JPH0491785A - インドールアルカロイド高生産株およびその取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、インドールアルカロイド生産能力を有する植
物の細胞等の中から、インドールアルカロイド生産能力
の高い株を選び出すことによって、インドールアルカロ
イド、たとえば抗腫瘍剤ビンブラスチンの製造原料とな
るカサランチンや循環器系治療薬として需要のあるアジ
マリシンを効率よく生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

ニチニチソウ属植物に見出されるインドールアルカロイ
ドであるカサランチンは抗腫瘍剤ピンブラスチンの原料
として、又アジマリシンは循環器系治療薬として、それ
ぞれ商業的に重要な関心か寄せられている。これらの化
合物は天然の植物体中から採取されているか天然物を原
料としているため、その生産か天候に左右されること、
収穫期か限定されることなどにより、必ずしも市場に安
定供給されないことか問題となっている。その為これら
の化合物を植物の組織培養で生産する研究か数多く行わ
れている。たとえばプラント・セル・レポート（Ｐｌａ
ｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　　６、１４２１４５
（１９８７））には、植物ホルモンとして１−ナフタレ
ン酢酸（ＮＡＡ）及びカイネチンを含有させたＭｕｒａ
ｓｈｉｇｅ　Ｓｋｏｏｇの液体培地に硫酸バナジルを添
加すると、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　
ｒｏｓｅｕｓ）カルスて、カサランチン収量は３５．８
■／ｌ、アジマリシン収量は１４．３■／Ｉまて向上し
たと述べである。しかしなから、工業的見地からはその
生産性を更に高めることが望まれている。

上述のように植物の細胞に与える栄養源やホルモンを工
夫することによって、細胞の有するアルカロイドの生産
能力を最大限に発揮させようという試みかなされている
一方、細胞の集団としての生産能力そのものを向上させ
ようという試みかなされている。植物組織、特に培養細
胞は外観か均一に見えても、細胞レベルで比較すると、
それぞれの生産能力はかなり不均一であり、それらの中
から能力の高い細胞を選び出して増殖させれは、細胞の
集団としての生産能力は大幅に高められると考えられて
いる。実際に、このような考え方をもとに、生産能力を
高めた例かすでにいくつか報告されている〔０ｇ１ｎｏ
　＆　Ｔａｂａｔａ、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１７、１９０７−１９１０　（１９７８）　；　５ａｔ
ｏ　＆　Ｙａｍａｄａ、　Ｐｈｙｔ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３．２８１−２８５　（１９８
４））。

さらに、目的とする高生産株の選抜効率を高めるために
、特定の化合物を添加した培地を用いて植物細胞または
組織を培養し、その化合物に対する耐性を利用して、高
生産株だけを選択的に増殖させる方法が試みられている
。

はとんどのアルカロイドは、特定のアミノ酸を前駆物質
として生合成されるか、細胞当たりのこれらアミノ酸の
生産は、フィードバック機構によって厳しく調節されて
おり、通常その含量か大きく変動することはない。

しかし、細胞に特定のアミノ酸の構造類縁体を与えるこ
とによって目的とするアミノ酸を過剰生産する細胞を得
る方法か報告されている。

たとえば、Ｗｉｄｈｏｌｍはタバコおよびニンジンの培
養細胞から、トリプトファンの構造類縁体である５−メ
チルトリプトファンに耐性を有する株を取得し、その細
胞中のトリプトファン含有量か野生株に比へて高いこと
を報告している（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２６１．５２　（１９７２
）および同誌２７９゜４８　（１９７２））　。また、
ＰａｌｍｅｒとＷｉｄｈｏｌｍは、タバコ細胞からフェ
ニルアラニンの構造類縁体であるｐ−フルオロフェニル
アラニン耐性株を取得し、過剰生産されたフェニルアラ
ニンかそのままの形ではなく、二次代謝産物であるフェ
ノール系化合物の形で多量に蓄積することを見出してい
るｌ：ＰＩａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、　５６．２３３　（
１９７５））。

このような考え方をさらに発展させ、トリプトファンの
構造類縁体を用いて前駆体となるアミノ酸の含有量を増
加させ、間接的に目的とするアルカロイドなとの二次代
謝産物の含有量を増加させようという試みかなされてい
る。

