JPH02124098A - インドールアルカロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はニチニチソウ属植物等のインドールアルカロイ
ドを代謝産生ずる植物の組織を特定の培地を用いて組織
培養することにより、インドールアルカロイド、例えば
抗腫瘍剤ビンブラスチンの製造原料として用いられるカ
サランチンや循環器系治療薬として需要のあるアジマリ
シンを生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

ニチニチソウ属植物に見出されるインドールアルカロイ
ドであるカサランチンは抗腫瘍剤ビンクリスチンの原料
として、又アジマリシンは循環器系治療薬として、それ
ぞれ商業的に重要な関心が寄せられている。これらの化
合物は天然の植物体中から採取されているが天然物を原
料としているため、その生産が天候に左右されること、
収穫期が限定されることなどにより、必ずしも市場に安
定供給されないことが問題となっている。その為これら
の化合物を植物の組織培養で生産する研究が数多く行な
われている。たとえばプラント・セル・　レポート（Ｐ
ｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ６．１４２−１４
５（１９８７）　）には、植物ホルモンとしてｌ−ナフ
タレン酢酸（ＮＡＡ）及びカイネチンを含有させたＭｕ
ｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇの液体培地に硫酸バナジルを
添加すると、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ
　ｒｏｓｅｕｓ）カルスで、カサランチン収量は３５．
８ｍｇ／　１、アジマリシン収量は１４．３ｍｇ／　ｌ
まで向上したと述べである。しかしながら、工業的見地
からはその生産性を更に高めることが望まれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

従ってこの様な組織培養により、インドールアルカロイ
ドの工業的生産を目指す場合、生産性の向上が重要な課
題となる。本発明者等は、かかる現状から、二次代謝産
物としてカサランチン、アジマリシン等のインドールア
ルカロイドを効率良く生産するニチニチソウ属植物等の
植物の組織培養方法を検討した。又、分離・精製が容易
となる様、カサランチンとアジマリシンの収量比を変え
ることも合わせて検討を行なった。

〔課題を解決するための手段〕

インドールアルカロイドを産生ずる植物のＭｉ織を、リ
ン酸を特定の濃度で含有する培地で培養を行うと、培養
組織中のインドールアルカロイドの含量が向上すること
、また得られるインドールアルカロイド中のアジマリシ
ンに対するカサランチン収量の比率が変わることを見出
し、本発明を完成するに到った。即ち本発明によれば、
インドールアルカロイドを産生ずる植物の組織をリン酸
濃度が１．５ｍＭ以上或いは１ｍＭ以下である培地を用
いて組織培養を行い、インドールアルカロイドを効率良
く生産することを特徴とするインドールアルカロイドの
生産方法が提供される。

本発明の組織培養では、インドールアルカロイドを産生
ずる植物を用いて行われるが、該当する植物として具体
的には、ニチニチソウ属植物のリトル・プライト・アイ
品種（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓｖａｒ
、　Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈｔ　Ｅｙｅ）　、ジー・
トン品種（Ｃ。

ｒｏｓｅｕｓ　Ｇ、Ｄｏｎ）、リトル・デリカタ品種（
Ｃ，ｒｏｓｅｕｓＣシル１ｔｌｌｅ　Ｄｅｌｉｃａｔａ
）等を例示することができる。

本発明で使用される培地におけるリン酸濃度は、インド
ールアルカロイドのうち特にカサランチンの収量を高め
るには１，５ｎ＋Ｍ以上、好ましくは１．５ｍＭ〜７ｍ
Ｍであり、特にアジマリシンの収量を高めるには１ｍＭ
以下、好ましくは０．２　ｍＭ〜１．０　ｍＭである。

培地中のリン酸濃度を上記のようにするためには、リン
酸１カリウム、リン酸２カリウム、リン酸１ナトリウム
、リン酸２ナトリウムなどが用いられる。

本発明で使用される培地はリン酸を上記濃度含有し、他
の無機成分及び炭素源を必須成分とし、これに植物ホル
モン類、ビタミン類を添加し、更に必要に応じてアミノ
酸類を添加した培地である。

他の無機成分としては、窒素、カリウム、カルシウム、
マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、
銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト
等があり、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、
硝酸カルシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸
マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二
鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブ
デン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム
、塩化コバルトなどが例示される。

