JPH0648991B2 - トロパン系アルカロイドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はズボイシア属植物の根および不定根の如き植物
組織を培養してスコポラミン、ヒヨスチアミンなどのト
ロパン系アルカロイドを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

スコポラミンは鎮痙剤、鎮痛剤および副交感神経しや断
薬として重用されている。この化合物は、天然の植物体
中から抽出して製造されているが、天然物を原料として
いるため、その生産が天候に左右されること、収獲時期
が限定されていることが問題となっている。そのためこ
の化合物を植物の組織培養により生産する研究が内外で
数多く行われた。カルスによる生産では、山田らによる
ヒヨスのカルスによる生産例が知られている〔プラント
セルレポート（Plant Cell Reports）１、１０１〜１０
３（１９８２）〕が、スコポラミン含量は２０ppmと、
天然の植物体中の含量と比較して低いものであつた。ま
た平岡、田端、木島はダツラのカルスを用いトロピンを
添加培養してアセチルトロピンの生産を報告している
〔フアイトケミストリー(Phytochemistry)１２，７９５
−７９９（１９７３）〕。さらに影井らはズボイシアの
カルスを培養してイソブチロイルトロピンおよびバレロ
イルトロピンの生産を報告している（特開昭５６−１２
１４９４号公報）。しかし両者のカルス中の含量は約１
００ppmと低いものであつた。

一方、ズボイシアの植物にはチグロイジン等の撹拌性ト
ロパン系アルカロイドが含まれていることが川谷、宮崎
の文献に記載されている〔熱帯農業、６，１２９−１３
６（１９６３）〕。山田らは、ズボイシア(Duboisia Le
ichhardt F.Muell)の組織培養により得られる不定根
中に著量のスコポラミンおよびヒヨスチアミンが存在す
ることを見出している〔プラントセルレポート(Plant C
ell Reports)３、186-188(1984)〕が、その量はまだ充
分とは言えないものであつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

したがつてこのような組織培養法によりトロパン系アル
カロイドの工業的な生産を目指す場合、さらに生産性を
高めることが重要な課題であつた。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、ズボイシア
属植物の組織を効率よく培養してトロパン系アルカロイ
ドを従来法に比べて多く得る方法について検討した。

〔問題点を解決するための手段〕

その結果、本発明者等はズボイシア属植物の組織培養に
おいては、組織培養物によるトロパン系アルカロイドの
生産性は培地の溶存酸素濃度に大きく影響されることを
見出し、本発明を完成するに到つた。すなわち本発明の
方法によれば、ズボイシア属に属する植物を液体培地を
用いて組織培養するに当たり、該培地の溶存酵素濃度を
１０ないし５０ppmにして組織培養を行い、培養物より
トロパン系アルカロイドを採取することを特徴とするト
ロパン系アルカロイドの製造方法、が提供される。

本発明では組織培養はズボイシア属に属する植物を用い
て行われるが、該ズボイシア属植物として具体的にはDu
boisia myoporoides R.Br、Duboisia Leichhardt F.Mu
ellおよびDuboisia hopwood F.Muell等を例示でき
る。

本発明で使用される液体培地は、無機成分および炭素源
を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を
添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地で
ある。

該培地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナ
トリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マ
ンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コ
バルト等の元素を含む無機塩を挙げることができ、具体
的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウ
ム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、
モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カ
リウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を
例示できる。

該培地の炭素源としては、シヨ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ｐ−クロ
ロフエノキシ酢酸、２，４−ジクロロフエノキシ酢酸
（２，４−Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびこれ
らの誘導体等のオーキシン類およびベンジルアデニン
（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチンのサイトカイニン類を
例示できる。本発明ではサイトカイニン類は通常は培地
に添加しないことが望ましいが、必要に応じて添加する
場合にはサイトカイニン類は濃度が通常１０^-7Ｍ（０．
０２mg／）以下の低濃度で使用することが好ましい。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ₁）、ピリドキシン（ビタミンＢ₆）、ピリドキ
サール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、ア
スコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン
酸、ニコチン酸アミドおよびリボブラビン（ビタミンＢ
₂）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、システイン、フエニルアラニンおよ
びリジンなどを例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μＭないし約１００ｍＭ、前記炭素源を約１ｇ／ない
し約１００ｇ／、前記植物ホルモン類を約０．１mg／
ないし約１００mg／、前記ビタミン類を約０．１mg
／ないし約１５０mg／および前記アミノ酸類を０な
いし約１０００mg／含ませて使用することが望まし
い。

