JPH0533980B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、キンポウゲ科植物の組織培養方法に
関する。 〔従来の技術〕 キンポウゲ科植物、例えばオウレン類の根莖に
は、ベルベリン等のイソキノリン系アルカロイド
が含有されており、このアルカロイド類は例えば
健胃薬、染料などに利用されその需要は大きい。 しかしながら、これら天然で生育したキンポウ
ゲ科植物からベルベリン等のイソキノリン系アル
カロイドを直接採取する方法は、該キンポウゲ科
植物の生育等が自然環境や天候に左右されまた該
植物の収集にも時間と手間がかかるため、有利な
方法とは言えない。そこでこれに代わる方法とし
て、例えば、生薬学雑誌35巻15〜21頁（1981年）、
及びフアイトケミストリー（Phytochemistry）
14巻1209〜1210頁（1975年）等に記載されている
ように、キンポウゲ科植物の組織培養方法がいく
つか提案されている。しかしこれら従来公知の組
織培養方法においても、該方法によつて得られる
培養細胞から生産される目的物のイソキノリン系
アルカロイドの収量は低いという欠点がある。 〔発明が解決しようとする問題点〕 かかる背景のもとに、本発明者等はキンポウゲ
科植物を組織培養する方法において、従来法に比
べてベルベリン等のイソキノリン系アルカロイド
を効率よく生産する方法について鋭意検討した結
果、下記方法を採用すればベルベリン等のイソキ
ノリン系アルカロイドを多く得ることが出来るこ
とを見出し、本発明を完成するに到つた。 〔問題点を解決するための手段〕 すなわち、本発明によれば、キンポウゲ科植物
の組織あるいは細胞を培養するに当つて、ジベレ
リンを含む培地を用いることを特徴とするキンポ
ウゲ科植物の組織培養方法、が提供される。 本発明の方法において用いられるキンポウゲ科
植物としては、例えばオウレン（Coptis
japonica Makino）、セリバオウレン（C.
japonica Makino var.dussecta Nakai）、キク
バオウレン（C.japonica Makino var.
japonica）、コセリバオウレン（C.japonica
Makino var.major Satake）、バイカオウレン
（C.quinquefolia Miq.）およびミツバオウレン
（C.trifolia Salisb.）等のコプテイス属の植物、
アキカラマツ（Thalictrum minus L.var
hypoleucum Miq.）等のサリクトラム属の植物、
クサントリザ属の植物およびヒドラスチス属の植
物を挙げられる。本発明ではこれら植物の中では
特にセリバオウレンあるいはアキカラマツを用い
ることが好ましい。 本発明のキンポウゲ科植物の組織培養に用いら
れる培地としては、従来から知られいている植物
の組織培養に使用されている培地において、特定
濃度のジベレリンを含有させたことを特徴とする
培地が使用される。すなわち、本発明の方法にお
いて使用される培地はジベレリンを通常10^-9モ
ル／以上、好ましくは10^-8モル／ないし10^-3
モル／含有する培地である。そして本発明では
ジベレリン濃度を前記範囲に保持する限り、培地
中のジベレリン以外の他の培地成分を、必要に応
じて広い濃度範囲で変化させて使用することがで
きる。 本発明の組織培養において培地を構成する必須
成分として使用されるジベレリンとは、(1)式 で示されるジバン核を持つ植物ホルモンの総称
で、これ迄に約50種類のジベレリン〔これらは通
常GA_o（ｎ＝１〜50の整数）で表記される〕が報
告されているが、本発明ではこれら各種のジベレ
リンのいずれも使用することが出来る。本発明で
はこれらジベレリンの中でも特に(2)式 で示されるジベレリンA₃（GA₃）を用いるとベル
ベリン等のイソキノリン系アルカロイドの含有量
が増すので好ましい。 本発明で使用される培地は、ジベレリン、無機
成分および炭素源を必須成分とし、これにジベレ
リン以外の植物ホルモン類、ビタミン類およびア
ミノ酸類から選ばれる少なくとも１種類以上の成
分を添加した培地であり、更に必要に応じてこれ
以外の他の成分も併用使用することができる。 該培地の無機成分としては、窒素、リン、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、
マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩
素、ナトリウム、ヨウ素およびコバルト等の元素
を含む無機塩を挙げることができ、具体的には硝
酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化アン
モニウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、
硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸
銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデ
ン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コ
バルト等の化合物を例示できる。 該培地の炭素源としては、シヨ糖等の炭水化物
とその誘導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノー
ル等の１級アルコール等を例示できる。 該培地の植物ホルモンとしては、インドル酢酸
（IAA）、ナフタレン酢酸（NAA）、Ｐ−クロロ
フエノキシイソ酪酸および２，４−ジクロロフエ
ノキシ酢酸（２，４−Ｄ）等のオーキシン類およ
びカイネチン、ゼアチンおよびベンジルアデニン
等のサイトカイニン類を例示できる。 該培地のビタミン類としては、ビオチン、チア
ミン（ビタミンB₁）、ピリドキシン（ビタミン
B₆）、ピリドキサール、ピリドキサミン、パント
テン酸カルシウム、アスコルビン酸（ビタミン
Ｃ）、イノシトール、ニコチン酸、ニコチン酸ア
ミドおよびリボフラビン（ビタミンB₂）などを
例示できる。 該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシ
ン、アラニン、グルタミン酸、システインおよび
リジンなどを例示できる。 本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を
約0.1μモル／ないし約100ｍモル／程度、前
記炭素源を約１ｇ／ないし約100ｇ／、ジベ
レリン以外の前記植物ホルモン類を約0.01μモ
ル／ないし約20μモル／程度および前記ビタ
ミン類と前記アミノ酸類をそれぞれ約0.1mg／
ないし約150mg／程度含ませて使用される。 本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒
天を通常0.5〜１％含有させた固体培地であるが
本発明では液体培地を用いることが好ましい。 本発明の方法においては、培地中のジベレリン
を前記濃度範囲に保持しながらかつ該培地中の前
記他成分の濃度を調整することにより、培養細胞
中のベルベリン等のイソキノリン系アルカロイド
の生成量を更に増大させることが可能である。例
えば本出願人が特願昭59−127467号で提案した方
法であるが、培地中のイオンの濃度を0.2モル／
以上にする方法を必要に応じて本発明の方法に
対して適用すると該アルカロイドの生成量を増す
ことができるので好ましい。 本発明ではキンポウゲ科植物の組織培養に用い
られる前記培地として具体的には、従来から知ら
れている植物の組織培養に用いられている培地、
例えば、ムラシゲ・スクーグ（’62）
〔Murashige ＆ Skoog〕の培地、リンスマイ
ヤー・スクーグ（RM−1965）〔Linsmaier＆
Skoog〕の培地、ホワイト（’63）〔White〕の
培地、ガンボルグ〔Gamborg〕のＢ−５培地、
三井のＭ−９培地、ニツチ・ニツチの培地
〔Nitsch ＆ Nitsch〕等に前記した炭素源およ
び植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記
したビタミン類、アミノ酸類を添加して調製され
る培地を例示できるが、本発明ではこの中でも特
にニツチ・ニツチ、リンスマイヤー・スクーグ又
はムラシゲ・スクーグの培地を用いて調製される
培地が好ましい。なお、上記した従来公知の培地
の組成に関しては、例えば、竹内、中島、古谷著
の「新植物組織培養」P386〜P391、朝倉書店、
1979年に記載されている。 本発明の方法においては、キンポウゲ科植物は
前記培地を用いて組織培養される。この場合の組
織培養の方法について以下詳述する。先ずキンポ
ウゲ科に属する植物の植物体、例えば、根、生長
点、葉、莖、果実、種子等から採取された組織片
を、例えば、新植物組織培養（朝倉書店1979年
版）、21頁に記載されている寒天で固めた、リン
スマイヤースクーグの培地（RM−1965）に置床
して、10〜35℃で７〜30日間程度培養することに
よつて該組織片の一部をカルス化させる。このよ
うにして得られるキンポウゲ科植物のカルスを、
