JPH05219974A - トロパンアルカロイドの製造方法 - Google Patents
トロパンアルカロイドの製造方法Info
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- JPH05219974A JPH05219974A JP4026552A JP2655292A JPH05219974A JP H05219974 A JPH05219974 A JP H05219974A JP 4026552 A JP4026552 A JP 4026552A JP 2655292 A JP2655292 A JP 2655292A JP H05219974 A JPH05219974 A JP H05219974A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 トロパンアルカロイドを産生する植物の培養
細胞又は組織の組織培養培地中にＤＮＡメチル化阻害剤
を添加して組織培養を行ない、培養物よりトロパンアル
カロイドを採取することを特徴とするトロパンアルカロ
イドの製造方法。 【効果】 本発明方法は、トロパンアルカロイドの生産
量増加を可能にする。
細胞又は組織の組織培養培地中にＤＮＡメチル化阻害剤
を添加して組織培養を行ない、培養物よりトロパンアル
カロイドを採取することを特徴とするトロパンアルカロ
イドの製造方法。 【効果】 本発明方法は、トロパンアルカロイドの生産
量増加を可能にする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、トロパンアルカロイド
を代謝産生する植物の組織又は細胞を特定の培地を用い
て組織培養することにより、トロパンアルカロイドを製
造する方法に関する。
を代謝産生する植物の組織又は細胞を特定の培地を用い
て組織培養することにより、トロパンアルカロイドを製
造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】トロパンアルカロイドの中には、鎮痙
剤、鎮痛剤及び副交感神経遮断薬として用いられるスコ
ポラミンや、副交感神経遮断薬として用いられるヒヨス
チアミンなど、医薬として重要なものが多い。これらの
化合物は、天然の植物体中から抽出して製造されている
が、天然物を原料としているため、その生産が天候に左
右されること、収穫時期が限定されていることなどが問
題となっている。そのため、これらの化合物を植物の組
織培養により生産する研究が国内外で数多く行なわれ
た。山田らは、ズボイシア(Duboisia Leichhardtii F.
Muell)の組織培養より得られる不定根中に著量のスコポ
ラミン及びヒヨスチアミンが存在することを見出してい
る〔Plant Cell Reports, 3,186-188(1984) 〕が、その
量は工業化にはまだ充分とは言えないものであった。ま
た、培養細胞による生産研究例は極めて少なく、山田ら
による、ヒヨスの培養細胞による生産例が知られている
〔PlantCell Reports, 1,101-103(1982) 〕が、スコポ
ラミン含量は20ppm と、天然の植物体中の含量と比較し
て低いものであった。
剤、鎮痛剤及び副交感神経遮断薬として用いられるスコ
ポラミンや、副交感神経遮断薬として用いられるヒヨス
チアミンなど、医薬として重要なものが多い。これらの
化合物は、天然の植物体中から抽出して製造されている
が、天然物を原料としているため、その生産が天候に左
右されること、収穫時期が限定されていることなどが問
題となっている。そのため、これらの化合物を植物の組
織培養により生産する研究が国内外で数多く行なわれ
た。山田らは、ズボイシア(Duboisia Leichhardtii F.