たとえば、５ｃｏｔｔは、次のような方法を用いて、イ
ンドールアルカロイドのひとつであるアンマリジン高生
産株の選抜を試みた（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔｒ
ｙ１８、７９５−７９８　（１９７９））。すなわち、
ニチニチソウ（Ｃａｔｈｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ
　（Ｌ、）Ｇ、Ｄｏｎ）の培養細胞を５０■／βの５．
−メチルトリプトファンを含む液体培地に移植し、２７
°Ｃて４週間振盪培養を行った。

はとんどの細胞は生育阻害を受けた一部細胞か増殖し始
めたのて、同じ組成の液体培地に細胞を移植し、２週間
同様の条件で培養を行った。

この選抜培養を合わせて６〜１．０回繰り返した結果、
５〜メチルトリプトフアン存在下でも野性株と同等の生
育速度を示す株を３種類取得した。しかしこれらの株は
、野性株の３０倍量のトリプトファンを蓄積していたに
もかかわらず、目的とするアシマリシンは予想に反して
全く含まれていなかった。

このようにトリプトファンの構造類縁体を用いるインド
ールアルカロイド高生産株の選抜は、これまでに成功例
かなく、このような方法を用いて高生産株を得るには、
該類縁体の処理法などに改良の余地か残されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従ってこの様な組織培養により、インドールアルカロイ
ドの工業的生産を目指す場合、生産性の向上か重要な課
題となる。本発明者等は、かかる現状から、二次代謝産
物としてカサランチン、アジマリシン等のインドールア
ルカロイドを効率良（生産するために、これらアルカロ
イド高生産株の選抜方法を検討した。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、インドールアルカロイドの生産能力を有す
る植物の培養細胞、組織又は器官から、インドールアル
カロイド高生産株を選抜するに当たって、５−メチルト
リプトファンを含む培地を用いて耐性株を選抜し、これ
ら耐性株の中からインドールアルカロイド高生産株を選
抜することによって野生株を用いる選抜に比べて、高い
頻度で高生産株を取得できることを見い出し、本発明を
完成するに到った。

すなわち、本発明によれば、インドールアルカロイド生
産能力を有する植物の培養細胞、組織又は器官をトリプ
トファンの構造類縁体含有培地中て培養し、該培養細胞
、組織又は器官中から上記トリプトファン構造類縁体に
対する耐性株を選択し、該薬剤耐性株の中から、インド
ールアルカロイド高生産株を選抜することを特徴とする
インドールアルカロイド高生産株の取得方法を提供する
。

本発明の組織培養では、インドールアルカロイドを産生
ずる植物を用いて行われるか、該当する植物として具体
的には、ニチニチソウ属植物のリトル・ブライト・アイ
品種（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓｖａｒ
、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈｔ　Ｅｙｅ）　、ジー・ト
ン品種（Ｃ。

ｒｏｓｅｕｓ　Ｇ、Ｄｏｎ）、リトル・デリカタ品種（
Ｃ，ｒｏｓｅｕｓｃｖ、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｄｅｌｉｃａｔ
ａ）等を例示することかてきる。

本発明に用いる出発材料としてのインドールアルカロイ
ド生産能力を有する植物の培養細胞ＣＬ−１９は微工研
菌寄第１１４８４号として寄託した。

本発明で使用する培地は、糖源および無機塩類を必須成
分とし、これに必要に応じて植物ホルモン類、ビタミン
類、アミノ酸類を添加したものである。また耐性株を選
抜する際には、トリプトファンの構造類縁体を培地に添
加することが必須である。

糖源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース
などの三糖類、グルコース、フルク）〜−ス、ガラクト
ースなどの単糖類、グルセロールなどの糖アルコール、
デンプンあるいはこれら糖源のうち二種類以上を適当な
比率で混合したものか例示される。

無機成分としては、リン、窒素、カリウム、カルシウム
、マグネシウム、イ才つ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素
、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバル
ト等かあり、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム
、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸１水素カリウ
ム、リン酸２水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグ
ネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、
硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン
酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩
化コバルトなどが例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（！ＡＡ）、イン
ドール酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、ｐ
−クロロフェノキシイソ酪酸、２，４−ジクロロフェノ
キシ酢酸（２，４−Ｄ）などのオーキシン類、カイネチ
ン、ペンシルアデニン、ゼアチン、ジヒドロセアチン等
のサイＩ・カイニレ類か例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ、）
、ピリドキシン（ビタミンＢ、）、パントテン酸、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、イノソト−ル、ニコチン酸
なとか例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
スティンなどがある。

