JPH0246295A - 生理活性物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ニチニチソウ属植物の組織培養により生理活
性物質を製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

ニチニチソウ属植物のカサランサス・ロゼウス（Ｃａｔ
ｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ）中に見出される多
数の天然アルカロイドは抗腫瘍剤であることが認められ
ている。商業的に最も関心が寄せられているのが、癌の
治療に受は入れられているビンクリスチン及びビンブラ
スチンである。

ビンブラスチン及びビンクリスチンの両者は現在植物か
らの抽出により得られており、この場合、薬剤を抽出す
る前に植物を収穫し乾燥しなければならない。植物抽出
物は複雑であり（２００種類以上の異なるアルカロイド
を含有する）、そして目的とするアルカロイドの濃度が
低い（ビンブラスチンについては乾燥重量の０．０００
３％）ために抽出工程は複雑で煩雑であり、そして高価
であり、有利な方法とは言えない。

そこでこれに代わる方法として、例えば、プランタ・メ
ゾイカ　（Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ）第５４巻１３
６〜１４０頁（１９８８年）に記載されているように、
前記抗腫瘍性アルカロイドの前駆体である、カサランチ
ンとビンドリンを西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて
カップリングさせ、アンヒドロビンブラスチンを得、さ
らにこれをビンブラスチンに変換する方法が提案されて
いる。この方法を用いるためには、本来ニチニチソウの
葉に含まれているカサランチンおよびビンドリンが不可
欠であるが、いずれも植物体中の含量が低い（約０．１
％以下）ために、それらの入手は容易ではない。特にカ
サランチンは葉にきわめて微量しか含まれていないため
に前記の西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる方法を実
施するに当って、大きな問題となっている。

そこでカサランチンの効率的な生産方法として、例えば
、プラント・セル・レポート（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＲ
ｅｐｏｒｔｓ）　４巻２５９〜２６２頁（１９８５年）
に記載されているように、ニチニチソウ属植物の組繊培
養方法が提案されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしこれら従来公知の組織培養方法においても、該方
法によって得られる培養細胞から生産される目的物のカ
サランチン等のインドールアルカロイドの収量は低いと
いう欠点がある。

かかる背景のもとに、本発明者等はニチニチソウ属植物
を組織培養する従来公知の方法を改良して、ビンブラス
チンおよびビンクリスチンの原料となるカサランチン等
のインドールアルカロイドを効率よく生産しうる組織培
養方法について鋭意検討した。

〔課題を解決するための手段〕

その結果、下記方法を採用すればカサランチン等のイン
ドールアルカロイドを多量に含有する培養細胞が得られ
ることを見出し、本発明を完成するに到った。

すなわち本発明は、ニチニチソウ属植物の組織培養によ
り、生理活性物質を製造するに当り、その培地成分に関
し、次の濃度条件、 （ａ）　　カルシウム濃度　　　　０〜１ｍＭ（ｂ）　
　亜鉛濃度　　　　　　　Ｏ〜１０μＭ（Ｃ）　　ヨウ
素濃度　　　　　　Ｏ〜２μＭ（ｄ）　　イノシトール
濃度　　　０．２〜２．０ｇ／ｆ（ｅ）　　ニコチン酸
濃度　　　　０〜０．３ｍｇ／ｌ（ｆ）　　ピリドキシ
ン濃度　　　０〜０．３■／Ｉ！。

（樽　グリシン濃度　　　　　０〜１■／Ｉｌのうちの
少なくとも１以上の条件を満たす培地を用いることを特
徴とする生理活性物質の製造方法に関する。

本発明で用いられる培地は、上記の成分の濃度がコント
ロールされている限り、他の成分を通常用いられる範囲
で広く変化させることができ、従来から植物の組繊培養
に用いられている培地を改変して用いることができる。

また本発明の組繊培養に用いられる培地としては無機成
分および炭素源を必須成分とし、これに植物ホルモン類
、ビタミン類およびアミノ酸類等から選ばれる少なくと
も１種類以上の成分を加えた培地があり、必要に応じて
その他の成分も併用される。

