JPS63226281A - 組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルカロイド等の二次代謝産物を産生ずる植物
の組織を特定の培地を用いて組織培養して二次代謝産物
を効率よく生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

二次代謝産物の一つであるアルカロイドとして例えばス
コポラミンは鎮痙剤、鎮痛剤などとしてまたヒヨスチア
ミンは副交感神経しゃ新薬として重用され、これらの化
合物は、天然の植物体中から抽出して製造されている。

しかし天然物を原料としているため、その生産が天候に
左右されること、収穫時期が限定されていることなどが
問題となっている。そのためこれらの化合物を植物の組
織培養によって生産する研究が数多く行われている。（
例えばＰｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ上、１０
１〜１０３（１９Ｂ２）　）など。

〔発明が解決しようとする問題点〕

組織培養によって二次代謝産物の工業的な生産を目指す
場合、生産性を高めることが重要な課題である。本発明
者等は二次代謝産物の生産性を高める方法として、細胞
内部で代謝産生される二次代謝産物を効率良く細胞外へ
放出させながら培養することができれば、従来法に比べ
て二次代謝産物の生産性を高め効率良く培養できると考
え該方法について検討した。

〔発明の概要〕

その結果、下記方法を採用すれば前記目的を達成できる
ことを見出し本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明の植物の二次代謝産物を細胞外へ放出
させながら組織培養する方法として、液体培地における
ＮａとＫの金属イオンの少なくとも１種の濃度を５０１
ＴＩＭ以上にした培地を用いるか、又は液体培地におけ
るＣａとＭｇの金属イオンの少なくとも１種の濃度を１
０ｍＭ以上にした培地を用いることを特徴とする植物の
組織培養方法が提供される。

〔発明の詳細な説明〕

本発明方法が適用される植物として具体的には、・ズボ
イシア・ミオポロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａｍｙｏｐｏ
ｒｏｉｄｅｓ）　、ズボイシア・ライヒハルデイ（Ｄｕ
ｂｏｉｓｉａ　１ｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ）等のズボイ
シア属植物、ダツラ・ダツラ（Ｄａｔｕｒａ　ｔａｔｕ
ｌａ）、　　ダツラ・アルボレア（Ｄａｔｕｒａ　ａｒ
ｂｏｒｅａ）、ダツラ・ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ
　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物、スコボリ
ア・ジャポニカ（５ｃｏｐｏｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ
）等のスコボリア属植物、ヒコシアマス・ニガー（Ｈｙ
ｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒヨス属植物およ
びアトローパ・ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａ
ｄｏｎｎａ）等のアトローパ属植物などのナス科植物、
オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｍａｋｉ
ｎｏ）、セリハオウレン（Ｎａｋａｉ）　、キクバオウ
レン（Ｃ，ｊａｐｏｎｉｋａ　Ｍａｋｉｎ。

ｖａｒ、ｊａｐｏｎｉｋａ）　、コセリバオウレン（Ｃ
，ｊａｐｏｎｉｋａＭａｋｉｎｏ　ｖａｒ、　ｍａｊｏ
ｒ　５ａｔａｋｅ）　、パイ力オウレン（Ｃ，ｑｕｉｎ
ｑｕｅｆｏｌｉａ　Ｍｉｑ、）およびミツハオウレン（
Ｃ，ｔｒｉｆｏｌｉａ　５ａｌｉｓｂ、）等のコプテイ
ス属の植物、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　ｍ
１ｎｕｓ　Ｌ、ｖａｒ　ｈｙｐｏｌｅｃｕｍＭｉｑ、）
等のサリクトラム属の植物、サリントリザ属の植物およ
びヒドラスチス属の植物等を挙げられる。

