JPS63129989A - トロパン系アルカロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は例えばナス科に属する植物の組織を培養し、ス
コポラミンおよびヒヨスチアミンナトのトロパン系アル
カロイドを生産する方法に関するものである。

〔従来の技術〕

スコポラミンは鎮痙剤、鎮痛剤および副交感神経しゃ断
薬として、またヒヨスチアミンは副交感神経しゃ断薬と
して、それぞれ医薬として重用されている。これらの化
合物は、天然の植物体中から抽出して製造されているが
、天然物を原料としているため、その生産が天候に左右
されること、収穫時期が限定されていることなどが問題
となっている。そのためこれらの化合物を植物の組織培
養により生産する研究が内外で数多く行われた。カルス
による生産では、山田らによるヒヨスのカルスによる生
産例が知られている（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｐ
ｏｒｔｓ上、１０１〜１０３（１９８２）　）が、スコ
ポラミン含量は２０ｐρｍと、天然の植物体中の含量と
比較して低いものであった。また山田らは。

ズボイシア（Ｄｕｂｏｉｓｔａ　Ｌｅｉｃｈｈａｒｄｔ
ｉｉ　Ｆ、　Ｍｕｅｌｌ）の組織培養により得られる不
定根中に著量のスコポラミンおよびヒヨスチアミンが存
在することを見出している（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ　　３．１８６−１８８（１９８４）　）
が、その量はまだ充分とは言えないものであった。そこ
で、ズボイシア不定根の各種培養条件を検討し、培地の
アンモニウムイオンと硝酸イオンの比率を０．２以上に
することおよび培地の溶存酸素？農度を１０ないし６５
ｐρｍにすることにより、トロパン系アルカロイドの生
産性を向上させることを見出し、それぞれ特願昭６０−
１４３８８２号および特願昭６０−１４３８８１号とし
て特許出願をしているが、工業的な見地からは、その生
産量はなお不充分なものであった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

したがってこのようなＭｉ織培養によりトロパン系アル
カロイドの工業的な生産を目指す場合、さらに生産性を
尚めることが重要な課題であった。

このような事情にかんがみ、本発明者らは、ナス科に属
する植物の不定根等の組織を効率よく培養する方法を研
究した結果次のような事実を見出した。すなわち、これ
らの組織の培養に際し、組織の増殖量が不足しているこ
とが明らかとなり、これが、トロパン系アルカロイドの
生産を行う上で問題となった。この点について検討を重
ねた結果、培地中に加えたオーキシン類が、組織中に急
速に吸収され、代謝されて、培地および組織からオーキ
シン類が消失していることが明らかとなり、これが組織
の増殖量の不足の原因と考えられた。

そこで、培養途中にオーキシン類を添加したところ、Ｕ
織の増殖量が倍増し、トロパン系アルカロイドの収量も
倍増することを明らかにし本発明を完成するに至った。

〔発明の概要〕

すなわち、本発明の方法によれば、トロパン系アルカロ
イドを産生ずる植物の組織を培養するに際し、培養開始
後、培養の途中の段階でオーキシン類を添加してし培養
を続けることによりトロパン系アルカロイドを得ること
を特徴とするトロパン系アルカロイドの生産方法が提供
される。

〔発明の詳細な説明〕

本発明では組織培養はトロパン系アルカロイドを産生ず
る植物を用いて行われるが、該当する植物として具体的
には、ズボイシア・ミオボロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａ
　ｍｙｏｐｏｒｏｉｄｅｓ）、ズボイシア・ライヒハル
デイ（Ｄｕｂｏｉｓｉａ　１ｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ）
等のズボイシア属植物、ダツラ・ダツラ（Ｄａｔｕｒａ
　ＬａＬｕ１ａ）　、ダツラ・アルボレア　（Ｄａｔｕ
ｒａ　ａｒｂｏｒｅａ）、ダツラ・ストラモニウム（Ｄ
ａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物
、スコポリア・ジャポニカ（５ｃｏｐｏｌｉａｊａｐｏ
ｎｉｃａ）等のスコポリア属植物、ヒョシアマス・ニガ
ー（ｔ（ｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス
属植物およびアトローパ・ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　
ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）等のアトローバ属植物などのナ
ス科植物を例示することができる。

本発明で使用される培地は、無機成分および炭素源を必
須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加
し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地である
。