本発明のトロパン系アルカロイドの製造方法に用いられ
る前記培地として具体的には、従来から知られている植
物の組織培養に用いられている培地、例えばムラシゲ・
スクーグ（′６２）〔Murashige & Skoog〕の培地、リ
ンスマイヤー・スクーグ(RM−１９６５）〔Linsmaier &
Skoog〕の培地、ホワイト（′６３）〔White〕の培
地、ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、三井のＭ−
９培地、ニツチ・ニツチの培地〔Nitsch &Nitsch〕等に
前記した炭素源および植物ホルモンを添加し、更に必要
に応じて前記したビタミン類、アミノ酸類を添加して調
製される培地を例示できるが、本発明ではこの中でも特
にニツチ・ニツチ、リンスマイヤー・スクーグ又はムラ
シゲ・スクーグの培地を用いて調製される培地が好まし
い。なお、上記した従来公知の培地の組成に関しては、
例えば、竹内、中島、古谷著の「新植物組織培養」Ｐ３
８６〜Ｐ３９１、朝倉書店、１９７９年に記載されてい
る。

本発明では前記した液体培地を用いてズボイシア属植物
の組織培養を行い、トロパン系アルカロイドが生産され
るが、この場合、本発明では培地の溶存酸素濃度が１０
ないし５０ppm、好ましくは２５ないし５０ppmとなるよ
うにして組織培養が行われる。溶存酸素濃度が１０ppm
よりも低い場合および５０ppmよりも高い場合にはトロ
パン系アルカロイドの生産量が低下するので好ましくな
い。培地の溶存酸素濃度を本発明で行われる前記濃度範
囲にする方法としては以下に示す方法を例示できる。す
なわち通常２３ないし３０℃で組織培養が行われる液体
培地において、該培地に接触する酸素含有ガスの酸素分
圧を通常１９０mmＨｇ以上、好ましくは４００mmＨｇな
いし１．８kg／cm²ａｂｓにしてこの酸素含有ガスと培
地を適宜の方法によつて接触させることにより、培地の
溶存酸素濃度を前記範囲にすることができる。この場合
の酸素含有ガスとしては具体的にはチツ素等の不活性成
分を含んだ種々の酸素濃度を有するガスや純酸素ガスを
例示できる。酸素含有ガスとして空気を大気圧以下で培
地と接触させる方法は従来のズボイシア属植物の組織培
養において採用された方法であつて、この方法では培地
の溶存酸素濃度は培養温度によつても多少異なるが通常
８ppm程度と低いためトロパン系アルカロイドの生産量
は少ないので好ましくない。本発明では必要に応じて酸
素含有ガスとして空気を用いることも出来、この場合に
は該ガスを加圧することによつて系内の全圧を高くして
ガス中の酸素分圧を前記範囲にすることによつて、培地
の溶存酸素濃度を本発明の範囲にすることができる。大
気圧下で組織培養を行う場合には純酸素ガスを使用して
も培地の溶存酸素濃度は通常４０ppm程度しか高まらな
いため、更に酸素濃度を高めたい場合には通常知られて
いる適宜方法によつて加圧した系で組織培養を行う方法
が採用される。要するに本発明では、状況に応じて酸素
含有ガス中の酸素分圧を適宜選ぶことによつて培地の溶
存酸素濃度を前記範囲にして培養が行われる。

本発明では酸素含有ガスと培地を接触させる方法として
は特にどのような方法を用いなければならないというこ
とは無く、通常知られているどのような方法でも採用で
きる。そして該接触方法として具体的には、例えば液体
培地中に置かれた多数の孔を有するガス分散器を介して
培地中に酸素含有ガスを放出させる通気培養方法、ある
いはシリコン、テフロン等の特殊な材料から作られた酸
素透過性の膜からできた任意形状のガス送入部を培地と
接触させてこの膜を介して培地中に酸素を供給する方法
などを例示できる。酸素透過性の膜を用いる方法では、
通気培養のときのような激しい気泡の発生も無いので培
養物に好ましくない外力をかけないようにすることがで
きるので一層好ましい。

培地の溶存酸素濃度を調節する方法としては、例えば以
下に示すような方法がある。ガルバニツクセル型の酸素
電極を用いて溶存酸素濃度に比例して発生する電流を測
定し、所定の溶存酸素濃度に対応する電流以上になると
自動的に供給酸素量を減じ、かつ該電流値以下の場合、
自動的に供給量を増加せしめることによつて培地の溶存
酸素濃度を所定の値に維持する方法である。

本発明で実施される組織培養においては、培養槽あるい
は培養装置については特にどのようなものを用いなけれ
ばならないということはなく、前記した本発明の要件を
満足できるものであればどのようなものでも使用でき
る。本発明では培地を、必要に応じて培養槽自体の振と
う、旋回あるいは撹拌羽根等の手段によつて撹拌しても
良いし、又静置しても良い。あるいは又本出願人が特願
昭５９−２６２０９９号によつて提案した液体散布の方
法、すなわち液体培地を培養物の上方からシヤワー状に
散布するようにして培養する方法を採用することもでき
る。この場合には液体培地を培養器とは別の所で酸素含
有ガスと接触させて培地の溶存酸素濃度を前記範囲に調
整してからこの液体培地を培養器に導入し、リサイクル
使用する方法を例示できる。

