔗糖(10～30g/L)配比的生根培养基上进行生根培养，接种后置于黑暗条件下培养4d，之后置于温度25℃、光照强度2000～2200lx、光照时间14h/d的培养室进行培养。

生根培养中添加不同浓度的吲哚丁酸和蔗糖，如表5所示，配方优化过程如下：

表5生根培养基中IBA和蔗糖添加量

根据表5所述配比进行生根诱导培养，采用同样的培养基配方，接种后分别放置于黑暗条件下暗培养4d和接种后不进行暗培养，结果见表6、7。

表6不同浓度吲哚丁酸(IBA)和蔗糖配比的诱导生根结果(接种后没有

黑暗处理)

表7不同浓度吲哚丁酸(IBA)和蔗糖配比的诱导生根结果(接种后采用

黑暗处理)

由表6、7可知，改良MS培养基中附加不同浓度IBA(0.1～0.5mg/L)及蔗糖(10～30g/L)时，采用黑暗处理后不定芽生根率显著大于不采用黑暗处理的组别，在黑暗处理下，当吲哚丁酸(IBA)的浓度为0.3mg/L时，附加不同的蔗糖浓度，不定芽生根率均达到90％以上，即采用表5中组别5、6、7的激素含量，不定芽生根率分别为97.89％、91.31％、91.67％，且生根后植物长势优于其它组。即在生根阶段适宜进行暗培养处理。

以固定吲哚丁酸浓度为0.3mg/L，对蔗糖添加量进行优化，分组情况见表8。

表8分组及各组分蔗糖添加量

根据表8各配方进行诱导生根培养，结果见表9。

表9不同蔗糖添加量生根培养结果

由表9可知，当蔗糖添加量为10g/L时不定芽生根培养结果最佳，第一次生根时间较早，主根发达，根毛较多，根上部植株长势良好，颜色嫩绿，其生根率可达100.00％。

经过配方优化，当吲哚丁酸添加量为0.3mg/L，蔗糖添加量为10mg/L时，霸王柴的成苗时间为60d左右，与传统培养时间90d左右相比较大大缩短。另外，经60d左右的培养，苗木根系及枝叶迅速生长，可进行室外的炼苗移栽，从而快速实现霸王柴优质种苗的工厂化生产。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用霸王柴无菌苗快速增殖培养无性系的方法，包括以下步骤：

3)将步骤2)得到的消毒种子在无菌苗培养基中进行无菌苗培养15～20d，得到无菌苗；

所述无菌苗培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括0.3mg/L的GA₃、5g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；

4)由所述步骤3)得到的无菌苗获得外植体，将所述外植体在诱导愈伤组织培养基上进行诱导愈伤培养25～30d，得到愈伤组织；所述外植体包括茎段、叶片和/或胚轴；所述诱导愈伤培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括0.1～0.2mg/L的6-BA、0.3～0.5mg/L的NAA和30g/L的蔗糖，pH值为5.8～6.0；步骤4)所述诱导愈伤培养包括依次进行的暗培养、振荡培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d，暗培养后进行振荡培养，所述振荡培养为25℃、20r/min培养7d；振荡培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25±2℃、光照强度1500～18001x、光照时间14h/d；

5)将所述步骤4)得到的愈伤组织在第一不定芽分化培养基中进行第一分化培养6～8d，再将所述第一分化培养产物在第二不定芽分化培养基中进行第二分化培养25～30d，得到不定芽；所述第一不定芽分化培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；所述第二不定芽分化培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括3.0mg/L的KT、0.5mg/L的NAA、20g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，pH值为5.8～6.0；

6)将所述步骤5)得到的不定芽在生根培养基中进行生根培养，得到霸王柴植株；所述生根培养基以改良MS培养基作为基本培养基，包括0.3mg/L的IBA和10g/L的蔗糖；

所述改良MS培养基为大量元素减少1/3的MS培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述GA₃溶液中GA₃的质量浓度为100mg/L；所述水的温度为40℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)采用GA₃溶液对霸王柴种子进行浸泡的时间为2h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)采用水对霸王柴种子进行浸泡的时间为1h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述消毒后，还包括冲洗种子的步骤，所述冲洗的次数为7～8次。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述无菌苗培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为2d，暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度为1500～18001x、光照时间为12h/d。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述第一分化培养为暗培养，所述第一分化培养的时间为7d。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)所述第二分化培养为光照培养，所述光照培养的条件为：25±2℃、光照强度1500～18001x、光照时间14h/d。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)所述生根培养包括依次进行的暗培养和光照培养，所述暗培养的时间为4d，暗培养后进行光照培养，所述光照培养的条件为：温度25℃、光照强度2000～22001x、光照时间14h/d。