JPH02291288A - インドールアルカロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明はニチニチソウ属植物等のインドールアルカロイ
ドを代謝産生ずる植物の組織を特定の培地を用いて組織
培養することにより、インドールアルカロイド、例えば
抗腫瘍剤ビンブラスチンの製造原料として用いられるカ
サランチンや循環器系治療薬として需要のあるアジマリ
シンを生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

ニチニチソウ属植物に見出されるインドールアルカロイ
ドであるカサランチンは抗腫瘍剤ピンクリスチンの原料
として、又アジマリシンは循環器系治療薬として、それ
ぞれ商業的に重要な関心が寄せられている．これらの化
合物は天然の植物体中から採取されているが天然物を原
料としているため、その生産が天候に左右されること、
収穫期が限定されることなどにより、必ずしも市場に安
定供給されないことが問題となっている。その為これら
の化合物を植物の組織培養で生産する研究が数多く行な
われている．たとえばプラント・セル・レポート（Ｐｌ
ａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　　６、１４２−１
４５（１９８７）　）には、植物ホルモンとして１−ナ
フタレン酢酸（ＮＡＡ）及びカイネチンを含有させたＭ
ｕｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇの液体培地に硫酸バナジル
を添加すると、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕ
ｓ　ｒｏｓｅｕｓ）カルスで、カサランチン収量は３５
．８ｍｇ／　１、アジマリシン収量は１４．３ｍｇ／　
ＩＩ！まで向上したと述べてある。しかしながら、工業
的見地からはその生産性を更に高めることが望まれてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

従ってこの様な組織培養により、インドールアルカロイ
ドの工業的生産を目指す場合、生産性の向上が重要な課
題となる。本発明者等は、かかる現状から、二次代謝産
物としてカサランチン、アジマリシン等のインドールア
ルカロイドを効率良く生産するニチニチソウ属植物等の
植物の組織培養方法を検討した。

〔課題を解決するための手段］ 本発明者は、インドールアルカロイドを産生ずるための
植物の組織を、糖源としてフルクトースを含有する培地
で培養を行うと、培養組織中のインドールアルカロイド
の含量が向上することを見出し、本発明を完成するに到
った。即ち、本発明ニヨれば、インドールアルカロイド
を産生ずる植物の組織を、糖源としてフルクトースを含
む培地ドを生産することを特徴とするインドールアルカ
ロイドの生産方法が提供される。

本発明の組織培養では、インドールアルカロイドを産生
ずる植物を用いて行われるが、該当する植物として具体
的には、ニチニチソウ属植物のリトル番プライト●アイ
品種（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓｖａｒ
．　Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈｔ　Ｅｙｅ）　、ジー・
ドン品種（Ｃ．ｒｏｓｅｕｓ　Ｇ．Ｄｏｎ）、リトル・
デリカタ品種（Ｃ．ｒｏｓｅｕｓｃｖ．Ｌｉｔｌｌｅ　
Ｄｅｌｉｃａｔａ）等を例示することができる。

本発明で使用される培地は、糖源としてフルクトースを
含有し、無機成分を必須とし、これに植物ホルモン類、
ビタミン類を添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添
加した培地である。

本発明においては、培地中の糖源としてフルクトースを
用いることが必要であり、培地中のフルクトース濃度は
２〜５％が好ましい。

無機成分としては、リン、窒素、カリウム、カルシウム
、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素
、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバル
ト等があり、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム
、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸１水素カリウ
ム、リン酸２水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸ナＩ−　ＩＪウム、硫酸第一鉄、硫酸第
二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリ
ブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウ
ム、塩化コバルトなどが例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフ
タレン酢酸（ＮＡＡ）　、Ｐ−クロロフエノキシイソ酪
酸、２．４−ジクロロフエノキシ酢酸（２．４−Ｄ）な
どのオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼ
アチン等のサイトカイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）
、ピリドキシン（ビタミンＢ，）、バントテン酸、アス
コルビン酸くビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン酸
などが例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
ステインなどがある。

本発明の前記培地では、無機成分を約０．　１μＨない
し約ｌＯ軸門、炭素源を約ｌｇ／ｌないし約３０ｇ／ｌ
、植物ホルモン類を約０．０１　ｕ　Ｍないし約１０μ
Ｈ、ビタミン類及びアミノ酸類をそれぞれ約０．１ｍｇ
／１ないし約１００ｍｇ／　１程度の濃度が用いられる
。

本発明の組織培養に用いられる前記培地として具体的に
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（１９６２）　（Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ　）の培地、リンス
マイヤー・スクーグ（１９６５年）　（Ｌｉｎｓｍａｉ
ｅｒ　Ｓｋｏｏｇ）の培地、ホワイト　（１９５４年）
〔讐ｈｉｔｅ）の培地、“ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ
　）のＢ−５培地、三井のト９培地等に前記した炭素源
及び植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記した
ビタミン類、アミノ酸類を添加して調製される培地を例
示できるが、本発明ではこの中でも特にムラシゲ・スク
ーグの培地を用いて調製される培地が好ましい。