本発明では前記した方法によつてズボイシア属植物の組
織片が組織培養されてスコポラミン、ヒヨスチアミン等
のトロパン系アルカロイドを多く含有する組織培養物が
得られる。この場合の該組織片として具体的には根、
葉、茎、種子、花芽などを例示でき、又該アルカロイド
を含有する組織培養物を得るための組織培養方法として
以下の方法を例示できる。すなわち、通常本発明ではこ
れらの組織片からカルスが誘導され、該カルスを継代培
養して得られる組織培養物は本発明の前記培地を用いて
増殖培養されてトロパン系アルカロイドを含有する多量
の組織培養物が得られる。この場合、本発明では組織培
養物としてカルス誘導時に形成される根および又は不定
根を使用し、これを継代培養し、増殖培養することが特
に好ましい。植物の組織片として根を用いる場合にはこ
れをそのまま培養して組織培養物を得る方法を採用する
こともできる。本発明ではカルス誘導時において形成さ
れる根および又は不定根を用いる場合には、カルス誘導
時の際に植物の組織片を例えば毛根病菌アグロバクテリ
ウムリゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)で感染さ
せ、これによつて出現する毛根を用いることもできる。

また本発明では、本出願人が特願昭６０−１０７０４４
号で出願したズボイシアの組織培養方法で開示した方法
である、培地のアンモニウムイオン(a)と硝酸イオン(b)
の比率（ａ／ｂ）を０．２以上とした培地を用いて、本
発明の方法を適用して培養を行うとスコポラミンの生産
量が増大するので好ましい。

本発明の方法によればトロパン系アルカロイドとしてス
コポラミンの他にもヒヨスチアミン及びアセチルトロピ
ン、イソブチロイルトロピン、バレロイルトロピン、チ
グロイジンなどが生成し、スコポラミンだけでなく他の
トロパン系アルカロイドの生成量も培地の溶存酸素濃度
の影響を特異的に受けるため、本発明の様に溶存酸素濃
度を高くするとこれらトロパン系アルカロイドの生成量
を高めることができる。本発明は特にスコポラミンの生
産に好適である。

〔発明の効果〕 本発明のズボイシア属植物の組織培養方法を採用すれ
ば、従来法に比べてトロパン系アルカロイドを多量に効
率良く生産することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によつて更に具体的に説明
する。

実 施 例 １ 当社薬草園にて栽培したDuboisia myoporoides R.Br.の
葉を洗浄し、１０％アンチホルミン液に１０分間浸漬
し、次いで滅菌水で３回洗浄した後、約１cmに切断し、
ナフタレン酢酸およびベンジルアデニンをそれぞれ１０
^-5Ｍおよび１０^-6Ｍとなるように添加したリンスマイヤ
ー・スクーグの寒天培地に置床し、２５℃で３０日間培
養する。カルス形成と同時に発生した不定根を切り出
し、インドール酪酸を１０^-5Ｍになるように添加したニ
ツチ・ニツチの液体培地に移殖し、６ケ月間継代培養し
た。このようにして得た不定根０．８ｇ（乾燥重量）を
溶存酸素濃度調節計および底部に通気用のガラスフイル
ター板を備え、上記液体培地１を含む通気培養槽に移
殖し、溶存酸素濃度を４０ppmに保ちながら３週間培養
した。得られた不定根を乾燥した後の重量は１２．３ｇ
であつた。これを塩基性のクロロホルム−メタノール液
１で抽出した。これに１の１Ｎ硫酸を加えてアルカ
ロイドを硫酸層に移した。さらにアンモニア水１００ml
およびクロロホルム１を加えてアルカロイドをクロロ
ホルム層に移し、これを減圧濃縮し、抽出物をガスクロ
マトグラフイーで分析したところ、乾燥重量あたりのス
コポラミン、ヒヨスチアミン、アセチルトロピン、イソ
ブチロイルトロピン、バレロイルトロピン、チグロイジ
ンのトロパン系アルカロイドの総量は３．０５重量％、
そのうちスコポラミンは０．８５重量％であつた。

なお、各種アルカロイドの分析には以下のカラムを用い
た。

カラム：Silicone OV-１７（１％）ｏｎ Chromosorb W (Mesh ８０〜１００） ３mmφ×１ｍ ガラスカラム キヤリアガス：Ｈｅ カラム温度：７０℃から５℃／分の速度で２００℃まで
昇温 実施例２〜４、比較例１〜３ 溶存酸素温度を表１に示したように変えた以外は実施例
１と同様にして行つた結果を表１に示した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ズボイシア属に属する植物を液体培地を用
   いて組織培養するに当たり、該培地の溶存酸素濃度を10
   ないし50ppmにして組織培養を行い、培養物よりトロパ
   ン系アルカロイドを採取することを特徴とするトロパン
   系アルカロイドの製造方法。
2. 【請求項２】培地の溶存酸素濃度が20ないし50ppmであ
   る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。