JPS63226278A - 組織培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルカロイド等の二次代謝産物を産生ずる植物
の組織を特定の培地を用いて組織培養して二次代謝産物
を効率よく生産する方法に関する。

〔従来の技術〕

二次代謝産物の一つであるアルカロイドとして例えばス
コポラミンは鎮痙剤、鎮痛剤などとしてまたヒヨスチア
ミンは副交感神経しゃ新薬として重用され、これらの化
合物は、天然の植物体中から抽出して製造されている。

しかし天然物を原料としているため、その生産が天候に
左右されること、収穫時期が限定されていることなどが
問題となっている。そのためこれらの化合物を植物の組
織培養によって生産する研究が数多く行われている。〔
例えばＰｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ上、１０
１〜１０３（１９Ｂ２）　）など。

〔発明が解決しようとする問題点〕

組織培養によって二次代謝産物の工業的な生産を目指す
場合、生産性を高めることが重要な課題である。本発明
者等は二次代謝産物の生産性を高める方法として、細胞
内部で代謝産生きれる二次代謝産物を効率良く細胞外へ
放出させながら培養することができれば、従来法に比べ
て二次代謝産物の生産性を高め効率良く培養できると考
え該方法について検討した。

〔発明の概要〕

その結果、下記方法を採用すれば前記目的を達成できる
ことを見出し本発明を完成するに到った。

すなわち、本発明の方法によれば、植物の組織をスルホ
警ド類（・）、多価アルコール類ｆｂｌ、有機酸［（Ｃ
１及びステロイド［（ｄｌの群から選ばれる少なくとも
１種を含有する液体培地を用いて該植物の二次代謝産物
を細胞外へ放出させながら培養することを特徴とする組
織培養方法が提供される。

〔発明の詳細な説明〕

本発明方法が適用される植物として具体的には、ズボイ
シア・ミオボロイデス（Ｄｕｂｏｉｓｉａｍｙｏρｏｒ
ｏｉｄｅｓ）　、ズボイシア・ライヒハルデイ（Ｄｕｂ
ｏｉｓｉａ　Ｉｅｉｃｈｈａｒｄｔｉｉ）等のズボイシ
ア属植物、ダツラ・ダツラ（Ｄａｔｕｒａ　ｔａｔｕｌ
ａ）、　　ダツラ・アルボレア（Ｄａｔｕｒａ　ａｒｂ
ｏｒｅａ）、ダツラ・ストラモニウム（Ｄａｔｕｒａ　
ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）等のダツラ属植物、スコポリア
・ジャポニカ（５ｃｏｐｏｌｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）
等のスコボリア属植物、ヒョシアマス・ニガー（Ｈｙｏ
ｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ）等のヒコス属植物および
アトローパ嗜へラドンナ（Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａｄ
ｏｎｎａ）等のアトローバ属植物などのナス科植物、オ
ウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃａ　Ｍａｋｉｎ
ｏ）、セリハオウレン（Ｎａｋａｉ）　、キクハオウレ
ン（Ｃ９ｊａｐｏｎｉｋａ　Ｍａｋｉｎ。

ｖａｒ、ｊａｐｏｎｉｋａ）　、コセリハオウレン（Ｃ
，ｊａｐｏｎｉｋａＭａｋｉｎｏ　ｖａｒ、　ｍａｊｏ
ｒ　５ａｔａｋｅ）　、ハイカオウレン（Ｃ１ｑｕｉｎ
ｑｕｅｆｏｌｉａ　Ｍｉｑ、）およびミッハオウレン（
Ｃ，ｔｒｉｆｏｌｉａ　５ａｌｉｓｂ、）等のコプテイ
ス属の植物、アキカラマツ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ　ｍ
１ｎｕｓ　Ｌ、ｖａｒ　ｈｙｐｏｌｅｃｕｍＭｉｑ、）
等のザリク１〜ラム属の植物、ザリントリザ属の植物お
よびヒトラスナス属の植物等を挙げられる。

本発明では前記植物の組織（細胞を含む）を培養するに
当たっては、スルホキシＦ　類（ａｌ、多価アルコール
類（１＋）、有ｍ酸類（Ｃ１及びステロイド類ｆｄｌの
群から選ばれる少なくとも１種を含有する液体培地が用
いられる。