本発明で使用される前記培地は液体培地又は寒天やゼラ
チン等を通常０．５〜１％含有させた固型培地であるが
本発明では通常液体培地が好ましい。

本発明の組織培養においては、前記植物の根、生長点、
葉、茎、種子、花粉、朽、かく等の組織片あるいは細胞
、又はこれらを本発明に係わる培地あるいは他の従来の
培地によって組織培養して得た培養細胞あるいは培養組
織あるいはプラスミドの導入によって形質転換したクラ
ウンゴール組織を使用することができる。これらの組織
又は細胞を本発明に係る培地を用いて組織培養し、カサ
ランチン等のインドールアルカロイドを多量含んだ培養
組織又は培養細胞を得る。

本発明方法によって得られるインドールアルカロイドと
しては、カサランチン、アジマリシン、セルベンチン、
アンヒドロビンブラスチン、ビンブラスチン、ピンクリ
スチン等が例示される。

本発明方法で得られるインドールアルカロイドを含有す
る培養組織又は培養細胞から、インドールアルカロイド
を分離する方法としては、メタノール等の有機溶媒によ
る抽出がある。

本発明の組織培養の好ましい一例としては、次の方法が
挙げられる。

先ずニチニチソウ属に属する植物の植物体、例えば根、
生長点、葉、茎、種子などから採取される組織片を殺菌
処理後、寒天で固めたムラシゲ・スクーグの固体培地上
に置床し、１０〜３５℃で７〜３０日程度経過後、組織
片の一部をカルス化させる．このようにして得られたカ
ルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化した
カルスが得られる。このカルスを増殖に適した液体培地
、例えばムラシゲ・スクーグの液体培地に移して増殖さ
せる。液体培地においてさらに生育速度が高められ、安
定化したカルスを本発明の液体培地に添加して培養する
。

本発明の組織培養における培養温度としては、通常は、
約１０ないし約３５゜Ｃ、この中でも特に約２３ないし
約２８゜Ｃが好適であり、該温度を約１０゜Ｃ未満にす
るとカルスの増殖速度は小さく、また該温度を３５゜Ｃ
以上にしたときも同様にカルスの増殖速度は小さくなる
。本発明の組織培養を行うに当たっては、光は必ずしも
必要ではないが、光の照射はカサランチン等のインドー
ルアルカロイドの生成を妨げない。

本発明の方法においては、培地に液体培地を用いた場合
には培養終了後カルスをデカンテーションあるいは濾過
等の方法によって培地から分離し、次に該カルスから目
的とするカサランチン等のインドールアルカロイドを有
機溶媒による抽出等の方法によって分離することができ
る。

本発明の方法は、液体培地を用いるとタンク等を利用し
た大量培養が可能である。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１，２．３，４．５ ナフタレン酢酸、及びカイネチン濃度がそれぞれｌｐｐ
ｍ，　０．１ｐｐｍになるように添加したムラシゲ・ス
クーグの寒天培地（寒天１重量％）に、前もって２％ア
ンチホルミン溶液あるいは７０％エタノール溶液等で滅
菌処理したニチニチソウ（Ｃａｔｈａ−ｒａｎｔｈｕｓ
　ｒｏｓｅｕｓ　ｖａｒ．Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈｔ
，マダカスガル原産）の豹の一部を置床し、２５゜Ｃで
暗所にて静置培養してニチニチソウのカルスを得た。次
にこのニチニチソウのカルスを、上記と同様の条件で、
ムラシゲ・スクーグの液体培地で７日毎に植えつぎ、ロ
ータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍ＋ｎ，　
１００ｒｐｍ）　Ｌて、該カルスの生育速度を速め、安
定化したニチニチソウカルスを得た。

この様にして得られた培養細胞２．１ｇ（新鮮重）をナ
フタレン酢酸１　ｐｐＩ＋＋＋　　カイネチン０．　１
　ｐｐｍ濃度になる様に添加し、フルクトース濃度が、
それぞれ２．３．４．５．６％であるムラシゲ・スクー
グの液体培地２０ｍＺ入りの１００ｄ容三角フラスコに
移し、７日間振とう培養した。

培養後のニチニチソウカルスは濾過により採取し、４０
’Ｃで１夜風乾したのちその乾燥重量を測定し、液体培
地１２当たりに換算した培養細胞の生育重量を求めた。

カサランチン等のインドールアルカロイドは、得られた
乾燥カルスをメタノール等を用いて抽出し、高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて、標準品と比較定量すること
によって測定した。結果を表１に示す。

比較例１．　　２．　　３．　　４ 実施例１において塘源としてフタルトースに替えてシュ
ークロースを２．３．　　４．５％（通常のムラシゲ・
スクーグの培地に用いられる糖源）にした以外は該実施
例と同様に行なった、結果を表１に示す。

（本頁以下余白） 〔発明の効果〕 本発明の組織培養によるインドールアルカロイドの生産
方法を用いれば、従来法に比ベカサランチン，アジマリ
シン等のインドールアルカロイドを効率良く大量に住産
することができる。

出願人　三井石油化学工業株式会社 代理人゛弁理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　貞　次

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インドールアルカロイドを産生する植物の組織を、
   糖源としてフルクトースを含む培地を用いて組織培養を
   行い、インドールアルカロイドを生産することを特徴と
   するインドールアルカロイドの生産方法。 ２、フルクトース濃度が２％ないし５％であることを特
   徴とする請求項１記載の生産方法。 ３、インドールアルカロイドを産生する植物がニチニチ
   ソウ属植物であることを特徴とする請求項１又は２記載
   の生産方法。