また炭素源には、ショ糖等の炭化水素、その誘導体、脂
肪酸等の有機酸、エタノール等の１級アルコールなどが
例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフ
タレン酢酸（ＮＡＡ）　、ｐ−クロロフェノキシイソ酪
酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）な
どのオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼ
アチン等のサイトカイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ、）
、ピリドキシン（ビタミンＲ５）、パントテン酸、アス
コルビン酸（ビタミンＣＬイノシトール、ニコチン酸な
どが例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
スティンなどがある。

本発明の前記培地では、通常はリン酸以外の無機成分を
約０．１μ門ないし約１００ｍＭ、炭素源を約１ｇ／！
ないし約３０ｇ／　４２、植物ホルモン類を約０．０１
μ門ないし約１０μ門、ビタミン類及びアミノ酸類をそ
れぞれ約０．１ｍｇ／ｆｆないし約１００ｍｇ／　４２
程度の濃度が用いられる。

本発明の組織培養に用いられる前記培地として具体的に
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えば、ムラシゲ・スクーグ（１９６２）　（Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培地、リンスマ
イヤー・スクーグ（１９６５年）　（Ｌｉｎｓｍａｉｅ
ｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培地、ホワイト（１９５４年）
　　（Ｗｈｉｔｅ）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒ
ｇ〕の８−５培地、三井のＭ−９培地　等に前記した炭
素源及び植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記
したビタミン類、アミノ酸類を添加して調製される培地
を例示できるが、本発明ではこの中でも特にムラシゲ・
スクーグの培地を用いて調製される培地が好ましい。

本発明で使用される前期培地は液体培地又は寒天やゼラ
チン等を通常０．５〜１ｌ％含有させた固型培地である
が本発明では通常液体培地が好ましい。

本発明の組織培養においては、前記植物の根、生長点、
葉、茎、種子、花粉、朽、かく等の組織片あるいは細胞
、又はこれらを本発明に係わる培地あるいは他の従来の
培地によって組織培養して得た培養細胞あるいは培養組
織あるいはプラスミドの導入によって形質転換したクラ
ウンゴール組織を使用することができる。これらの組織
又は細胞を本発明に係る培地を用いて組織培養し、カサ
ランチン等のインドールアルカロイドを多量含んだ培＃
組織又は培養細胞を得る。

本発明方法によって得られるインドールアルカロイドと
しては、カサランチン、アジマリシン、セルペンチン、
アンヒドロビンブラスチン、ビンブラスチン、ビンクリ
スチン等が例示される。

本発明方法で得られるインドールアルカロイドを含有す
る培養Ｍｉ織又は培養細胞から、インドールアルカロイ
ドを分離する方法としては、メタノール等の有機溶媒に
よる抽出がある。

本発明の組１３培養の好ましい一例としては、次の方法
が挙げられる。

先ずニチニチソウ属に属する植物の植物体、例えば根、
生長点、葉、茎、種子などから採取されるＭｉ織片を殺
菌処理後、寒天で固めたムラシゲ・スクーグの固体培地
上に置床し、１０〜３５°Ｃで７〜３０日程度経過後、
Ｍｉ織片の一部をカルス化させる。

このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速
度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。このカル
スを増殖に適した液体培地、例えばムラシゲ・スクーグ
の液体培地に移して増殖させる。液体培地においてさら
に生育速度が高められ、安定化したカルスを本発明の液
体培地に添加して培養する。

上記方法において、液体培地中のカルスの初期濃度は、
液体培地１！に対して、約８０ｇ〜約１５０ｇ（新鮮重
量）程度添加することが望ましい。

本発明の組織培養における培養温度としては、通常は、
約１０ないし約３５°Ｃ１この中でも特に約２３ないし
約２８°Ｃが好適であり、該温度を約１０°Ｃ未満にす
るとカルスの増殖速度は小さく、また該温度を３５°Ｃ
以上にしたときも同様にカルスの増殖速度は小さくなる
。本発明の組織培養を行うに当たっては、光は必ずしも
必要ではないが、光の照射はカサランチン等のインドー
ルアルカロイドの生成を妨げない。

本発明の方法においては、培地に液体培地を用いた場合
には培養終了後カルスをデカンテーションあるいは濾過
等の方法によって培地から分離し、次に該カルスから目
的とするカサランチン等のインドールアルカロイドを有
機溶媒による抽出等の方法によって分離することができ
る。

