JPH03224480A - ニチニチソウ属植物の組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明はニチニチソウ属植物の組織を特定の培養環境に
おいて組織培養することにより、インドールアルカロイ
ド、例えば抗潰瘍剤ビンブラスチンの製造原料として用
いられるカサランチンや循環器系治療薬として需要のあ
るアジマリシンを生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

ニチニチソウ属植物に見出されるインドールアルカロイ
ドであるカサランチンは、抗腫瘍剤ビンクリスチンの原
料としては、またアジマリシンは循環器系治療薬として
、それぞれ商業的に重要な関心が寄せられている。これ
らの化合物は天然の植物体中から採取されているが、天
然物を原料としているため、その生産が天候に左右され
ること、収穫期が限定されることなどにより、必ずしも
市場に安定供給されないことが問題となっている。

その為これらの化合物を植物の組織培養で生産する研究
が数多く行われている。たとえばプラント・セル・レポ
ート（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉ、　
１４２−１４５　（１９８７））には、植物ホルモンと
して１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及びカイネチンを含
有させたＭｕｒａｓｈｉｇｃｒ　＆　Ｓｋｏｏｇの液体
培地に硫酸バナジルを添加すると、ニチニチソウ（Ｃａ
ｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ）カルスで、カサ
ランチン収量は３５．８■／２、アジマリシン収量は１
４゜３■／ｉまで向上したと述べられている。しかしな
がら、工業的検知からはその生産性を更に高めることが
望まれている。

（発明が解決しようとする課題〕 従ってこの様な組織培養により、インドールアルカロイ
ドの工業的生産を目指す場合、生産性の向上が重要な課
題となる０本発明者らは、かがる現状から、二次代謝産
物としてカサランチン、アジマリシン等のインドールア
ルカロイドを効率良く生産しうるニチニチソウ属植物等
の植物の組織培養方法を検討した。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、インドールアルカロイドを産生ずるため
の植物の組織を、液体培地を用いて培養するに当たって
、培地中の溶存酸素濃度を５ないし４０ｐｐ−にするこ
とによって、培養組織中のインドールアルカロイドの含
量が向上することを見い出し、本発明を完成するに到っ
た。即ち、本発明によれば、インドールアルカロイドを
産生ずる植物の組織を、溶存酸素濃度が５ｐｐ−以上の
培地を用いて組織培養行い、インドールアルカロイドを
生産することを特徴とするインドールアルカロイドの生
産方法が提供される。

本発明の組織培養は、ニチニチソウ属の植物を用いて行
われるが、該当する植物として具体的には、ニチニチソ
ウ属植物のリトル・ブライト・アイ品種（Ｃａｔｈａｒ
ａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ　ｖａｒ、　Ｌｉｔｔｌｅ
Ｂｒｉｇｈｔ　Ｅｙｅ）、ジー・トン品種（Ｃ，ｒｏｓ
ｅｕｓ　Ｇ、Ｄｏｎ）、リトル・デリカタ品種（Ｃ，ｒ
ｏｓｅｕｓ　ｃｖ、　ＬｉｔｔｌｅＤｅｌｉｃａｔａ）
等を例示することができる。

本発明で使用される培地は、炭素源および無機成分を必
須とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、
更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地である。

本発明においては、培地中の溶存酸素を一定の濃度以上
に保つことが必要であり、培地中の溶存酸素濃度は一般
に５〜４０ｐｐ−である。

本発明に用いる培地の炭素源としては、蔗糖等の炭水化
物とその誘導体、脂肪酸等の有機酸およびグリセリンな
どの糖アルコールなどを例示できる。

無機成分としては、例えばリン、窒素、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、
ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、
コバルト等があり、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナト
リウム、硝酸カルシウム、塩化カリウム、リン酸１水素
カリウム、リン酸２水素カリウム、塩化カルシウム、硫
酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第
二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリ
ブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウ
ム、塩化コバルトなどが例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフ
タレン酢酸（ＮＡＡ）、Ｐ−クロロフェノキシイソ酢酸
、２，４−ジクロロフエノシキ酢酸（２，４−Ｄ）など
のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼア
チン等のサイトカイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ＋）
、ピリドキシン（ビタミンＢ、）、パントテン酸、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン酸
などが例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
スティンなどがある。