無機成分としては、窒素、リン、カリウム、カルシウム
、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素
、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバル
ト等があり、具体的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム
、硝酸カルシウム、リン酸１カリウム、リン酸２ナトリ
ウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マ
ンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナト
リウム、二酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバ
ルトなどが例示される。

また炭素源には、シー！糖等の炭化水素、その誘導体、
脂肪酸等の有機酸、エタノール等の１級アルコールなど
が例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフ
タレン酢酸（ＮＡＡ）　、Ｐ−クロロフェノキシイソ酪
酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）な
どのオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼ
アチン等のサイトカイニン類が例示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）
、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン酸
などが例示される。

アミノ酸類には、グリシン、アラニン、グルタミン、シ
スティンなどがある。

本発明においては、これらの成分のうち無機成分の（ａ
）カルシウム、［有］）亜鉛、（Ｃ）ヨウ素、ビタミン
類の（ｄ）イノシトール、（ｅ）ニコチン酸、（ｆ）ピ
リドキシンおよびアミノ酸類の（員グリシンから選ばれ
る少なくとも一成分の濃度を前記した範囲内にコントロ
ールすることが必要であり、とくに−成分のみならず、
二成分以上の濃度をコントロールすることが望ましく、
上記（ａ）〜（局のすべての成分の濃度をコントロール
することが最も望ましい。

ニチニチソウ属植物の組織培養において従来使用されて
いるムラシゲ・スクーグ培地、ゼンクのアルカロイド生
産用培地（Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ　４８＋　ｐｐ
２０〜２３　（１９８３）　Ｚｅｎｋ　ｅｔ　ａｌ、“
Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅａｎｄ　Ｉ
ｔｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ＋Ｂｅｒｌｉｎ　Ｈ
ｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　Ｎｅｕ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ２７〜
４３　（１９７７））におけるカルシウム、亜鉛、ヨウ
素、イノシトール、グリシン、ニコチン酸、ピリドキシ
ンの濃度は、カルシウム１．５〜３．０　ｍＭ、亜鉛１
４〜３０ｕＭ。

ヨウ素２．４〜５μＭ、イノシトール約１００ｍｇ／　
Ｉｔ、グリシン約２ｍｇ／　Ｊ！、ニコチン酸０．５〜
５．０ｍｇ／　４２、ピリドキシン約０．５ｍｇ／　ｌ
である。

本発明においては、培地中の種々の成分のうち、これら
の成分について前述のような特定の濃度とすることによ
りカサランチン等のインドールアルカロイドを効率よく
生産しうることを見出したものである。

本発明において培地中の上記（ａ）〜（匂以外の成分の
濃度は、広い範囲で変えることができる。通常は、無機
成分を約０．１μＭ〜約１００ｍＭ程度、炭素源を約１
ｇ／Ｉ！、〜３０ｇ／　１程度、さらに植物ホルモン類
を約０．０１μＭ〜約１０μ台程度、ビタミン類および
アミノ酸類をそれぞれ約０．１ｍｇ＃！〜約１００ｍｇ
／２程度とすることが行われる。

本発明で使用する培地は、固体培地でも液体培地でもよ
い。

本発明の方法においては、ニチニチソウ属植物は前述の
培地を用・いて組織培養される。この場合の組織培養の
方法について以下詳述する。

本発明の組織培養に用いられるニチニチソウ属に属する
植物としては、例えばニチニチソウのリトル・ブライト
・アイ品種（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ
ｖａｒ、　Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈｔ　Ｅｙｅ）　、
ジー・トン品種（Ｃ。

ｒｏｓｅｕｓ　Ｇ、Ｄｏｎ）　、リトル・デリカタ品種
（Ｃ，ｒｏｓｅｕｓｃｖ、　Ｌｉｔｔｌｅ　Ｄｅｌｉｃ
ａｔａ）などを挙げることができる。

本発明では前記植物の中でもニチニチソウ、リトル・プ
ライト・アイ品種を使用することが好ましい。

本発明の組織培養においては、上記植物の根、。

生長点、葉、茎、種子、花粉、朽、かく等の組織片ある
いは細胞、又はこれらを本発明に係わる培地あるいは他
の従来の培地によって組織培養して得た培養細胞あるい
は培養組織あるいはプラスミドの導入によって形質転換
したクラウンゴール組織を使用することができる。これ
らの組織又は細胞を本発明に係る培地を用いて組織培養
し、カサランチン等のインドールアルカロイドを多量含
んだ培養組織又は培養細胞を得る。