Muell)の組織培養より得られる不定根中に著量のスコポ
ラミン及びヒヨスチアミンが存在することを見出してい
る〔Plant Cell Reports, 3,186-188(1984) 〕が、その
量は工業化にはまだ充分とは言えないものであった。ま
た、培養細胞による生産研究例は極めて少なく、山田ら
による、ヒヨスの培養細胞による生産例が知られている
〔PlantCell Reports, 1,101-103(1982) 〕が、スコポ
ラミン含量は20ppm と、天然の植物体中の含量と比較し
て低いものであった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物組織培
養によるトロパンアルカロイドの簡便な製造方法を提供
することを目的とする。
養によるトロパンアルカロイドの簡便な製造方法を提供
することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】これまで、ズボイシア、
ダツラ、ハシリドコロ、ヒヨス等の細胞培養は数多く報
告されているが、母植物以上にアルカロイドを生産させ
た例はきわめて少ない。母植物、母植物から得たカルス
ともに遺伝子は同じであるから、カルスという形態で
は、何らかの遺伝子発現の制御がおこっているものと考
えられる。一方、佐野らは、イネのわい性発現にＤＮＡ
メチル化の制御が関与することを報告〔Mol. Gen. Gene
t., 220, 441(1990)〕している。真核細胞生物の場合、
ＤＮＡのメチル化とはシトシンの５位の水素がメチル基
に置換され５−メチルシトシンになることを指し、佐野
らの報告は、植物においてＤＮＡのメチル化が遺伝子発
現の制御の一端を担っている例である。
ダツラ、ハシリドコロ、ヒヨス等の細胞培養は数多く報
告されているが、母植物以上にアルカロイドを生産させ
た例はきわめて少ない。母植物、母植物から得たカルス
ともに遺伝子は同じであるから、カルスという形態で
は、何らかの遺伝子発現の制御がおこっているものと考
えられる。一方、佐野らは、イネのわい性発現にＤＮＡ
メチル化の制御が関与することを報告〔Mol. Gen. Gene
t., 220, 441(1990)〕している。真核細胞生物の場合、
ＤＮＡのメチル化とはシトシンの５位の水素がメチル基
に置換され５−メチルシトシンになることを指し、佐野
らの報告は、植物においてＤＮＡのメチル化が遺伝子発
現の制御の一端を担っている例である。
【０００５】本発明者らは、培養細胞での物質生産系遺
伝子発現の制御がＤＮＡのメチル化によるものであるな
らば、ＤＮＡの脱メチル化を促すことにより、物質生産
系遺伝子が発現するものと考え、鋭意研究の結果、ズボ
イシア、ダツラ、ハシリドコロ、ヒヨス等の培養細胞又
は組織の組織培養培地中にＤＮＡメチル化阻害剤を添加
して組織培養を行なうことによって、培養物中のトロパ
ンアルカロイド生産量が増加することを見出し、本発明
を完成するに至った。
伝子発現の制御がＤＮＡのメチル化によるものであるな
らば、ＤＮＡの脱メチル化を促すことにより、物質生産
系遺伝子が発現するものと考え、鋭意研究の結果、ズボ
イシア、ダツラ、ハシリドコロ、ヒヨス等の培養細胞又
は組織の組織培養培地中にＤＮＡメチル化阻害剤を添加
して組織培養を行なうことによって、培養物中のトロパ
ンアルカロイド生産量が増加することを見出し、本発明
を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明のトロパンアルカロイドの製
造方法は、トロパンアルカロイドを産生する植物の培養
細胞又は組織の組織培養培地中にＤＮＡメチル化阻害剤
を添加して組織培養を行ない、培養物よりトロパンアル
カロイドを採取することを特徴とするものである。本発
明の製造方法の対象となるトロパンアルカロイドは、ト
ロパン骨格を有するアルカロイドであれば特に制限はな
く、例えばスコポラミン、ヒヨスチアミン、トロピンが
挙げられる。
造方法は、トロパンアルカロイドを産生する植物の培養
細胞又は組織の組織培養培地中にＤＮＡメチル化阻害剤
を添加して組織培養を行ない、培養物よりトロパンアル
カロイドを採取することを特徴とするものである。本発
明の製造方法の対象となるトロパンアルカロイドは、ト
ロパン骨格を有するアルカロイドであれば特に制限はな
く、例えばスコポラミン、ヒヨスチアミン、トロピンが
挙げられる。
【０００７】本発明の製造方法において組織培養に用い
られるトロパンアルカロイドを産生する植物としては、
例えば、ズボイシア・ミオポロイデス(Duboisia myopor
oides)、ズボイシア・ライヒハルディ(Duboisia leichh
ardtii) 等のズボイシア属植物、ダツラ・タツラ(Datur
a tatula) 、ダツラ・アルボレア(Datura arborea)、ダ
ツラ・ストラモニウム(Datura stramonium) 等のダツラ
属植物、スコポリア・ジャポニカ(Scopolia japonica)
等のスコポリア属植物、ヒヨシアマス・ニガー(Hyoscya
mus niger)等のヒヨス属植物及びアトローパ・ベラドン
ナ(Atropa belladonna) 等のアトローパ属植物などのナ
ス科植物が挙げられる。
られるトロパンアルカロイドを産生する植物としては、
例えば、ズボイシア・ミオポロイデス(Duboisia myopor
oides)、ズボイシア・ライヒハルディ(Duboisia leichh
ardtii) 等のズボイシア属植物、ダツラ・タツラ(Datur
a tatula) 、ダツラ・アルボレア(Datura arborea)、ダ
ツラ・ストラモニウム(Datura stramonium) 等のダツラ
属植物、スコポリア・ジャポニカ(Scopolia japonica)
等のスコポリア属植物、ヒヨシアマス・ニガー(Hyoscya
mus niger)等のヒヨス属植物及びアトローパ・ベラドン
ナ(Atropa belladonna) 等のアトローパ属植物などのナ