該培地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナ
トリウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マ
ンガン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コ
バルト等の元素を含む無機塩を挙げることができ、具体
的には硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム
、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、
硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリ
ブデン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウ
ム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示
できる。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の一級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）　、ｐ−
クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびこ
れらの誘導体等のオーキシン類およびベンジルアデニン
（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニン類
を例示できる。本発明ではサイトカイニン類は通常は培
地に添加しないことが望ましいが、必要に応じて添加す
る場合にはサイトカイニン類は濃度が通常１０−７Ｍ（
０，０２ｍｇ／　７り以下の低濃度で使用することが好
ましい。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢＩ）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボブラビン（ビタミン
ＳＺ）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、システィン、フェニルアラニンおよ
びリジンなどを例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μＭないし約１００ｍＭ、前記炭素源を約１ｇ／ｌない
し約１００　ｇ　／　Ａ、前記植物ホルモン類を約１０
−’　〜１０−’Ｍ　、前記ビタミン類を約Ｑ、１ｍｇ
　／　１ないし約１５０ｍｇ／　１および前記アミノＩ
ＩＨＴを０ないし約１０００ｍｇ／　１含ませて使用さ
れることが望ましい。

本発明のズボイシア属植物のＭｉ織培養に用いられる前
記培地として具体的には、従来から知られている植物の
組織培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・ス
クーグ（’６２）　　ＣＭｕｒａｓｈｉｇｅ　＆Ｓｋｏ
ｏｇ　）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１
９６５）　　ＣＬｉｎｓｍａｉｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ　
）の培地、ホワイト（’６３）　　（Ｗｈｉｔｅ　）の
培地、ガンボルグＣＧａｍｂｏｒｇ’ＪのＢ−５培地、
三井のＭ−９培地、エッチ・エッチの培地（Ｎ１ｔｓｃ
ｈ＆　Ｎ１ｔｓｃｈ　）等に前記した炭素源および植物
ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記したビタミン
類、アミノ酸類を添加して調製される培地を例示できる
が、本発明ではこの中でも特にエッチ・ニッチ、リンス
マイヤー・スクーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用
いて調製される培地が好ましい。なお、上記した従来公
知の培地の組成に関しては、例えば、作力、中島、古谷
著の「新植物組織培養Ｊ　Ｐ３８６〜Ｐ３９１、願意書
店、１９７９年に記載されている。

本発明で使用できる前記培地は液体培地又は寒天を通常
０．５〜１％含有させた固型培地であるが本発明では液
体培地を用いることが好ましい。

本発明では前記した培地を用いて培養が開始されてトロ
パン系アルカロイドを生産する植物の組織（細胞だけの
場合も含める）の培養が行われるが、この場合本発明で
は培養開始後、培養の途中段階でオーキシン類が培地に
添加されて培養が続けられる。この場合のオーキシン類
として具体的には、インドール８酸（ＩＡＡ）、インド
ールプロピオン酸、インドール８酸（ｆＢＡ）、α−ナ
フタレン酢酸、β−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸メ
チルエステル、４〜クロロフエノキシ酢酸、２．４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、２．３．６−ド
リクロロ安息香酸、シス桂皮酸、２．４〜ジクロロアニ
ソール等のオーキシンあるいはオーキシン様活性をもつ
化合物である。本発明における該オーキシン類の添加量
としては培地におけるオーキシンの類の濃度が通常１０
−７〜１０−　’Ｍとなるように添加することが望まし
い。又本発明におけるオーキシン類が添加される培養の
途中段階とは、培養を開始してから培養２日目以降から
培養終了前日までの期間の任意の段階をＩｂしており、
好ましくは全培養期間の１７４〜３／４までの期間であ
る。

本発明ではオーキシン類濃度を通常１０−’Ｍを越えて
高くして培養を行うと培養組＄１ｉ（培養細胞を含む）
が障害を受けてトロパン系アルカロイドの生産性が低下
するので、前述の培地における植物ホルモン濃度の所で
も述べたように、培養開始時点における培地の植物ホル
モン濃度、従ってオーキシン類濃度は通常１０−７〜１
０−　’Ｍにして培養が開始される。本発明では、この
ようにして培養を開始して培養を続けていると培地中の
オーキシン類濃度が培養組織の代謝によって消費され減
少してゆくので、培養開始後の適宜時点で培地のオーキ
シン類濃度が通常１０１〜１０−’Ｍとなるようにオー
キシン類が添加されるのである。