本発明に係わるスルホキシド類（ａｌとして具体的には
ジメチルスルホキシド′、ジエチルスルホキシド、ジブ
チルスルホキシド等のジアルキルスルホキシドなどが例
示できる。本発明では該スルホキシド類（ａｌの培地に
おける濃度としては通常０．０１〜３０Ｖ／Ｖ％、好ま
しくは０．１〜ＩＯＶ／Ｖ％の範囲である。ステロイド
類の濃度が低すぎると二次代謝産物が細胞外へ放出され
に＜＜、又該濃度を高くし過ぎると培養細胞が損傷を受
けるので通常スルホ及↓ド頻の濃度は前記濃度範囲にあ
ることが望ましい。

本発明に係わる多価アルコール［（ｂｌとは、具体的に
はエチレングリコール、ジエチレングリコールやトリエ
チレングリコールなどのポリエチレングリコール、グリ
セリンなどである。

本発明では該多価アルコール類（ｂｌの培地における濃
度としては前記と同じ理由から通常０．０１〜３０ｔｕ
ｔ％、好ましくは０．１〜１０ｗｔ％の範囲にあること
が望ましい。

本発明に係わる有機酸類ｆｃ）とは、具体的には酢酸、
プロピオン酸、醋酸等の飽和脂肪族モノカルボン酸、シ
ュウ酸、コハク酸等の飽和脂肪族ジカルボン酸、フマル
酸、アラキドン酸等の不飽和脂肪酸、酒石酸、リンゴ酸
、コハク酸等の脂肪族ヒドロキシジカルボン酸、クエン
酸等の脂肪族ヒドロキシトリカルボン酸であって、該有
機酸類（ｃ）の培地における濃度としては前記と同じ理
由がら通常１０−８〜ＩＭ、好ましくは１０−６〜１０
−’Ｈの範囲にあることが望ましい。

本発明に係わるステロイドＩＮ　（ｄｌとして具体的に
はテストステロン、β−シトステロール、コレステロー
ル、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴス
テロール、フコステロールなどヲ例示できる。本発明で
は該ステロイド類ｆｄｌの培地における濃度としては前
記と同じ理由から通常１０−５〜１０−’Ｍ　、好まし
くは１０−４〜１０−２Ｍの範囲にあることが望ましい
。

びステロイド類（ｄｌの群から選ばれる少なくとも１種
を必須成分とし、又無機成分および炭素源を必須成分と
し、これに植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更に
必要に応じてアミノ酸類を添加した培地である。

無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナトリウム
、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、
亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバルト等
の元素を含む無機塩を挙げることができ、具体的には硝
酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸
１水素カリウム、リン酸２水素カリウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第１鉄
、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデン酸ナ
トリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫酸亜
鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示できる。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、エタノール等の１級アルコールなどを例示できる
。

該培地の植物ホルモン類としては、例えば、ナフタレン
酢酸（ＮＡＡ）　、インドール酢酸（ＩＡＡ）　、Ｐ−
クロロフェノキシ酢酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２，４−Ｄ）　、インドール酪酸（ＩＢＡ）および
これらのｇ導体等のオーキシン類およびベンジルアデニ
ン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン等のサイトカイニン
類を例示できる。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢｌ）　、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリ
ドキサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム
、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコ
チン酸、ニコチン酸アミドおよびリボプラビン（ビタミ
ンＢ２）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、フェニルアラニンおよびリジンなど
を例示できる。

本発明の前記培地は、通常は、前記無機成分を約０．１
μＭないし約１００ｍＭ、前記炭素源を約１ｇ／ｌない
し約１００　ｇ　／　１、前記植物ホルモン類を約０．
０１μＭないし約１００μＭ１前記ビタミン類を約０．
１ｍｇ　／　１ないし約１５０ｍｇ／　Ｉ！および前記
アミノ類類を口ないし約１００ｍｇ／７！含ませて使用
されることが望ましい。

本発明のズボイシア属植物の組織培養に用いられる前記
培地として具体的には、従来から知られている植物の組
織培養に用いられている培地、例えば、ムラシゲ・スク
ーグ（’６２）　　ＣＭｕｒａｓｈｉｇｅ　＆Ｓｋｏｏ
ｇ　）の培地、リンスマイヤー・スクーグ（ＲＭ−１９
６５）　　（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　Ｆ！、　Ｓｋｏｏｇ
　）の培地、ホワイト（’６３）　　（Ｗｈｉｔｅ　）
の培地、ガンボルグ（ＧａｍｂＯｒｇ　）のＢ−５培地
、三井のト９培地、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｓｃｈ　Ｎ
１ｔｓｃｈ　）の培地等に前記した炭素源および植物ホ
ルモンを添加し、更に必要に応じて前記したビタミン類
、アミノ酸類を添加して調製される培地を例示できるが
、本発明ではこの中でも特にエッチ・エッチ、リンスマ
イヤー・スクーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用い
て調製される培地が好ましい。なお、上記した従来公知
の培地の組成に関しては、例えば、性向、中島、古谷著
の「新植物組織培養Ｊ　Ｐ３Ｂ６〜Ｐ３９１、朝食書店
、１９７９年に記載されている。