ス科植物が挙げられる。
【０００８】前記植物の組織培養は、本発明によりＤＮ
Ａメチル化阻害剤を添加する以外は、従来普通の手段に
よって行なうことができる。本発明に使用されるＤＮＡ
メチル化阻害剤としては、例えば５−アザシチジン、５
−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロシチジ
ン、プソイドイソシチジンが挙げられる。
Ａメチル化阻害剤を添加する以外は、従来普通の手段に
よって行なうことができる。本発明に使用されるＤＮＡ
メチル化阻害剤としては、例えば５−アザシチジン、５
−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロシチジ
ン、プソイドイソシチジンが挙げられる。
【０００９】本発明に使用される培地は、上記ＤＮＡメ
チル化阻害剤を少なくとも１種類含み、該ＤＮＡメチル
化阻害剤は培地における濃度が 1〜50mg/l、好ましくは
10〜30mg/lになる量で使用される。従来、トロパンアル
カロイド産生植物の組織培養において培地添加物として
ＤＮＡメチル化阻害剤は使用されなかったので、ＤＮＡ
メチル化阻害剤の使用によりトロパンアルカロイド生産
量の増加が認められることは容易に予想できなかった。
チル化阻害剤を少なくとも１種類含み、該ＤＮＡメチル
化阻害剤は培地における濃度が 1〜50mg/l、好ましくは
10〜30mg/lになる量で使用される。従来、トロパンアル
カロイド産生植物の組織培養において培地添加物として
ＤＮＡメチル化阻害剤は使用されなかったので、ＤＮＡ
メチル化阻害剤の使用によりトロパンアルカロイド生産
量の増加が認められることは容易に予想できなかった。
【００１０】本発明で使用される培地は、前記ＤＮＡメ
チル化阻害剤の他に、普通の培地成分を含有する。この
ような成分として一般に炭素源及び無機成分が用いら
れ、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更に
必要に応じてアミノ酸類を添加することができる。炭素
源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等
の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等
の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を
適当な比率で混合したものを使用できる。
チル化阻害剤の他に、普通の培地成分を含有する。この
ような成分として一般に炭素源及び無機成分が用いら
れ、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更に
必要に応じてアミノ酸類を添加することができる。炭素
源としては、シュクロース、マルトース、ラクトース等
の二糖類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等
の単糖類、デンプンあるいはこれら糖源の２種類以上を
適当な比率で混合したものを使用できる。
【００１１】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。
【００１２】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA) 、ナフタレン酢酸(NAA)、ｐ−クロロフェノ
キシイソ酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-
D) 等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒド
ロゼアチン等のサイトカイニン類が用いられる。ビタミ
ン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ
1 ）、ピリドキシン（ビタミンＢ6 ）、パントテン酸、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸等が用いられる。
酢酸(IAA) 、ナフタレン酢酸(NAA)、ｐ−クロロフェノ
キシイソ酪酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-
D) 等のオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒド
ロゼアチン等のサイトカイニン類が用いられる。ビタミ
ン類としては、例えばビオチン、チアミン（ビタミンＢ
1 ）、ピリドキシン（ビタミンＢ6 ）、パントテン酸、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸等が用いられる。
【００１３】アミノ酸類としては、例えばグリシン、ア
ラニン、グルタミン、システイン等を添加できる。一般
に前記の各成分は、炭素源が約1 〜約30g/l 、無機成分
が約0.1 μM ないし100mM 、植物ホルモン類が約0.01〜
約10μM 、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約0.1
〜約100mg/l の濃度で用いられる。
ラニン、グルタミン、システイン等を添加できる。一般
に前記の各成分は、炭素源が約1 〜約30g/l 、無機成分
が約0.1 μM ないし100mM 、植物ホルモン類が約0.01〜
約10μM 、ビタミン類及びアミノ酸類がそれぞれ約0.1
〜約100mg/l の濃度で用いられる。
【００１４】本発明の組織培養に用いられる培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ（1962年) 〔Murashig
e &Skoog 〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（1965
年) 〔Linsmaier Skoog 〕の培地、ホワイト（1954年)
