JPH04262788A - インドールアルカロイドの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】本発明はニチニチソウ属植物等のイ
ンドールアルカロイドを代謝産生する植物の組織を特定
の培地を用いて組織培養することにより、インドールア
ルカロイド、例えば抗腫瘍剤ビンブラスチンの製造原料
として用いられるカサランチン及び循環器系治療薬とし
て需要のあるアジマリシンを生産する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ニチニチソウ属植物に見出されるインド
ールアルカロイドであるカサランチンは抗腫瘍剤ビンク
リスチンの原料として、またアジマリシンは循環器系治
療薬として、それぞれ商業的に重要な関心が寄せられて
いる。これらの化合物は天然の又は栽培された植物体中
から採取されており、天然物を原料としているため、そ
の生産が天候に左右されること、収穫期が限定されるこ
となどにより、必ずしも市場に安定供給されないことが
問題となっている。その為これらの化合物を植物の組織
培養により生産する研究が数多く行われている。例えば
プラント・セル・レポート〔Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ　６、１４２−１４５　（１９８７）〕に
は、植物ホルモンとして１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
　及びカイネチンを含有する　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｓ
ｋｏｏｇの液体培地に硫酸バナジルを添加してニチニチ
ソウ　（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ）カ
ルスを組織培養すると、カサランチン収量は３５．８ｍ
ｇ／ｌ、アジマリシン収量は１４．３ｍｇ／ｌまで向上
したことが記載されている。しかしながら、工業的見地
からはその生産性を更に高めることが望まれている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、このような組織培養によりインドールアルカロイド
を生産する場合に、生産性を向上することである。この
課題は工業的規模での生産において特に重要である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、かかる現
状から、インドールアルカロイドを産生する植物の組織
培養において、その生産性を向上する培地添加物につい
て検討した結果、アミン類が添加された培地を用いると
、前記植物の組織及び細胞中のインドールアルカロイド
の含量が高められることを見出しこの新知見に基づいて
本発明を完成したものである。

【０００５】従って、本発明のインドールアルカロイド
の生産方法は、インドールアルカロイドを産生する植物
の組織又は細胞をアミン類を含有する培地を用いて組織
培養し、この培養組織又は培養細胞からインドールアル
カロイドを収得することを特徴とするものである。本発
明の方法において組織培養に用いられるインドールアル
カロイドを産生する植物としては、例えばニチニチソウ
属植物のリトル・ブライト・アイ品種　（Ｃａｔｈａｒ
ａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ　ｖａｒ．　Ｌｉｔｔｌｅ
　Ｂｒｉｇｈｔ　Ｅｙｅ）　、ジー・ドン品種　（Ｃ．
ｒｏｓｅｕｓ　Ｇ．　Ｄｏｎ）、リトル・デリカタ品種
（Ｃ．ｒｏｓｅｕｓ　ｃｖ．　Ｌｉｔｌｌｅ　Ｄｅｌｉ
ｃａｔａ）等をあげることができる。

【０００６】前記植物の組織培養は、本発明によりアミ
ン類を含有する培地を用いる以外は、従来普通の手段に
よって行うことができる。本発明に使用しうるアミン類
としては、例えば次のものがあげられる。水酸基で置換
されていてもよいモノ、ジ又はトリアルキルアミン、例
えばメチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジ
エチルアミン、トリエチルアミン、ジエタノールアミン
、トリエタノールアミン；ポリメチレン部がイミノ基で
中断されていてもよく、アミノ基が低級アルキル基で置
換されていてもよいポリメチレンジアミン、例えばエチ
レンジアミン、　　Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパ
ンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテト
ラミン；環状アルキルアミン、例えばシクロペンチルア
ミン、シクロヘキシルアミン。これらのアミン類のうち
好ましいものは、エチレンジアミン［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ
２ＮＨ２］、　Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジ
アミン［（Ｃ２Ｈ５）２Ｎ（ＣＨ２）３ＮＨ２］、ジエ
チレントリアミン［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ
２ＮＨ２］、ジメチルアミン［（ＣＨ３）２ＮＨ］、ト
リエタノールアミン［（ＨＯＣＨ２ＣＨ２）３Ｎ］、及
びシクロヘキシルアミン