本発明のＭｉ織培養ではトロパン系アルカロイドを産生
ずる植物の組織片は前記培地を用いて本発明の方法によ
って培養されて、トロパン系アルカロイドを含有する培
養組織あるいは培養細胞が得られる。本発明ではこれら
の中では不定根を培養によって得ることが好ましい。こ
の場合の培養に供せられるＭｉ織片として具体的には根
、葉、茎、種子、花芽などが例示でき、又該アルカロイ
ドを含有する培養Ｍｉ織、培養細胞を得るための組織培
養方法として以下の方法を例示できる。すなわち、通常
本発明ではこれらのＭｉ織片からカルスが誘専され、該
カルスを継代培養して得られる培養細胞は本発明の前記
培地を用いて増殖培養されてトロパン系アルカロイドを
含有する不定根を得ることが好ましい。

本発明では不定根を用いる場合に、植物の組織片を例え
ば毛根病菌（例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓ）で感染させ、これによって出現する毛
根を用いることもできる。

本発明の方法によって得られるトロパン系アルカロイド
として具体的には、スコポラミン、ヒヨスチアミン及び
これらの化合物のアセチル化合物を例示できるが、この
中ではスコポラミンとヒヨスチアミンが好ましい。

本発明ではトロパン系アルカロイドを含有する培養細胞
から該アルカロイドを分離する方法としては、例えば架
局法等に記載されている、トロパン系アルカロイドを含
有する＋ｉ動物体らこれら化合物を単離精製する場合に
用いられてきた通常の方法を採用することができる。

〔発明の効果〕

本発明の不定根培養によるトロパン系アルカロイドの生
産方法を採用すれば、従来法に比べてトロパン系アルカ
ロイドを、効率よく生産することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１ 当社薬草園にて栽培したＤｕｂｏｉｓｔａ　ｍｙｐｏｒ
ｏｉｄｅｓＲ，Ｂｒの葉を洗浄し、１０％アンチホルミ
ン液に１０分間浸漬し、次いで滅菌水で３回洗浄した後
、約１ｃｍに切断し、ナフタレン酢酸およびヘンシルア
デニンをそれぞれ１０−　’Ｍおよび１０−　’Ｍとな
るように添加したリンスマイヤー・スクーグの寒天培地
に置床し、２５℃で３０日間培養する。カルス形成と同
時に発生した不定根を切り出し、インドール酪酸を１０
−　’Ｈになるように添加したエッチ・エッチの液体培
地に移植し、２年間継代培養した。このようにして得た
不定根１０ｍｇ　（乾燥重量）をインドール酪酸を１０
−　’Ｈになるように添加したエッチ・エッチの液体培
地２０ｄを含む１０〇−容の三角フラスコに移植し、２
週間振とう培養した。ここではインドール酪酸は代謝さ
れて、培養液および不定根から消失していた。そこでイ
ンドール酪酸をさらに１０−５！＋１になるように途中
添加し、さらに２週間振とう培養した。得られた不定根
２５０■（乾燥重量）を乾燥後、塩基性のクロロホルム
−メタノール液５０．ｎＩ！で抽出した。これに４０ｍ
１のＩＮ硫酸を加えてアルカロイド層を硫酸層に移した
。さらに、アンモニア水２ｍ１ｌおよびクロロホルム４
０−を加えてアルカロイドをクロロホルム層に移し、こ
れを減圧？４縮し、ガスクロマトグラフでアルカロイド
量を分析した。この場合のアルカロイドの生産量を表１
に示した。なお、ガスクロマトグラフの分析は以下の条
件で行った。

カラム：　５ｉｌｉｃｏｎｅ　０Ｖ−１７（１％）　ｏ
ｎＣｈｒｏｍｏｓｏｒｂ　Ｗ　（Ｍｅｓｈ　　８０〜１
０１００）３φ×ｌｌ１１ガラス力ラム キャリャガス二Ｎ２ カラム温度　：２００℃ 比較例１ 培養２週間目にインドール酪酸を添加しないことを除け
ば実施例１と全く同じ条件で培養した。

この場合のアルカロイドの生成量を表１に示しｆこ。

実施例２ 培養２週間目にインドール醋酸のかわりにインドール酢
酸を１０−’Ｍ添加することを除けば実施例１と全く同
じ条件で培養した。この場合のアルカロイド生成量を表
１に示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 トロパン系アルカロイドを産生する植物の 組織を培養するに際し、培養開始後、培養の途中の段階
   でオーキシン類を添加して培養を続けることによりトロ
   パン系アルカロイドを得ることを特徴とするトロパン系
   アルカロイドの生産方法。