〔White 〕の培地、ガンボルグ〔Gamborg 〕のＢ−５培
地、三井のＭ−９培地等に前記の植物ホルモンを添加
し、更に必要に応じて前記した炭素源、ビタミン類、ア
ミノ酸等を添加して調製される培地を例示できるが、こ
の中でも特にムラシゲ・スクーグの培地を用いて調製さ
れる培地が好ましい。
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ（1962年) 〔Murashig
e &Skoog 〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ（1965
年) 〔Linsmaier Skoog 〕の培地、ホワイト（1954年)
〔White 〕の培地、ガンボルグ〔Gamborg 〕のＢ−５培
地、三井のＭ−９培地等に前記の植物ホルモンを添加
し、更に必要に応じて前記した炭素源、ビタミン類、ア
ミノ酸等を添加して調製される培地を例示できるが、こ
の中でも特にムラシゲ・スクーグの培地を用いて調製さ
れる培地が好ましい。
【００１５】本発明には液体培地及び寒天やゲランガム
等を通常0.1 〜1 ％含有する固形培地のいずれも使用で
きるが、通常は液体培地が好ましい。本発明の組織培養
においては、上記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花
粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいはこれらを本
発明による培地あるいは他の従来の培地によって組織培
養して得られる培養細胞又は培養組織あるいはプラスミ
ドの導入によって形質転換したクラウンゴール組織を使
用することができる。これらの組織又は細胞を本発明に
よりメチル化阻害剤を添加した培地を用いて組織培養す
ると、トロパンアルカロイド生産性の増加した培養組織
又は培養細胞が得られる。この培養組織又は培養細胞か
ら、メタノール等の有機溶媒による抽出によってトロパ
ンアルカロイドを分離することができる。
等を通常0.1 〜1 ％含有する固形培地のいずれも使用で
きるが、通常は液体培地が好ましい。本発明の組織培養
においては、上記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花
粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいはこれらを本
発明による培地あるいは他の従来の培地によって組織培
養して得られる培養細胞又は培養組織あるいはプラスミ
ドの導入によって形質転換したクラウンゴール組織を使
用することができる。これらの組織又は細胞を本発明に
よりメチル化阻害剤を添加した培地を用いて組織培養す
ると、トロパンアルカロイド生産性の増加した培養組織
又は培養細胞が得られる。この培養組織又は培養細胞か
ら、メタノール等の有機溶媒による抽出によってトロパ
ンアルカロイドを分離することができる。
【００１６】本発明の組織培養の好ましい一例として
は、次の方法が挙げられる。先ず、ナス科植物の植物
体、例えば根、生長点、葉、茎、種子等から採取される
植物片を殺菌処理後、寒天で固めたムラシゲ・スクーグ
の固体培地上に置床し、10〜35℃で 7〜30日程度経過さ
せて組織片の一部をカルス化させる。このようにして得
られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安
定化したカルスが得られる。このカルスを増殖に適した
液体培地、例えばムラシゲ・スクーグの液体培地に移し
て増殖させる。液体培地において更に生育速度が高めら
れる。この安定化した培養細胞を液体培地に移して培養
し、培養途中でＤＮＡメチル化阻害剤を添加して培養す
る。
は、次の方法が挙げられる。先ず、ナス科植物の植物
体、例えば根、生長点、葉、茎、種子等から採取される
植物片を殺菌処理後、寒天で固めたムラシゲ・スクーグ
の固体培地上に置床し、10〜35℃で 7〜30日程度経過さ
せて組織片の一部をカルス化させる。このようにして得
られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安
定化したカルスが得られる。このカルスを増殖に適した
液体培地、例えばムラシゲ・スクーグの液体培地に移し
て増殖させる。液体培地において更に生育速度が高めら
れる。この安定化した培養細胞を液体培地に移して培養
し、培養途中でＤＮＡメチル化阻害剤を添加して培養す
る。
【００１７】本発明の組織培養におけるＤＮＡメチル化
阻害剤の添加時期としては、培養開始１４日目以降が好
適である。本発明の組織培養における培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が好適であ
る。約10℃未満では増殖速度が小さく、約35℃より高く
ても同様に増殖速度が小さい。本発明の組織培養を行な
うに当たっては、光は必ずしも必要ではないが、光の照
射はトロパンアルカロイドの生成を妨げない。
阻害剤の添加時期としては、培養開始１４日目以降が好
適である。本発明の組織培養における培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が好適であ
る。約10℃未満では増殖速度が小さく、約35℃より高く
ても同様に増殖速度が小さい。本発明の組織培養を行な
うに当たっては、光は必ずしも必要ではないが、光の照
射はトロパンアルカロイドの生成を妨げない。
【００１８】本発明の製造方法において液体培地を用い
た場合には、培養終了後に培養組織又は培養細胞をデカ
ンテーション又は濾過等の方法によって培地から分離
し、このものから目的とするトロパンアルカロイドを有
機溶媒による抽出等の方法によって分離することができ
る。
た場合には、培養終了後に培養組織又は培養細胞をデカ
ンテーション又は濾過等の方法によって培地から分離
し、このものから目的とするトロパンアルカロイドを有