通常知られている方法によつて継代培養すると、
カルスの生育速度が漸次高まる。次にこのカルス
を増殖に適した液体培地、例えば、新植物組織培
養（朝倉書店1979年版）、21頁に記載されている
リンスマイヤースクーグの液体培地（培地Ａ）に
移して更に増殖させるとカルスの生育速度は更に
高められ安定化したカルスが得られる。本発明の
方法では、このようにして得られる安定化したカ
ルスを本発明の前記培地（液体培地Ｂ）に添加し
て更に培養が行われる。 本発明の方法において、前記安定化したカルス
を前記培地Ｂ中で培養する際の該カルスの初期濃
度としては、該濃度を広い範囲で変えることがで
きるが、通常は、本発明の前記培地Ｂの１に対
して該カルスを新鮮なときの重量で表示して約１
ないし約200ｇ程度、好ましくは約10ないし約40
ｇ程度添加するのが望ましい。 本発明の組織培養における培養温度としては、
通常は、約10ないし約35℃、この中でも特に23な
いし約28℃が好適であり、該温度を約10℃未満に
するとカルスの増殖速度は小さく、また該温度を
35℃以上にしたときも同様にカルスの増殖速度は
小さくなる。本発明の組織培養を行うに当たつて
は、光は必ずしも必要ではないが、光の照射はベ
ルベリン等のアルカロイドの生成を妨げない。 本発明の方法においては、培養終了後カルスを
デカンテーシヨンあるいは濾過等の方法によつて
培地Ｂから分離し、次に該カルスから目的とする
ベルベリン等のイソキノリン系のアルカロイドを
従来から知られている天然品のオウレン、オウバ
ク等に適用されている抽出等の方法によつて分離
することができる。このようにして得られる該ア
ルカロイドは必要に応じて更に再結晶等の方法に
よつて純度を高めることができる。 本発明の方法は、液体培地を用いることもでき
るのでタンク等を利用した大量培養が可能であ
り、更にカルスの増殖が速やかで、かつベルベリ
ン等のアルカロイドを確実に大量生産することが
できる工業上有利な方法である。 〔発明の効果〕 本発明の方法を採用すれば、従来法に比べてベ
ルベリン等のイソキノリン系アルカロイドを大量
に効率よく生産することができる。 〔実施例〕 以下、本発明を実施例によつて更に詳しく説明
する。 実施例 １〜７ 組織培養の培地成分が第１表に示す組成を有す
るリンスマイヤー・スクーグの液体培地を寒天で
固めた固体培地（寒天１重量％）に、前もつて２
％アンチホルミン溶液あるいは70％エタノール溶
液等で滅菌処理したセリバオウレン
（Coptisjaponica Makino var.dissecta Nakai）
の葉の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養し
てそれぞれのカルスを得た。次にこれらのカルス
を、上記と同様の条件で、リンスマイヤー・スク
ーグの液体培地で、14日毎に植えつぎ、ロータリ
ーシエーカー上で旋回培養（振幅25mm，100rpm）
して、該カルスの生育速度を速め、安定化したセ
リバオウレンカルスを得た。 一方、これとは別に先の液体培地の20mlを、そ
れぞれ別個の内容積100mlのエルレンマイヤーフ
ラスコに取り、これらを120℃で10分間保持して
滅菌処理を施した後、メンブレンフイルターを用
いて徐菌したジベレリンA₃を一定量ずつ加えた。
ジベレリンの濃度は10^-9モル／，10^-8モル／
，10^-7モル／，10^-6モル／，10^-5モル／
，10^-4モル／および10^-3モル／にした。次
にそれぞれの液体培地に、先に得た所の生育速度
の高められた新鮮な安定化したセリバオウレンカ
ルスをそれぞれ0.20ｇ添加して、25℃で14日間ロ
ータリーシエーカー上で旋回培養（振幅25mm，
10rpm）した。 培養後のカルスは濾過により採取し、40℃で１
昼夜風乾したのちその重量（乾燥重量）を測定
し、液体培地１当たりに換算した培養細胞の生
育重量を求めた。ベルベリン等のアルカロイド
は、得られた乾燥カルスをメタノール等を用いて
抽出し、高速液体クロマトグラフイーを用いて、
標準品と比較することによつて測定した。 この結果を第２表に示した。

【表】

【表】 モル／を示す
比較例 １ 実施例１〜７で使用した液体培地の培地成分に
おいて、ジベレリンが含まれていないこと以外
は、実施例１〜７と同様にして行つた。 この結果を第２表に示した。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ キンポウゲ科植物の組織あるいは細胞を培養
   するに当つて、ジベレリンを含む培地を用いるこ
   とを特徴とするキンポウゲ科植物の組織培養方
   法。