本発明の前記培地では、無機成分を約０．１μＭないし
約１００ｍＭ、炭素源を約１　ｇ／Ｉ！ないし約６０ｇ
／ｌ、植物ホルモン類を約０．０１μＭないし約ＩＯμ
Ｍ、ビタミン類及びアミノ酸類をそれぞれ約０．１ｍｇ
／ｊ２ないし約１００■／ｌ程度の濃度が用いられる。

本発明の組織培養に用いられる前記培地として具体的に
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（１９６２年）　Ｃ
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培地、リンス
マイヤー・スクーグ（１９６５年）　（Ｌｉｎｓｍａｉ
ｅｒ　Ｓｋｏｏｇ）の培地、ホワイト（１９５４年）　
（Ｗｈｉｔｅ）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）
のＢ−５培地、シエンク・ヒルデブランド（１９７２年
）　Ｃ３ｃｈｅｎｋ　＆　Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ）の
培地、又は三井のＭ−９培地等に前記した炭素源及び植
物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記したビタミ
ン類、アミノ酸類を添加して調製される培地を例示でき
るか、本発明ではこの中でも特にムラシゲ・スクーグの
培地を用いて調製さる培地か好ましい。

本発明で使用される前記培地は液体培地又は寒天やゲル
ライト・アガロース等を通常０，１〜１％含有させた固
型培地であるか耐性株を選抜する際には固型培地か好ま
しい。

耐性株を得る際に培地に添加するトリプトファン構造類
縁体とはトリプトファン分子構造の骨格を有し、その一
部が置換していても良い。このようなトリプトファンの
構造類縁体としては、トリプトファンの４位、５位、６
位または７位に１個のメチル基または１個のエチル基、
または１個の水酸基または１個のフッ素か結合した化合
物か例示されるが、本発明ては特に５−メチルトリプト
ファンを用いることか好ましい。また、培地へ添加する
類縁体の量は、移植する細胞など１ｇ新鮮重に対して０
．１ｍｇ〜２００■か好ましい。

本発明の組織培養においては、前記植物の根、生長点、
葉、茎、種子、花粉、朽、かく等の組織片あるいは細胞
、又はこれらを本発明に係わる培地あるいは他の従来の
培地によって組織培養して得た培養細胞あるいは培養組
織あるいはプラスミドの導入によって形質転換したクラ
ウンゴール組織または毛状根を使用することかできる。

これらの組織又は細胞から本発明に係る選抜法を用いて
高生産株を取得し、カサランチン等のインドールアルカ
ロイドを多量含んだ培養組織又は培養細胞を得る。

本発明に係る選抜法で得られた、トリプトファン構造類
縁体耐性株の中には、トリプトファンの含有量は高くて
も、インドールアルカロイドの含量はそれぞれ高くない
株が含まれており、耐性株のインドールアルカロイド生
産速度を測定し、これらの中からアルカロイド高生産株
をさらに選抜する必要かある。しかし、高生産株の頻度
は従来の小細胞塊を無作為に分離・増殖させる方法に比
へて、大幅に高くなっており、選抜の効率を高めること
か可能となる。

本発明に係る方法を用いて耐性株を選抜するためには、
培養細胞では従来から行われている小細胞塊選抜法を、
また植物組織又は器官の場合にはこれに準拠した方法を
用いることができる。

すなわち、培養細胞を用いる場合には、カルスや液体培
養細胞から、切断、濾過、遠心分離なとの方法によって
得られる、細胞塊あるいは単細胞あるいはそれらの混合
物を、トリプトファン構造類縁体を含む培地に移植し培
養する方法か例示される。また、組織あるいは器官の場
合には、切断などの方法によって得られる一部、たとえ
ば板端、茎頂などの前記と同様に用いる方法か例示され
る。