機溶媒による抽出等の方法によって分離することができ
る。
【００１９】
【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。
【００２０】
【実施例１】ナフタレン酢酸及びベンジルアデニンをそ
れぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したム
ラシゲ・スクーグの寒天培地（寒天1 重量％）に、前も
って２％アンチホルミン溶液又は70％エタノール溶液等
で滅菌処理したズボイシア（Duboisia myoporoides）の
葉の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してズボイ
シアカルスを得た。次に、このカルスを、上記の２成分
を同じ濃度で添加したムラシゲ・スクーグの液体培地で
ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25mm、100rp
m）し、７日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速
め、安定化したズボイシア培養細胞を得た。
れぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したム
ラシゲ・スクーグの寒天培地（寒天1 重量％）に、前も
って２％アンチホルミン溶液又は70％エタノール溶液等
で滅菌処理したズボイシア（Duboisia myoporoides）の
葉の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してズボイ
シアカルスを得た。次に、このカルスを、上記の２成分
を同じ濃度で添加したムラシゲ・スクーグの液体培地で
ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25mm、100rp
m）し、７日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速
め、安定化したズボイシア培養細胞を得た。
【００２１】このようにして得られた培養細胞 0.3g(新
鮮重）を、ナフタレン酢酸及びベンジルアデニンをそれ
ぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したムラ
シゲ・スクーグの液体培地20ml入りの 100容三角フラス
コに移して培養し、培養開始７日目に５−アザ−２’−
デオキシシチジンを10mg/lの濃度になるよう添加して、
合計２１日間２５℃で振盪培養した。
鮮重）を、ナフタレン酢酸及びベンジルアデニンをそれ
ぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したムラ
シゲ・スクーグの液体培地20ml入りの 100容三角フラス
コに移して培養し、培養開始７日目に５−アザ−２’−
デオキシシチジンを10mg/lの濃度になるよう添加して、
合計２１日間２５℃で振盪培養した。
【００２２】培養終了後、ズボイシア培養細胞を濾過に
より採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、
液体培地1L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得ら
れた乾燥培養細胞に0.05N 硫酸 6mlを加えて抽出し、28
% アンモニア水 100μl を加えてアルカリ性とした後、
1ml を Extrelut-1 カラム（メルク社製）に移し、クロ
ロホルム6ml でアルカロイドを抽出した。更に該クロロ
ホルム抽出液を減圧濃縮し、ガスクロマトグラフィーで
アルカロイド量を分析した。ガスクロマトグラフィーの
分析は以下の条件で行なった。なお、その分析結果を表
１に示す。
より採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定し、
液体培地1L当たりの培養細胞の生育重量を求めた。得ら
れた乾燥培養細胞に0.05N 硫酸 6mlを加えて抽出し、28
% アンモニア水 100μl を加えてアルカリ性とした後、
1ml を Extrelut-1 カラム（メルク社製）に移し、クロ
ロホルム6ml でアルカロイドを抽出した。更に該クロロ
ホルム抽出液を減圧濃縮し、ガスクロマトグラフィーで
アルカロイド量を分析した。ガスクロマトグラフィーの
分析は以下の条件で行なった。なお、その分析結果を表
１に示す。
【００２３】カラム：ヒューズドシリカキャピラリー、
CBP1(0.25mm ×25m) キャリアーガス：Ｎ2 カラム温度： 260℃ 〔比較例１〕実施例１において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンを添加しない培地を用いた以外は該実施例
と同様に操作した。その結果を表１に示す。
CBP1(0.25mm ×25m) キャリアーガス：Ｎ2 カラム温度： 260℃ 〔比較例１〕実施例１において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンを添加しない培地を用いた以外は該実施例
と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００２４】
【実施例２】実施例１において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンを50mg/l添加した培地を用いた以外は該実
施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
キシシチジンを50mg/l添加した培地を用いた以外は該実
施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００２５】