本発明の方法は、液体培地を用いるとタンク等を利用し
た大量培養が可能である。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１，２，３，４．５．６及び７ ナフタレン酢酸、及びカイネチン濃度がそれぞれ１　ｐ
ｐｍ、　０．１ｐｐｒｒｌになるように添加したムラシ
ゲ・スクーグの寒天培地（寒天１重量％）に、前もって
２％アンチホルミン）８液あるいは７０％エタノール溶
液等で滅菌処理したニチニチソウ　（Ｃａｔｈａ−ｒａ
ｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ　ｖａｒ、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂ
ｒｉｇｈｔ、マダカスガル原産）の朽の一部を置床し、
２５°Ｃで暗所にて静置培養してニチニチソウのカルス
を得た。次にこのニチニチソウのカルスを、上記と同様
の条件で、ムラシゲ・スクーグの液体培地で７日毎に植
えつぎ、ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５
ｍｍ、　１０１００ｒｐ　して、該カルスの生育速度を
速め、安定化したニチニチソウカルスを得た。

この様にしｔ得られた培養細胞２．１ｇ（新鮮型）をナ
フタレン酢酸１　ｐｐｍ＋　　カイネチン０．１　ｐｐ
ｍ濃度になる様に添加し、リン酸濃度がそれぞれ０．１
゜０．２５．０．６５．２．６．３．９．５．２．１０
ｍＭであるムラシゲ・スクーグの液体培地２０ｍ１を含
む１０〇−容三角フラスコに移し、７日間振とう培養し
た。

培養後のニチニチソウカルスは濾過により採取し、４０
°Ｃで１夜風乾したのちその乾燥重量を測定し、液体培
地１ｌ当たりに換算した培養細胞の生育重量を求めた。

カサランチン等のインドールアルカロイドは、得られた
乾燥カルスをメタノール等を用いて抽出し、高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて、標準品と比較定量すること
によって測定した。結果を表１に示す。

比較例１ 実施例１においてリン酸濃度を１．２５ｍＭ　（通常の
ムラシゲ・スクーグ培地の濃度）にした以外は該実施例
と同様に行なった。結果を表１に示す。

表 比較例１　　　１．２５　　　１８０　　　　１３７実
施例１　　　０．１　　　　１５４　　　　１４５〃２
　　　　　０．２５　　　　　１８５　　　　　　　１
８０〃３　　　　０．６５　　　　　１９０　　　　　
　１８４〃４　　　　　２．６　　　　　　２６０　　
　　　　　１４０〃５　　　　　３．９　　　　　　２
２０　　　　　　　１４０〃６　　　　　５．２　　　
　　　１６８　　　　　　　９８〃７　　　　１０．０
　　　　　　９８　　　　　　　６８〔発明の効果〕 本発明の組織培養によるインドールアルカロイドの生産
方法を用いれば、従来法に比ベカサランチン、アジマリ
シン等のインドールアルカロイドを効率良く大量に生産
することができる。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）インドールアルカロイドを産生する植物の組織を
   、リン酸濃度が１．５ｍＭ以上である培地を用いて組織
   培養してインドールアルカロイドを生産することを特徴
   とするインドールアルカロイドの生産方法。
2. （２）リン酸濃度が１．５ｍＭないし７ｍＭであること
   を特徴とする請求項１記載の生産方法。
3. （３）植物組織の初期濃度が１ｌあたり約８０ｇないし
   約１５０ｇ（新鮮重）であることを特徴とする請求項１
   又は２記載の生産方法。
4. （４）インドールアルカロイドを産生する植物がニチニ
   チソウ属植物であることを特徴とする請求項１〜３のい
   ずれかの項記載の生産方法。
5. （５）インドールアルカロイドを産生する植物の組織を
   、リン酸濃度が１ｍＭ以下である液体培地を用いて組織
   培養してインドールアルカロイドを生産することを特徴
   とするインドールアルカロイドの生産方法。
6. （６）インドールアルカロイドがアジマリシンであるこ
   とを特徴とする請求項５記載の生産方法。
7. （７）リン酸濃度が０．２ｍＭないし１ｍＭであること
   を特徴とする請求項５又は６記載の生産方法。
8. （８）植物組織の初期濃度が１ｌあたり約８０ｇないし
   約１５０ｇ（新鮮重）であることを特徴とする請求項５
   〜７のいずれかの項記載の生産方法。
9. （９）インドールアルカロイドを産生する植物がニチニ
   チソウ属植物であることを特徴とする請求項５〜８のい
   ずれかの項記載の生産方法。