本発明の前記培地では、無機成分が約０．１μ門ないし
約１００ｍＭ、炭素源が約１ｇ／ｊ！ないし約３０ｇ／
ｌ、植物ホルモン類が約０．０１μ門ないし約ｌＯμｉ
、ビタミン類およびアミノ酸類がそれぞれ約０．１■／
ｌないし約１００■／！てんどの濃度で用いられる。

本発明の組織培養に用いられる前記培地として具体的に
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ（１９６２年）　（Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培地、リンスマ
イヤー・スクーグ（１９６５年）　（Ｌｉｎｓｍａｉｅ
ｒ　Ｓｋｏｏｇ）の培地、ホワイト　（１９５４年）　
（Ｗｈｉｔｅ）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）
のＢ−５培地、三井のト９培地等に、前記した炭素源及
び植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記したビ
タミン類、アミノ酸類を添加して調製される培地を例示
できるが、本発明ではこの中でも特にムラシゲ・スクー
グの培地を用いて調製される培地が好ましい。

本発明では前記した液体培地を用いてニチニチソウ属植
物の組織培養を行うことによりインドールアルカロイド
が生産されるが、この場合、本発明では培地の溶存酸素
濃度が通常５ないし４０ｐｐｍ、好ましくは８ないし２
０ｐｐａ＋となるようにして組織培養が行われる。溶存
酸素濃度が通常５　ｐｐｍよりも低い場合には、ニチニ
チソウ属の培養細胞によるインドールアルカロイドの生
産量が低下するので好ましくない。培地の溶存酸素濃度
を本発明で行われる前記濃度範囲にする方法としては、
例えば以下に示す方法を採用できる。すなわち、通常１
０ないし３５°Ｃで組織培養が行われる液体培地におい
て、該培地に接触する酸素含有ガスの酸素分圧を通常１
８０ｍｍＨｇ以上、好ましくは２００ｍｍＨｇないし７
６０ｎｕｎＨｇにして、この酸素含有ガスと培地を適宜
の方法によって接触させることにより、培地の溶存酸素
濃度を前記範囲にすることができる。この場合の酸素含
有ガスとしては、具体的にはチッ素等の不活性成分を含
んだ種々の酸素濃度を有するガスや純酸素ガスを例示で
きる。酸素含有ガスとして空気を大気圧以下で培地と接
触させる方法は従来の組織培養において採用された方法
であって、この方法では植物組織の呼吸によって培地の
溶存酸素が消費されるために、培地中の溶存酸素を５ｐ
ｐｍ以上にすることが困難である。培地の溶存濃度が５
　ｐｐｍより低くても組織の増殖は可能であるが、組織
に十分な酸素が供給されなくなり、アルカロイドの生産
量は少ないので好ましくない。本発明では必要に応じて
酸素含有ガスとして空気を用いることもでき、この場合
には該ガスを加圧することによって系内の全圧を高くし
てガス中の酸素分圧を前記範囲にすることによって、培
地の溶存酸素濃度を本発明の範囲にすることができる。

大気圧下で組織培養を行う場合には、純酸素ガスを使用
しても培地の溶存酸素濃度は通常４０ｐｐｍ程度にしか
高まらないため、更に酸素濃度を高めたい場合には通常
知られている適宜方法によって加圧した系で組織培養を
行う方法が採用される。要するに本発明では、状況に応
じて酸素含有ガス中の酸素分圧を適宜選ぶことによって
、培地の溶存酸素濃度を前記範囲にして培養が行われる
。

本発明では酸素含有ガスと培地を接触させる方法として
は特にどのような方法を用いなければならないというこ
とは無く、通常知られているどのような方法でも採用で
きる。そして該接触方法として具体的には、例えば液体
培地中に置かれた多数の孔を有するガス分散器を介して
培地中に酸素含有ガスを放出させる通気培養方法、ある
いはシリコン、テフロン等の特殊な材料から作られた酸
素透過性の膜からできた任意形状のガス送入部を培地と
接触させ、この膜を介して培地中に酸素を供給する方法
などを例示できる。酸素透過性の膜を用いる方法では、
通気培養のときのような激しい気泡の発生も無く、培養
物に好ましくない外力をかけないようにすることができ
るので一層好ましい。