さらに、細胞、組織または器官から適当な酵素処理によ
って得られるプロトプラストも、選抜用の材料として用
いることかできる。

本発明に係る方法でインドールアルカロイド高生産株を
選抜するには、適当な濃度でトリプトファン構造類縁体
を含む植物組織培養用培地に寒天なとの固化剤を添加し
て得られる固型培地に、細胞や組織片などを移植して培
養を行い、増殖してくる細胞や組織を前記と同組成の新
しい培地に移植してさらに培養を行う。こうしてトリプ
トファン処理培養を数回繰り返して得られる細胞や組織
を通常の組成の培地へ移植して継代培養し、一部をとっ
てアルカロイドを分析し、生産性の高い細胞や組織を高
生産株として選抜する。

得られたインドールアルカロイド高生産株として生産能
力の最も高かった株（１，８〜２．　Ｏｄｗ）を使用し
該高生産株の培養細胞Ｒ２−１１を微工研菌寄第１１４
８５号として寄託した。

本発明方法によって得られるインドールアルカロイドと
しては、カサランチン、アジマリシン、セルベンチン、
アンヒドロビンブラスチン、ビンブラスチン、ビンクリ
スチン等が例示される。

本発明方法て得られるインドールアルカロイドを含有す
る培養組織又は培養細胞から、インドールアルカロイド
を分離する方法としては、メタノール等の有機溶媒によ
る抽出かある。

本発明の組織培養の好ましい一例としては、次の方法が
挙げられる。

先ずニチニチソウ属に属する植物の植物体、例えば根、
生長点、葉、茎、種子などから採取される組織片を殺菌
処理後、寒天で固めたムラシゲ・スクーグの固体培地上
に置床し、１０〜３５°Ｃて７〜３０日程度経過後、組
織片の一部をカルス化させる。

このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速
度が漸次高まり安定化したカルスか得られる。二〇カル
スを増殖に適した液体培地、例えはムラシゲ・スクーグ
の液体培地に移して増殖させる。液体培地においてさら
に生育速度が高められ安定化した細胞を本発明の選抜法
に供する。

本発明の選抜における培養温度としては、通常は、約１
０ないし約３５°Ｃ１この中でも特に約２３ないし約２
８°Ｃが好適であり、該温度を約１０°Ｃ未満にすると
カルスの増殖速度は小さく、また該温度を３５°Ｃ以上
にしたときも同様にカルスの増殖速度は小さくなる。本
発明の組織培養を行うに当たっては、光は必ずしも必要
ではないか、光の照射はカサランチン等のインドールア
ルカロイドの生成を妨げない。

本発明の方法においては、培地に液体培地を用いた場合
には培養終了後カルスをデカンテーションあるいは濾過
等の方法によって培地から分離し、次に該カルスから目
的とするカサランチン等のインドールアルカロイドを有
機溶媒による抽圧等の方法によって分離することかでき
る。

本発明で得られた細胞や組織は通常の組織培養法を用い
て、アルカロイド生産能力を保持させたまま増殖させる
ことかできる。

本発明の方法は、液体培地を用いるとタンク等を利用し
た大量培養が可能である。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１ ナフタレン酢酸、及びカイネチン濃度かそれぞれ１　ｐ
ｐｍ、　０．　ｌｐｐｍになるように添加したムラシゲ
・スクーグの寒天培地（寒天１重量％）に、前もって２
％アンチホルミン溶液あるいは７０％エタノール溶液等
て滅菌処理したニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕ
ｓ　ｒｏｓｅｕｓ　ｖａｒ、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈ
ｔ、マダカスガル原産）の朽の一部を置床し、２５°Ｃ
て暗所にて静置培養してニチニチソウのカルスを得た。

次にこのニチニチソウのカルスを、上記と同様の条件で
、ムラシゲ・スクーグの液体培地で７日毎に植えつぎ、
ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ａｍ、　
１０１００ｒｐ　Ｌ／て、該カルスの生育速度を速め、
安定化したニチニチソウ細胞を得た。

このようにして得られた細胞を減圧濾過によって培地か
ら分離し、このうち０．１ｇ新鮮重を、５０μＭの５−
メチルトリプトファンを含む前記培地（直径９ｃｍのシ
ャーレ中で、１．０％寒天を用いて固化させた）の表面
に均一に広げた。２５°Ｃ１暗所で１ケ月間静置培養し
、増殖してきた細胞塊を、同濃度の５−メチルトリプト
ファンを含む同様の組成の寒天培地に移植し、さらに１
ケ月間培養を行い、この培養細胞中から５−メチルトリ
プトファンに対する耐性株を選抜し、該薬剤耐性株中か
らインドールアルカロイド高生産株を選抜した。