【０００７】

【化１】

【０００８】である。アミン類は単独で又は２種以上混
合して使用できる。これらのアミン類は、培地における
アミン類の濃度が通常０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０
．５〜５ｍＭになる量で使用される。従来、インドール
アルカロイド産生植物の組織培養において培地添加物と
してアミン類は使用されなかったので、アミン類の使用
によりインドールアルカロイドの生産性が増大すること
は容易に予想できなかった。

【０００９】本発明で使用される培地は、前記のアミン
類の他に、普通の培地成分を含有する。このような成分
として一般に無機成分及び炭素源が用いられ、これに植
物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更に必要に応じて
アミノ酸類を添加することができる。炭素源としては、
シュクロース、マルトース、ラクトースなどの二糖類、
グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類
、グリセロールなどの糖アルコール、デンプンあるいは
これら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したものを
使用できる。

【００１０】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸１水素カリウム、リン酸２水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルトなどの化
合物として添加できる。

【００１１】植物ホルモン類としては、例えばインドー
ル酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、ｐ−
クロロフェノキシイソ酪酸、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸（２，４−Ｄ）　などのオーキシン類、カイネチ
ン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類
が用いられる。ビタミン類としては、例えばビオチン、
チアミン　（ビタミンＢ１　）　、ピリドキシン　（ビ
タミンＢ６　）　、パントテン酸、アスコルビン酸　（
ビタミンＣ）　、イノシトール、ニコチン酸などが用い
られる。

【００１２】アミノ酸類としては、例えばグリシン、ア
ラニン、グルタミン、システインなどを添加できる。一
般に前記の各成分は、無機成分が約０．１μＭ　ないし
約　１００ｍＭ、炭素源が約１〜約３０ｇ／ｌ　、植物
ホルモン類が約０．０１〜約１０μＭ、ビタミン類及び
アミノ酸類がそれぞれ約０．１〜約１００ｍｇ／ｌ　の
濃度で用いられる。

【００１３】本発明の組織培養に用いられる培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ　（１９６２）　〔Ｍ
ｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ〕の培地、リンスマ
イヤー・スクーグ　（１９６５年）　〔Ｌｉｎｓｍａｉ
ｅｒ　Ｓｋｏｏｇ〕の培地、ホワイト　（１９５４年）
　〔Ｗｈｉｔｅ〕の培地、ガンボルグ〔Ｇａｍｂｏｒｇ
〕のＢ−５培地、三井のＭ−９培地等に前記の植物ホル
モンを添加し、更に必要に応じて前記した炭素源、ビタ
ミン類、アミノ酸類等を添加して調製される培地を例示
できるが、この中でも特にムラシゲ・スクーグの培地を
用いて調製される培地が好ましい。

【００１４】本発明には液体培地及び寒天やゼラチン等
を通常０．５〜１％含有する固型培地のいずれも使用で
きるが、通常は液体培地が好ましい。本発明の組織培養
においては、上記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花
粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいはこれらを本
発明による培地あるいは他の従来の培地によって組織培
養して得られる培養細胞又は培養組織あるいはプラスミ
ドの導入によって形質転換したクラウンゴール組織を使
用することができる。これらの組織又は細胞を本発明に
よりアミン類を添加した培地を用いて組織培養すると、
インドールアルカロイドを多量含有する培養組織又は培
養細胞が得られる。この培養組織又は培養細胞から、メ
タノール等の有機溶媒による抽出によってインドールア
ルカロイドを分離することができる。

【００１５】本発明方法によって得られるインドールア
ルカロイドとしては、カサランチン、アジマリシン、セ
ルペンチン、アンヒドロビンブラスチン、ビンブラスチ
ン、ビンクリスチン等があげられる。本発明の組織培養
の好ましい一例としては、次の方法が挙げられる。先ず
ニチニチソウ属に属する植物の植物体、例えば根、生長
点、葉、茎、種子などから採取される組織片を殺菌処理
後、寒天で固めたムラシゲ・スクーグの固体培地上に置
床し、１０〜３５℃で７〜３０日程度経過させて組織片
の一部をカルス化させる。このようにして得られたカル
スを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化したカ
ルスが得られる。このカルスを増殖に適した液体培地、
例えばムラシゲ・スクーグの液体培地に移して増殖させ
る。液体培地においてさらに生育速度が高められる。こ
の安定化したカルスを、本発明によりアミン類を含有す
る液体培地に添加して培養する。