【実施例３】実施例１において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンの添加時期を培養開始１４日目とした以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
キシシチジンの添加時期を培養開始１４日目とした以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００２６】
【実施例４】実施例２において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンの添加時期を培養開始１４日目とした以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
キシシチジンの添加時期を培養開始１４日目とした以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００２７】
【実施例５】実施例１において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００２８】
【実施例６】実施例２において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００２９】
【実施例７】実施例３において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００３０】
【実施例８】実施例４において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
キシシチジンの代わりに５−アザシチジンを用いた以外
は該実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】ＤＮＡメチル化阻害剤の添加効果を確認す
るため、ＤＮＡ中のシトシン残基についてメチル化の程
度を比較した。
るため、ＤＮＡ中のシトシン残基についてメチル化の程
度を比較した。
【００３３】
【実施例９】ナフタレン酢酸及びベンジルアデニンをそ
れぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したム
ラシゲ・スクーグの寒天培地（寒天１重量％）に、前も
って２％アンチホルミン溶液又は70％エタノール溶液等
で滅菌処理したズボイシア（Duboisia myoporoides）の
葉の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してズボイ
シアカルスを得た。次に、このカルスを、上記の２成分
を同じ濃度で添加したムラシゲ・スクーグの液体培地で
ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25mm、100rp
m）し、７日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速
め、安定化したズボイシアカルスを得た。
れぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したム
ラシゲ・スクーグの寒天培地（寒天１重量％）に、前も
って２％アンチホルミン溶液又は70％エタノール溶液等
で滅菌処理したズボイシア（Duboisia myoporoides）の
葉の一部を置床し、25℃で暗所にて静置培養してズボイ
シアカルスを得た。次に、このカルスを、上記の２成分
を同じ濃度で添加したムラシゲ・スクーグの液体培地で
ロータリーシェーカー上で旋回培養（振幅25mm、100rp
m）し、７日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速
め、安定化したズボイシアカルスを得た。
【００３４】このようにして得られた培養細胞 0.3g(新
鮮重）を、ナフタレン酢酸及びベンジルアデニンをそれ
ぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したムラ
シゲ・スクーグの液体培地20ml入りの 100容三角フラス
コに移して培養し、培養開始１４日目に５−アザ−２’
−デオキシシチジンを10mg/lの濃度になるよう添加し
て、合計２１日間２５℃で振盪培養した。
鮮重）を、ナフタレン酢酸及びベンジルアデニンをそれ
ぞれ10-5M 及び10-5M の濃度になるように添加したムラ
シゲ・スクーグの液体培地20ml入りの 100容三角フラス
コに移して培養し、培養開始１４日目に５−アザ−２’
−デオキシシチジンを10mg/lの濃度になるよう添加し
て、合計２１日間２５℃で振盪培養した。
【００３５】培養終了後、濾過により採取したズボイシ
ア培養細胞 0.5g(新鮮重）から、S.O. Rogers ら の報
告するＣＴＡＢ法〔Plant Mol.Biol., 5, 69(1985)〕に
よりＤＮＡを抽出した。該ＤＮＡに 6N 塩酸 1mlを加
え、アンプル中に封入して105℃で３時間処理すること
により、ＤＮＡを分解した。該ＤＮＡ分解物から塩酸を
除去した後、0.05N 塩酸に溶解して、ＤＮＡ分解物中の
シトシン、５−メチルシトシン量をＨＰＬＣで分析し
た。ＨＰＬＣの分析は以下の条件で行なった。なお、そ
の分析結果を表２に示す。
ア培養細胞 0.5g(新鮮重）から、S.O. Rogers ら の報
告するＣＴＡＢ法〔Plant Mol.Biol., 5, 69(1985)〕に
よりＤＮＡを抽出した。該ＤＮＡに 6N 塩酸 1mlを加
え、アンプル中に封入して105℃で３時間処理すること
により、ＤＮＡを分解した。該ＤＮＡ分解物から塩酸を
除去した後、0.05N 塩酸に溶解して、ＤＮＡ分解物中の
シトシン、５−メチルシトシン量をＨＰＬＣで分析し
た。ＨＰＬＣの分析は以下の条件で行なった。なお、そ
の分析結果を表２に示す。
【００３６】カラム；TSK-gel ODS-80TM(4.6mmID×15c
m) ソルベント； ソルベントＡ；0.05M NaH2PO4(pH 6.5)5mM リン酸テト