培地の溶存酸素濃度を測定する方法としては、例えば以
下に示すような方法がある。

カルバニックセル型の酸素電極を用いて溶存酸素濃度に
比例して発生する電流を測定し、所定の溶存酸素濃度に
対応する電流以上になると自動的に供給酸素量を減じ、
かつ該電流値以下の場合は自動的に供給量を増加せしめ
ることによって、培地の溶存酸素濃度を所定の値に維持
する方法である。

本発明で実施される組織培養においては、培養槽あるい
は培養装置については特にどのようなものを用いなけれ
ばならないということはなく、前記した本発明の要件を
満足できるものであれば任意のものを使用できる。本発
明では培地を、必要に応じて培養槽自体の振盪、旋回あ
るいは攪拌羽根等の手段によって攪拌しても良いし、ま
た静置しても良い。あるいは又本出願人が特開昭６１−
１３９３８１号によって提案した液体散布の方法、すな
わち液体培地を培養物の上方からシャワー状に散布する
ようにして培養する方法を採用することもできる。この
場合には液体培地を培養器とは別の所で酸素含有ガスと
接触させて培地の溶存酸素濃度を前記範囲に調整し、次
いでこの液体培地を培養器に挿入し、リサイクル使用す
る方法を例示できる。

本発明の組織培養においては、前記植物の根、生長点、
葉、茎、種子、花粉、朽、かく等の組織片又は細胞、あ
るいはこれらを本発明による培地又は他の従来の培地に
よって組織培養して得た培養細胞、あるいは不定根、苗
条などの培養組織あるいはプラスミドの導入によって形
質転換したクラウンゴール組織や毛状根組織を使用する
ことができる。これらの組織又は細胞を本発明による培
養方法を用いて組織培養することによって、カサランチ
ン等のインドールアルカロイドを多量含んだ培養組織又
は培養細胞が得られる。

本発明方法によって得られるインドールアルカロイドと
しては、カサランチン、アジマリシン、セルペンチン、
アンヒドロビンブラスチン、ビンブラスチン、ビンクリ
スチン等が例示される。

本発明方法で得られるインドールアルカロイドを含有す
る培養組織又は培養細胞から、インドールアルカロイド
を分離する方法としては、メタノール等の有機溶媒によ
る抽出がある。

本発明の組織培養の好ましい一例としては、次の方法が
挙げられる。

先ずニチニチソウ属に属する植物の植物体、例えば根、
生長点、葉、茎、種子などから採取される組織片を殺菌
処理し、寒天で固めたムラシゲ。

スクーグの固体培地上に置床し、１０〜３５°Ｃで７〜
３０日程度経過後、組織片の一部をカルス化させる。

このようにして得られたカルスを継代培養すると、生育
速度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。このカ
ルスを増殖に適した液体培地、例えばムラシゲ・スクー
グの液体培地に移して増殖させる。液体培地においてさ
らに生育速度が高められ、安定化したカルスを本発明の
液体培地に添加して培養する。

本発明の組織培養における培養温度としては、通常は約
１０ないし約３５°Ｃ１この中でも特に約２３ないし約
２８°Ｃが好適である。この温度を約１０°Ｃ未満にす
るとカルスの増殖速度は小さく、また該温度を３５°Ｃ
以上にしたときも同様にカルスの増殖速度は小さくなる
。本発明の組織培養を行うに当たっては、光は必ずしも
必要ではないが、光の照射はカサランチン等のインドー
ルアルカロイドの生成を妨げない。

本発明の方法においては、培地として液体培地を用いた
場合には、培養終了後カルスをデカンテーションあるい
は濾過等の方法によって培地から分離し、次に該カルス
から目的とするカサランチン等のインドールあるかろい
ど有機溶媒による抽出等の方法によって分離することが
できる。