【００１６】本発明の組織培養における培養温度として
は、通常は約１０〜約３５℃、特に約２３〜約２８℃が
好適である。約１０℃未満では増殖速度が小さく、約３
５℃より高くても同様に増殖速度が小さい。本発明の組
織培養を行うに当たっては、光は必ずしも必要ではない
が、光の照射はインドールアルカロイドの生成を妨げな
い。本発明の方法において液体培地を用いた場合には、
培養終了後に培養組織又は培養細胞をデカンテーション
又は濾過等の方法によって培地から分離し、このものか
ら目的とするインドールアルカロイドを有機溶媒による
抽出等の方法によって分離することができる。液体培地
を用いるとタンク等を利用した大量培養が可能であり、
これも本発明の利点である。

【００１７】

【実施例】以下、本発明の方法を実施例によって更に具
体的に説明する。 実施例１及び２ ナフタレン酢酸及びカイネチンをそれぞれ１ｐｐｍ　及
び０．１ｐｐｍの濃度になるように添加したムラシゲ・
スクーグの寒天培地　（寒天１重量％）　に、前もって
２％アンチホルミン溶液又は７０％エタノール溶液等で
滅菌処理したニチニチソウ　（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕ
ｓ　ｒｏｓｅｕｓ　ｖａｒ．　Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｉｇ
ｈｔ，マダカスガル原産）　の葯の一部を置床し、２５
℃で暗所にて静置培養してニチニチソウのカルスを得た
。次にこのカルスを、上記の２成分を同じ濃度で添加し
たムラシゲ・スクーグの液体培地でロータリーシェーカ
ー上で旋回培養　（振幅２５ｍｍ，　１００ｒｐｍ）　
し、７日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速め、安
定化したニチニチソウカルスを得た。

【００１８】このようにして得られた培養細胞１．２ｇ
　（新鮮重）を、エチレンジアミンそれぞれ１ｍＭ　（
実施例１）　又は５ｍＭ（実施例２）　の濃度になるよ
うに添加し、さらにナフタレン酢酸１ｐｐｍ　及びカイ
ネチン０．１ｐｐｍの濃度になるように添加したムラシ
ゲ・スクーグの液体培地２０ｍｌ入りの　１００ｍｌ容
三角フラスコに移し、７日間振とう培養した。

【００１９】培養終了後、ニチニチソウカルスを濾過に
より採取し、４０℃で１夜風乾したのちその乾燥重量を
測定し、液体培地１Ｌ当たりの培養細胞の生育重量を求
めた。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてカ
サランチン及びアジアリシンのインドールアルカロイド
を抽出し、高速液体クロマトグラフィーを用いて標準品
と比較定量することによってアルカロイド収量を測定し
た。その結果を表１に示す。 実施例３及び４ 実施例１及び２においてエチレンジアミンの代わりにジ
メチルアミンを用いた以外は該実施例と同様に操作した
。その結果を表１に示す。 比較例１ 実施例１においてエチレンジアミンを添加しない培地を
用いた以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表
１に示す。 実施例５及び６ 実施例１及び２においてエチレンジアミンの代わりにト
リエタノールアミンを用いた以外は該実施例と同様に操
作した。その結果を表１に示す。 実施例７及び８ 実施例１においてエチレンジアミンの代わりにジエチレ
ントリアミンを０．５ｍＭ、１．０ｍＭ用いた以外は該
実施例と同様に操作した。その結果を表１に示す。 実施例９ 実施例１においてエチレンジアミンの代わりに　Ｎ，Ｎ
−ジメチル−１，３−プロパンジアミンを１．０ｍＭ用
いた以外は該実施例と同様に操作した。その結果を表１
に示す。 実施例１０ 実施例１においてエチレンジアミンの代わりにシクロヘ
キシルアミンを１．０ｍＭ用いた以外は該実施例と同様
に操作した。その結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】

【発明の効果】本発明の方法によれば、インドールアル
カロイド産生植物の組織培養によって、従来法に比べて
カサランチン、アジマリシン等のインドールアルカロイ
ドを効率良く大量に生産することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　インドールアルカロイドを産生する植
   物の組織又は細胞をアミン類を含有する培地を用いて組
   織培養し、この培養組織又は培養細胞からインドールア
   ルカロイドを収得することを特徴とするインドールアル
   カロイドの生産方法。
2. 【請求項２】　　インドールアルカロイドを産生する植
   物がニチニチソウ属植物であることを特徴とする請求項
   １記載の方法。