ラブチルアンモニウム ソルベントＢ；100 ％ メタノール ソルベントＡ：ソルベントＢ＝９８：２ 流速；1ml/min 〔比較例２〕実施例９において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンを添加しない培地を用いた以外は該実施例
と同様に操作した。その結果を表２に示す。
m) ソルベント； ソルベントＡ；0.05M NaH2PO4(pH 6.5)5mM リン酸テト
ラブチルアンモニウム ソルベントＢ；100 ％ メタノール ソルベントＡ：ソルベントＢ＝９８：２ 流速；1ml/min 〔比較例２〕実施例９において、５−アザ−２’−デオ
キシシチジンを添加しない培地を用いた以外は該実施例
と同様に操作した。その結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、トロパンアルカロイド
産生植物の組織培養によって、トロパンアルカロイド生
産量を増加させることが可能となった。
産生植物の組織培養によって、トロパンアルカロイド生
産量を増加させることが可能となった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 トロパンアルカロイドを産生する植物の
培養細胞又は組織の組織培養培地中にＤＮＡメチル化阻
害剤を添加して組織培養を行ない、培養物よりトロパン
アルカロイドを採取することを特徴とするトロパンアル
カロイドの製造方法。 - 【請求項２】 ＤＮＡメチル化阻害剤の添加時期が培養
開始１４日目以降であることを特徴とする請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 トロパンアルカロイドを産生する植物が
ズボイシア属植物であることを特徴とする請求項１記載
の方法。 - 【請求項４】 ＤＮＡメチル化阻害剤が５−アザシチジ
ン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ
シチジン及びプソイドイソシチジンからなる群から選ば
れる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１記
載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026552A JPH05219974A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | トロパンアルカロイドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026552A JPH05219974A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | トロパンアルカロイドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05219974A true JPH05219974A (ja) | 1993-08-31 |
Family
ID=12196691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4026552A Pending JPH05219974A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | トロパンアルカロイドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05219974A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996036693A1 (en) * | 1995-05-19 | 1996-11-21 | Phytera, Inc. | Manipulation of plant cell and tissue cultures |
| WO2006113481A1 (en) * | 2005-04-14 | 2006-10-26 | Ceres Inc. | Secondary metabolite production via manipulation of genome methylation |
| US7135464B2 (en) | 2002-06-05 | 2006-11-14 | Supergen, Inc. | Method of administering decitabine |
| US7250416B2 (en) | 2005-03-11 | 2007-07-31 | Supergen, Inc. | Azacytosine analogs and derivatives |
| US7276228B2 (en) | 2001-04-24 | 2007-10-02 | Supergen, Inc. | Methods for treating hematological disorders through inhibition of DNA methylation and histone deacetylase |
| US7700567B2 (en) | 2005-09-29 | 2010-04-20 | Supergen, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US7795503B2 (en) | 2005-02-22 | 2010-09-14 | Ceres, Inc. | Modulating plant alkaloids |
| US9381207B2 (en) | 2011-08-30 | 2016-07-05 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Drug formulations |
| CN109554328A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-02 | 长沙学院 | 提高栀子仁细胞中栀子苷含量的方法 |