本発明では前記植物の組織（細胞を含む）を培養するに
当たっては、液体培地におけるＮａとＫのか、又は液体
培地におけるＣａとＭｇの金属イオンのこれ以外の他の
無機成分としては窒素、リン、カリウム、ナトリウム、
カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜
鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等の
元素を含む無機塩を挙げることができる、本発明で使用
できる無機塩として具体的には硝酸カリウム、硝酸ナト
リウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、塩化カ
リウム、塩化カルシウム、リン酸１水素カリウム、リン
酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マ
ンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、二酸化モリ
ブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバ
ルト等の化合物を例示できる。

本発明では、Ａの方法を用いる場合Ｃａ、、Ｍｇの濃度
については従来の培地における濃度と同じにしてもよい
し、あるいは本発明のＢの方法と同様にＣａ、、Ｍｇの
金属イオン濃度を１０ｍＭ以上にしても差し５０ｍＭ以
上にしても差し支えない。

本発明で使用される液体培地は前記無機成分および炭素
源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタミン類
を添加し、更に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地
である。

該培地の炭素源としては、シコ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コールなどを例示できる。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）　、Ｐ−
クロロフェノキシ酢酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）、インドール酪酸（ＩＢＡ）およびこ
れらの誘導体等のオーキシン類およびヘンシルアデニン
（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニン類
を例示できる。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボブラビン（ビタミン
Ｂ２）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、フェニルアラニンおよびリジンなど
を例示できる。

本発明の前記培地は、Ｎａ、　Ｋ、　ＣａおよびＭｇ以
外の前記無機成分を通常は約０．１μＭないし約１００
ｍモル、前記炭素源を約１　ｇ／ｌないし約１００ｇ／
７！、前記植物ホルモン類を約０．０１μＭないし約１
００μＭ、前記ビタミン類を約０．Ｉｎ１ｇ／Ａないし
約１５０Ｉ［１ｇ／　Ｅおよび前記アミノｗ４類を０な
いし約１００　ｍｇ／　７！含ませて使用されることが
望ましい。

本発明のズボイシア属植物の組織培養に用いられる前記
培地として具体的には、従来から知られている植物の組
織培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・スク
ーグ（’６２）　　ＣＭｕｒａｓｈｉｇｅ　＆Ｓｋｏｏ
ｇ　）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１９
６５）　　［Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　Ｆ、　Ｓｋｏｏｇ　
）の培地、ホワイト（’６３）　　（Ｗｈｉｔｅ　）の
培地、ガンボルグ［Ｇａｍｂｏｒｇ　）のＢ−５培地、
三井のト９培地、ニッチ・ニッチ［Ｎ１ｔｓｃｈ　Ｎ１
ｔｓｃｈ　）の培地等を用いて該培地のＮａとＫの成分
又はＣａとＭｇの成分を前記濃度範囲に改変すると共に
前記した炭素源および植物ホルモンを添加し、更に必要
に応じて前記したビタミン類、アミノ酸類を添加して調
製される培地を例示できるが、本発明ではこの中でも特
にエッチ・エッチ、リンスマイヤー・スクーグ又はムラ
シゲ・スクーグの培地を用いて改変して調製される培地
が好ましい。なお、上記した従来公知の培地の組成に関
しては、例えば、性向、中島、古谷著の１新植物組織培
養Ｊ　Ｐ３Ｂ６〜Ｐ３９１、朝食書店、１９７９年に記
載されている。

本発明で使用できる前記培地は液体培地である。

本発明の組織培養では二次代謝産物を産生ずる植物の組
織片は、前記培地を用いて組織培養されて二次代謝産物
を含有する培養細胞ないし培養組織が得られる。

本発明では該培養組織としてズボイシア属植物の組織を
用いる場合には不定根が特に好ましい。

本発明の組織培養に用いられる前記植物の！１ｌＪ１織
として具体的には、該植物の根、葉、茎、種子、花芽な
どの他にも本発明に係わる組織培養あるいは他の従来の
組織培養方法によって得られる該植物の培養細胞ないし
培養組織を例示できる。本発明では、ズボイシア属植物
の場合にはこれらの中では植物組織を前もってｍ織培養
して得られる不定根を使用してこれを本発明に係わる培
地を用いて組織培養することが特に好ましく、この場合
には原料の不定根が本発明の培地を用いて増殖培養され
て二次代謝産物としてスコポラミン、ヒヨスチアミン等
のトロパン系アルカロイドが多量産生され細胞外へ放出
される。