こうして得られた１８種類の株を、５−メチルトリプト
ファンを含まない前記と同組成の液体培地に０．７ｇ新
鮮重／２０イ培地の割合で移植し、前記と同様の条件て
振盪培養した。１週間の間隔て、５メチルトリプトフア
ンを含まない液体培地に移植し、さらに培養を続けた。

このようにして液体培養を２回繰り返した後、細胞の一
部を濾過によって回収し、４０°Ｃてｌ昼夜乾燥した後
、この乾燥細胞からカサランチン等のインドールアルカ
ロイドをメタノールを用いて抽出し、高速液体クロマト
グラフィーを用いて、標準品と比較定量することによっ
て測定した。各棟のインドールアルカロイド含有量（カ
サランチンとアジマリシンの合計）は０〜０．２％ｄｗ
が１株、０．２〜０．４％ｄｗか２株、０．４〜０．６
％ｄｗか４株、０．６〜０．８％ｄＷか６株、０．８〜
１．０％ｄｗか２株、１．２〜１，４％ｄｗか１株、１
．４〜１．６％ｄｗが１株、１．８〜２．０％ｄｗか１
株であり、その度数分布を第１図に示した。生産能力の
最も高かった株（１，８〜２．０％ｄｗの株）の培養細
胞Ｒ２−１１を微工研菌寄第１１４８５号として寄託し
、該高生産株の培養結果を第１表に示した。

比較例１ 実施例１において、選抜を行うために寒天培地上で小細
胞塊を増殖させる際に、５−メチルｌ−ＩＪブトファン
が含まれていないことを除けば、すべて実施例１と同様
に行った。得られた株（３４株）のアルカロイド含有量
は０．２〜０．４％ｄｗか７株、０．４〜０．６％ｄｗ
か９株、０．６〜０．８％ｄｗか１４株、０．８〜１゜
０％ｄｗが２株、１．０〜１，２％ｄｗか２株であり、
その度数分布を第２図に示した。

った株（１，０〜１．２％ｄｗの株） に示した。

第１表 生産能力の最も高か の培養結果を第１表 培養期間：１日 実施例１　　　　１７．０　　　２３０　　　　１００
本願実施例では比較例よりもインドールアルカロイド生
産能力の高い株（１，２〜１．４％ｄｗが１株、１．４
〜１．６％ｄｗか１株、１．８〜２．０％ｄｗか１株）
を得ることかできた。

〔発明の効果〕

本発明の組織培養によるインドールアルカロイドの生産
方法を用いれば、従来法に比ベカサランチン、アジマリ
シン等のインドールアルカロイドを効率良く大量に生産
することかできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本願実施例のインドールアルカロイド高生産株
のインドールアルカロイド含有量の度数分布を示す図、
第２図は比較例のインドールアルカロイド含有量の度数
分布を示す図である。 出願人　三井石油化学工業株式会社 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　貞　次 ０．４　　　０．８ １．２ ２．０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、インドールアルカロイド生産能力を有する植物の培
   養細胞、組織又は器官をトリプトファン構造類縁体含有
   培地中で培養し、該培養細胞、組織又は器官中から上記
   トリプトファン構造類縁体に対する耐性株を選抜し、イ
   ンドールアルカロイド高生産株を得ることを特徴とする
   インドールアルカロイド高生産株の取得方法。 ２、植物がニチニチソウ属植物であることを特徴とする
   請求項１記載の取得方法。 ３、トリプトファンの構造類縁体が５−メチルトリプト
   ファンであることを特徴とする請求項１または２記載の
   取得方法。 ４、トリプトファンの構造類縁体の使用量が、植物の培
   養細胞、組織又は器官１ｇ新鮮重に対して、０．１ｍｇ
   から２００ｍｇの範囲にあることを特徴とする請求項１
   〜３記載の取得方法。 ５、植物培養細胞、組織又は器官を培養する培地が同型
   培地であることを特徴とする請求項１〜４記載の取得方
   法。 ６、インドールアルカロイドがカサランチン及び／又は
   アジマリシンであることを特徴とする請求項１〜５記載
   のインドールアルカロイド高生産株の取得方法。