本発明で使用できる前記培地は液体培地である。

本発明の組織培養では二次代謝産物を産生ずる植物の組
織片は、前記培地を用いて組織培養されて二次代謝産物
を細胞外へ放出する培養細胞ないし培養組織が得られる
。

本発明では該培養組織としてズボイシア属植物の組織を
用いる場合には不定根が特に好ましい。

本発明の組織培養に用いられる前記植物の組織として具
体的には、該植物の根、葉、茎、種子、花芽などの他に
も本発明に係わる組織培養あるいは他の従来の組織培養
方法によって得られる該植物の培養細胞ないし培養組織
を例示できる。本発明では、ズボイシア属植物の場合に
はこれらの中では植物組織を前もって組織培養して得ら
れる不定根を使用してこれを本発明に係わる培地を用い
て組織培養することが特に好ましく、この場合には原料
の不定根が本発明の培地を用いて増殖培養されて二次代
謝産物としてスコポラミン、ヒヨスチアミン等のトロパ
ン系アルカロイドが多量産生され細胞外へ放出される。

本発明に係わる二次代謝産物として具体的には、トロパ
ン系アルカロイド　（スコポラミン、ヒヨスチアミンな
ど）、イソキノリン系アルカロイド（ヘルベリンなど）
等の各種アルカロイド、シコニン等の色素類、アルブチ
ン等の各種配糖体などを例示でき、植物の代謝生産物で
ある。

〔発明の効果〕

本発明に係わる組織培養の方法によれば、植物の二次代
謝産物を培養中に細胞外へ放出させながら培養すること
ができ、又その放出量を増大させることができるので、
従来法に比べて培養系からの二次代謝産物の分離回収が
容易となり、かつ培養植物を廃棄することなく繰り返し
使用することができるため、二次代謝産物の生産性を高
めることができる。

〔実施例〕

以下、本発明の方法を実施例によって更に具体的に説明
する。

実施例１ １００ｃｃのエルレンマイヤーフラスコにニラチェ・ニ
ラチェの液体培地を２０ｍβ仕込み、これにズ培地に対
して０．１〜５．ＯＶ／Ｖ％添加して培養を続け、１週
間後にフラスコから液体培地のみを全量回収してこの培
地中のアルカロイドの量をガスクロマトグラフィーによ
って分析した結果を表１に示す（Ｒｕｎ　１　）。

次に先の液体培地を除いた残りの培養フラスコに更に新
しいニラチェ・ニラチェの液体培地２０艷を加えて３週
間培養した後、これにジメチルスルホそにドを培地に対
して５Ｖ／Ｖ％添加して培養を続け、１週間後に培養フ
ラスコから液体培地のみを全量回収してこの中に含まれ
るアルカロイドの量を分析した結果（Ｒｕｎ　２　）を
表１に示した。

実施例２〜７ Ａ／ 実施例１においてジメチルスルホ＃キトの代わりに、添
加物をグリセリン（実施例２）、エチレングリコール（
実施例３）、クエン酸（実施例比較例１ 常法に従い１００ｃｃのエルレンマイヤーフラスコにニ
ラチェ・ニラチェ液体培地２０ｍ１を仕込み、ズボイシ
アの不定根のシードを０．５ｇ移植して培養を行い、４
週間後に不定根および培地を回収した。

回収した不定根中に含まれるヒヨスチアミンは３９６μ
ｇ１スコポラミンは１０２３μｇであり、一方墳地中に
存在するヒヨスチアミンは２μｇ、スコポラミンは５μ
ｇであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物の組織をスルホキシド類（ａ）、多価アルコ
   ール類（ｂ）、有機酸類（ｃ）及びステロイド類（ｄ）
   の群から選ばれる少なくとも１種を含有する液体培地を
   用いて該植物の二次代謝産物を細胞外へ放出させながら
   培養することを特徴とする組織培養方法。