本発明方法によって得られるインドールアルカロイドと
しては、カサランチン、アジマリシン、セルペンチン、
アンヒドロビンブラスチン、ビンブラスチン、ビンクリ
スチン等が例示される。

本発明方法で得られるインドールアルカロイドを含有す
る培養組織又は培養細胞から、インドールアルカロイド
を分離する方法としては、メタノール等の有機溶媒によ
る抽出がある。

本発明の組織培養の好ましい一例としては、次の方法が
挙げられる。

先ずニチニチソウ属に属する植物の植物体、例えば根、
生長点、葉、茎、種子などから採取される組織片を殺菌
処理後、寒天で固めたムラシゲ・スクーグの固体培地上
に置床し、１０〜３５°Ｃで７〜３０日程度経過後、組
織片の一部をカルス化させる。

このようにして得られたカルスを継代培養すると生育速
度が漸次高まり安定化したカルスが得られる。このカル
スを増殖に適した液体培地、例えばムラシゲ・スクーグ
の液体培地に移して増殖させる。液体培地においてさら
に生育速度が高められ、安定化したカルスを本発明の液
体培地に添加して培養する。

上記方法において、液体培地中のカルスの初期濃度は、
広い範囲で変えることができる。通常は液体培地１２に
対して、カルスを約１ｇ〜約２００ｇ（新鮮重量）程度
添加することが望ましい。

本発明の組織培養における培養温度としては、通常は、
約１０ないし約３５°Ｃ２この中でも特に約２３ないし
約２８゛Ｃが好適であり、該温度を約１０°Ｃ未満にす
るとカルスの増殖速度は小さく、また該温度を３５°Ｃ
以上にしたときも同様にカルスの増殖速度は小さくなる
。本発明の組織培養を行うに当たっては、光は必ずしも
必要ではないが、光の照射はカサランチン等のインドー
ルアルカロイドの生成を妨げない。

本発明の方法においては、培地に液体培地を用いた場合
には培養終了後カルスをデカンテーションあるいは濾過
等の方法によって培地から分離し、次に該カルスから目
的とするカサランチン等のインドールアルカロイドを有
機溶媒による抽出等の方法によって分離することができ
る。

本発明の方法は、液体培地を用いるとタンク等を利用し
た大量培養が可能である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によって更に詳しく説明する。

実施例１〜２６．比較例１〜１１ 組織培養の培地成分が第１表に示す組成を有するムラシ
ゲ・スクーグの液体培地を寒天で固めた固体培地（寒天
１重量％）に、前もって２％アンチホルミン溶液あるい
は７０％エタノール溶液等で滅菌処理したニチニチソウ
（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓｖａｒ、　
Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇｈｔ、マダカスガル原産）ノ朽
ノ一部を置床し、２５°Ｃで暗所にて静置培養してニチ
ニチソウのカルスを得た。次にこのニチニチソウのカル
スを、上記と同様の条件で、ムラシゲ・スクーグの液体
培地で７日毎に植えつぎ、ロータリーシェーカー上で旋
回培養（振幅２５柵、　１０１００ｒｐして、該カルス
の生育速度を速め、安定化したニチニチソウカルスを得
た。

一方、これとは別に先の液体培地において、液体培地の
培地成分のうちの特定成分を第２〜９表に示す値とする
以外は先の液体培地と同一成分組成の液体培地（実施例
１〜２６の培地）を調製し、この液体培地２０ｍ／と先
の液体培地（比較例１〜１１の培地）２０ｄを、それぞ
れ別個の内容積１００ｒＲ１のエルレンマイヤーフラス
コに取り、これらを１２０°Ｃで１０分間保持して滅菌
処理を施したそれぞれの液体培地に、先に得た、成育速
度の高められた新鮮な安定化したニチニチソウカルスを
それぞれ０．７０ｇ添加して、２５°Ｃで７日間ロータ
リーシェーカー上で旋回培養（振幅２５ｍｍ、　１０１
００ｒｐ　　した。