本発明に係わる二次代謝産物として具体的には、トロパ
ン系アルカロイド（スコポラミン、ヒヨスチアミンなど
）、イソキノリン系アルカロイド（ヘルベリンなど）等
の各種アルカロイド、シコニン等の色素類、アルブチン
等の各種配糖体などを例示でき、植物の代謝生産物であ
る。

〔発明の効果〕

本発明に係わる組織培養の方法によれば、植物の二次代
謝産物を培養中に細胞外へ放出させながら培養すること
ができ、又その放出量を増大させることができるので、
従来法に比べて培養系からの二次代謝産物の分離回収が
容易となり、かつ培養植物を廃棄することなく繰り返し
使用することができるため、二次代謝産物の生産性を高
めることができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

比較例１．２及び実施例１〜２ ニラチェ・ニラチェの培地においてＮａ’　イオンの濃
度を１０ｍ旧比較例１　）、２５ｍＭ　（比較例２）、
１２５ｍＭ　（実施例１）及び２５０ｍＭ　（実施例２
）にした改変液体培地を１００ｃＣのエルレンマイヤー
フラスコに２０艷仕込み、これにズボイシアの不定根の
シードを２．０ｇ移植して培養を行い、４週間後にフラ
スコから液体培地のみを全量回収して、この培地中のア
ルカロイドの量をガスクロマトグラフィーによって分析
した結果を表１に示す（Ｒｕｎ　１　）。

次に、先の液体培地を除いた残りの培養フラスコにさら
に先の新鮮な改変液体培地２０ｍβを加えて、４週間培
養後に培養フラスコから液体培地のみを全量回収してこ
の中に含まれるアルカロイドの量を分析した結果を表１
（Ｒｕｎ２）に示した。

比較例３〜４及び実施例３〜４ 実施例１〜２において、Ｎａ”イオンの代わりにに゛イ
オンの濃度を１０ｍＭ（比較例３）、２５ｎ＋Ｍ（比較
例４　）、１２５ｍＭ（実施例３）、２５０ｍＭ　（実
施例４　）とした以外は該実施例と同様に行った結果を
表１に示した。

比較例５及び実施例５〜６ 実施例１〜２において、Ｎａ’　イオンの代わり該実施
例と同様にして行った結果を表１に示した。

比較例６及び実施例７〜８ 実施例１〜２において、Ｎａ＋イオンの代わりにＭｇ　
２−イオンの濃度を５ｍＭ（比較例６　）、２５ｍＭ（
実施例７）及び５０ｍＭ　（実施例８）とした以外は該
実施例と同様にして行った結果を表１に示した。

比較例７（対照） 常法に従い１００ｃｃのエルレンマイヤーフラスコにニ
ラチェ・ニラチェ液体培地（Ｎａ”イオン濃度は０．２
ｍＭ、Ｋ１イオン濃度は１０ｍＭ、Ｃａ２＋イオン濃度
は１．５ｍＭ、Ｍ　ｇ　Ｚ　４イオン濃度は０．８ｍＭ
　）の２Ｑｍｌを仕込み、これにズボイシアの不定根の
シードを２．０ｇ移植して培養を行い、４週間後に、不
定根および培地を回収した。結果を表１に示した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物の二次代謝産物を細胞外へ放出させながら組
   織培養する方法として、液体培地におけるＮａとＫの金
   属イオンの少なくとも１種の濃度を５０ｍＭ以上にした
   培地を用いるか、又は液体培地におけるＣａとＭｇの金
   属イオンの少なくとも１種の濃度を１０ｍＭ以上にした
   培地を用いること特徴とする植物の組織培養方法。