| US10485764B2 (en) | 2015-07-02 | 2019-11-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Lyophilized pharmaceutical compositions |
| US10519190B2 (en) | 2017-08-03 | 2019-12-31 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Drug compound and purification methods thereof |
-
1992
- 1992-02-13 JP JP4026552A patent/JPH05219974A/ja active Pending
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996036693A1 (en) * | 1995-05-19 | 1996-11-21 | Phytera, Inc. | Manipulation of plant cell and tissue cultures |
| US7276228B2 (en) | 2001-04-24 | 2007-10-02 | Supergen, Inc. | Methods for treating hematological disorders through inhibition of DNA methylation and histone deacetylase |
| US7135464B2 (en) | 2002-06-05 | 2006-11-14 | Supergen, Inc. | Method of administering decitabine |
| US7144873B2 (en) | 2002-06-05 | 2006-12-05 | Supergen, Inc. | Kit for delivering decitabine in vivo |
| US7795503B2 (en) | 2005-02-22 | 2010-09-14 | Ceres, Inc. | Modulating plant alkaloids |
| US7250416B2 (en) | 2005-03-11 | 2007-07-31 | Supergen, Inc. | Azacytosine analogs and derivatives |
| WO2006113481A1 (en) * | 2005-04-14 | 2006-10-26 | Ceres Inc. | Secondary metabolite production via manipulation of genome methylation |
| US8461123B2 (en) | 2005-09-29 | 2013-06-11 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US7700567B2 (en) | 2005-09-29 | 2010-04-20 | Supergen, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US9358248B2 (en) | 2005-09-29 | 2016-06-07 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US9480698B2 (en) | 2005-09-29 | 2016-11-01 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US10456415B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-10-29 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US10933079B2 (en) | 2005-09-29 | 2021-03-02 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein |
| US9381207B2 (en) | 2011-08-30 | 2016-07-05 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Drug formulations |
| US9913856B2 (en) | 2011-08-30 | 2018-03-13 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Drug formulations |
| US10517886B2 (en) | 2011-08-30 | 2019-12-31 | Astex Pharmaceuticals, Inc. | Drug formulations |
| US10485764B2 (en) | 2015-07-02 | 2019-11-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Lyophilized pharmaceutical compositions |
| US10519190B2 (en) | 2017-08-03 | 2019-12-31 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Drug compound and purification methods thereof |
| CN109554328A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-02 | 长沙学院 | 提高栀子仁细胞中栀子苷含量的方法 |
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