比較例１〜１１に材料として用いたニチニチソウ細胞は
ムラシゲ・スクーグ培地を用いて継代培養しているが、
培養時期の違いのためにカサランチン生産性に若干の差
が見られる。一方、細胞選抜によって得られた高生産株
を順次実験に用いたために、比較例のカサランチン収量
が異なっている。

培養後のニチニチソウカルスは濾過により採取し、４０
°Ｃで１夜風乾したのちその乾燥重量を測定し、液体培
地ＩＩ！、当たりに換算した培養細胞の生育重量を求め
た。カサランチン等のインドールアルカロイドは、得ら
れた乾燥カルスをメタノール等を用いて抽出し、高速液
体クロマトグラフィーを用いて、標準品と比較定量する
ことによって測定した。

（本頁以下余白） 表中記載の成分の残りは水 表中Ｍはモル／ｌを示す 使用株＝Ａ株 実施例１４ 〃１５ 実施例１７ 〃１８ ｆ：比較例９のカサランチン収量を１００とした場合用
　　２　　表 使用株＝Ａ株 比較例１　　　　　３　　　　　　　１８．０〃２　　
　　　　２　　　　　　　　１Ｂ、０実施例１　　　　
　１　　　　　　　１８．１〃２　　　　　０．５　　
　　　　１５．５〃３　　　　　　０　　　　　　　　
１２．Ｏａ：比較例１のカサランチン収量を１００とし
た場合用　　３　　表 使用株：Ｂ株 比較例３　　　　　３０　　　　　　１５．０〃４　　
　　　２０　　　　　　　１５．２実施例４　　　　　
１０　　　　　　１４．９〃５　　　　　　５　　　　
　　　１４．７〃６　　　　　　０　　　　　　　１３
．１ｂ：比較例３のカサランチン収量を１００とした場
合用　　４　　表 使用株二Ｂ株 比較例５　　　　　３　　　　　　　１６．１実施例７
　　　　　２　　　　　　　１６．４〃８　　　　　　
１　　　　　　　　１７．０〃９　　　　　　０　　　
　　　　　１７．１Ｃ：比較例５のカサランチン収量を
１００とした場合用 表 使用株二Ａ株 比較例１０ 実施例２０ 〃２１ （本頁以下余白） 第２表〜第９表より、本発明に係る培地を用いることに
より、カサランの収量が増加することが明らかである。

〔発明の効果〕

本発明のニチニチソウ属植物の組織培養方法によれば、
カサランチン等のインドールアルカロイドを効率よく生
産することができる。

出願人　三井石油化学工業株式会社 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 同　　弁理士　石　井　貞　次

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ニチニチソウ属植物の組織培養により生理活性物
   質を製造するに当り、その培地成分に関し、次の濃度条
   件 （ａ）、カルシウム濃度　０〜１ｍＭ （ｂ）亜鉛濃度　０〜１０μＭ （ｃ）ヨウ素濃度　０〜２μＭ （ｄ）イノシトール濃度　０．２〜２．０ｇ／ｌ （ｅ）ニコチン酸濃度　０〜０．３ｍｇ／ｌ （ｆ）ピリドキシン濃度　０〜０．３ｍｇ／ｌ （ｇ）グリシン濃度　０〜１ｍｇ／ｌ のうちの少なくとも１以上の条件を満たす培地を用いる
   ことを特徴とする生理活性物質の製造方法。
2. （２）生理活性物質がインドールアルカロイドであるこ
   とを特徴とする請求項１記載の製造方法。
3. （３）インドールアルカロイドがカサランチンであるこ
   とを特徴とする請求項２記載の製造方法。
4. （４）ニチニチソウ属植物がカサランサス・ロゼウスで
   あることを特徴とする請求項１〜３のいずれかの項記載
   の製造方法。