本発明の方法は、液体培地を用いるとタンク等を利用し
た大量培養が可能である。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例及び比較例によって更に具
体的に説明する。

ナフタレン酢酸、及びカイネチン濃度がそれぞれ１＋）
ｐｍ、　０．ｌｐｐｍになるように添加したムラシゲ・
スクーグの寒天培地（寒天１重量％）に、前もって２％
アンチホルミン溶液あるいは７０％エタノール溶液等で
滅菌処理したニチニチソウ（Ｃａｔｈａ−ｒａｎｔｈｕ
ｓ　ｒｏｓｅｕｓ　ｖａｒ、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈ
ｔ、マダカスガル原産）の豹の一部を置床し、２５°Ｃ
で暗所にて静置培養してニチニチソウのカルスを得た。

次にこのニチニチソウのカルスを、上記と同様の条件で
、ムラシゲ・スクーグの液体培地で７日毎に植えつぎ、
ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、　
１０１００ｒｐ　　して、該カルスの生育速度を速め、
安定化したニチニチソウカルスを得た。

この様にして得られた培養細胞６０ｇ（新鮮型）を、上
記液体培地に消泡剤（東芝シリコーン、ＴＳＡ　Ｔ３４
１）　６０ｐｐｍを添加した液体培地１．７１を含むガ
ラス製培養槽（第１図）に移植し、２５°Ｃ９暗所９通
気速度０．０５〜０．１ｖｖｍ、攪拌速度３０ｒｐｍで
７日間通気攪拌培養を行った。その際、溶存酸素濃度を
実施例１〜６では第１表に示すように５〜４０ｐｐｍに
変化させ、比較例１及び２では１　ｐｐｍ又は２ｐｐｍ
とした。

第１図において、１はガラス製培養槽、２は通気用ガラ
ス製多孔板、３は攪拌翼、４は溶存酸素電極、５は溶存
酸素電極アンプ及び制御部、６は電磁弁、７は酸素給気
ライン、８は空気給気ライン、９は排気ラインである。

培養後のニチニチソウカルスを濾過により採取し、４０
°Ｃで１夜風乾したのちその乾燥重量を測定し、液体培
地１！当たりに換算した培養細胞の生育重量を求めた。

カサランチン等のインドールアルカロイドは、得られた
乾燥カルスをメタノール等を用いて抽８し、高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて、標準品と比較定量すること
によって測定した。得られた結果を第１表にまとめて示
す。

実施例Ｌ　　２，３，４，５，６．７ 実施例１において溶存酸素濃度がそれぞれ５゜８、１２
．１６．２０．３０．４０ｐｐｍにした以外は先の実験
と同様に行った、結果を第１表に示す。

第１表 比較例１ 比較例２ 実施例１ 実施例２ 実施例３ 実施例４ 実施例５ 実施例６ 実施例７ １　　　　　４６ ５１ ５　　　　　８２ ８　　　　　１４０ １２　　　　　１３９ １６　　　　　１５１ ２０　　　　　１４８ ３０　　　　　１４０ ４０　　　　　１３３ ２０．１ ２０．０ １８．３ １７．４ １５．７ １５．５ １５．４ １５．４ １５．０ 〔発明の効果〕 本発明の組織培養によるインドールアルカロイドの生産
方法を用いれば、従来法に比べてカサランチン、アジマ
リシン等のインドールアルカロイドを効率良く大量に生
産することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の組織培養方法を実施するための装置の
一例を示す概略図であって、１はガラス製培養槽、２は
通気用ガラス製多孔板、３は攪拌翼、４は溶存酸素電極
、５は溶存酸素電極アンプ及び制郭部、６は電磁弁、７
は酸素給気ライン、８は空気給気ライン、９は排気ライ
ンである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ニチニチソウ属植物を液体培地を用いて組織培養するに
   当り、該培地の溶存酸素濃度を５ないし４０ｐｐｍにし
   てインドールアルカロイドを生産することを特徴とする
   、ニチニチソウ属植物の組織培養方法。