JPH06296443A - 植物組織培養による二次代謝産物高生産性苗条の取得方法 - Google Patents

植物組織培養による二次代謝産物高生産性苗条の取得方法

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JPH06296443A
JPH06296443A JP8727193A JP8727193A JPH06296443A JP H06296443 A JPH06296443 A JP H06296443A JP 8727193 A JP8727193 A JP 8727193A JP 8727193 A JP8727193 A JP 8727193A JP H06296443 A JPH06296443 A JP H06296443A
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JP
Japan
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secondary metabolite
shoots
culture
lateral buds
shoot
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JP8727193A
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English (en)
Inventor
Yasusuke Azuma
庸介 東
Yasuhiro Hara
康弘 原
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Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Original Assignee
Mitsui Petrochemical Industries Ltd
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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ニチニチソウ属植物の二次代謝産物の生産能
力の高い苗条を組織培養によって得るに当たって、該苗
条から腋芽を形成させ、これら腋芽の中から二次代謝産
物の生産能力の高い苗条を選抜し、次にこれらを培養し
て再度苗条を得、以後この操作を繰り返すことを特徴と
する二次代謝産物高生産性苗条の取得方法。 【効果】 本発明法は、有用な二次代謝産物の生産能力
が高い苗条の、簡便な取得を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は有用な二次代謝産物を含
有する植物から、植物組織培養法を用いて、二次代謝産
物の生産能力が高い苗条を取得する方法に関する。
【0002】
【従来技術】植物を培養あるいは栽培することによって
各種医薬、色素、甘味剤などが生産されている。かかる
場合、生産性を向上するためには、植物が必要とする栄
養源や温度、光などの環境因子を制御する技術が重要な
ことは言うまでもないが、さらに生産性の高い株を取得
する技術も重要である。植物培養細胞の場合は、カルス
を幾つかの小集塊に分けてそれぞれの生産能を比較し
て、それらの中から高生産株を選抜する方法が広く用い
られている。しかし、植物の生産する二次代謝産物は、
葉や根、花などの分化した器官では生産されるが、カル
スのような未分化細胞では生産されないことが多い。か
かる場合、カルスから優良株を選抜する際に用いられる
小集塊選抜法は適用できない。
【0003】一方近年、遺伝子操作技術を利用して、高
生産株の取得が試みられているが、そのような生産に関
わる遺伝子を取得して、植物細胞内に導入するに至るに
は、熟練した技術及び多くの労力が必要である。
【0004】また伝統的な圃場栽培による交配によっ
て、生産性の高い品種をつくることも行われているが、
この方法は長い年月を要する。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、植物
組織培養法を用いて、二次代謝産物の生産能力の高い苗
条を取得するための簡便な方法を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、組織培養で得た苗条に複数の腋芽が形成する条
件で培養した後、ここで得た腋芽の二次代謝産物の含量
を調べることにより、これの生産能力の高い苗条が取得
し得ること、及びこの腋芽を用いて上記方法を繰り返す
ことにより、二次代謝産物の生産能力が飛躍的に向上し
た苗条を取得できることを見いだし、本発明を完成する
に至った。
【0007】従って、この発明は、組織培養法で得た苗
条に形成した複数の腋芽の中から二次代謝産物の生産能
力の高い腋芽を選抜することにより、二次代謝産物高生
産苗条を取得する方法を提供するものである。本発明で
対象となる二次代謝産物としては、インドールアルカロ
イドが挙げられ、例えばアジマリシン、カサランチン、
タベルソニン、ビンドリン、ビンブラスチン、ビンクリ
スチンがこれに該当する。
【0008】本発明の方法において組織培養に用いられ
る二次代謝産物を生産する植物としては、例えばニチニ
チソウ属植物のリトル・ブライト・アイ品種(Catharant
husroseus var. Little Bright Eye)、ジー・ドン品種
(C.roseus G. Don)、リトル・デリカタ品種(C.roseus c
v. Little Delicata)等を挙げることができる。
【0009】苗条に複数の腋芽を形成させるには、植物
ホルモンであるサイトカイニン好ましくはベンジルアデ
ニンを培地における濃度が、0.01〜5ppm好ましくは0.05
〜1.5ppmになる量で使用する。
【0010】本発明で使用される培地は、通常用いられ
る培地と同様の成分を含有する。このような成分として
一般に無機成分及び炭素源が用いられ、これに前記植物
ホルモン、ビタミン類を添加し、さらに必要に応じてア
ミノ酸類を添加することができる。炭素源としては、シ
ュクロース、マルトース、ラクトースなどの二糖類、グ
ルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、
グリセロールなどの糖アルコール、デンプンあるいはこ
れら糖源の2種類以上を適当な比率で混合したものを使
用できる。
【0011】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等があげられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸1水素カリウム、リン酸2水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルトなどの化
合物として添加できる。
【0012】ビタミン類としては、例えばビオチン、チ
アミン(ビタミンB1 )、ピリドキシン(ビタミンB
6)、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸などが
用いられる。
【0013】アミノ酸類としては、例えばグリシン、ア
ラニン、グルタミン、システインなどを添加できる。一
般に前記の各成分は、無機成分が約0.1μM ないし100m
M、炭素源が約1〜約30g/l、ビタミン類及びアミノ酸
類がそれぞれ約0.1〜約10g/lの濃度で用いられる。
【0014】本発明の組織培養に用いられる培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年)〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ホワイト(1954年)〔Whit
e〕の培地、ガンボルグ〔Gamborg〕のB−5培地、三井
のM−9培地等に前記の植物ホルモンを添加し、更に必
要に応じて前記した炭素源、ビタミン類、アミノ酸等を
添加して調整される培地を例示できるが、この中でも特
にムラシゲ・スクーグの培地を用いて調整される培地が
好ましい。
【0015】本発明には、ゲランガムや寒天等を0.1〜
1%含有する固形培地の使用が好ましい。
【0016】本発明の組織培養の好ましい一例として
は、次の方法が挙げられる。先ずニチニチソウ属に属す
る植物の種子を殺菌処理後、滅菌水を添加した脱脂綿上
に無菌的に置床し、暗黒下にて10〜35℃で5〜10日程経
過させて幼苗を誘導する。このようにして得られた幼苗
を、複数の腋芽を有する苗条が形成するのに適したゲラ
ンガムで固めた固体培地、例えばベンジルアデニンを添
加したムラシゲ・スクーグの固体培地に移植し、光照射
下にて10〜35℃で3〜6週間静置培養する。この培養で
複数の腋芽を有する丈高3〜5cmの苗条が得られる。次
にこの苗条から全ての腋芽を採取し、更にこれらを個別
に上記培地に移植後、上記培養条件下で培養する。この
培養で、腋芽由来で、且つ上記苗条と同様な形態を有す
る複数の苗条が得られる。このようにして得られた腋芽
由来の苗条から、それぞれ一部を切り取り、高速液体ク
ロマトグラフィーにて二次代謝産物の含量を定量する。
ここで最も二次代謝産物の含量の高い苗条1株のみにつ
き腋芽を全て採取し、これらを個別に移植後、上記培養
条件下で培養する。そしてこの培養により得られた苗条
の二次代謝産物の含量を定量後、最も二次代謝産物含量
の高い苗条を選抜し、以降同様の操作を繰り返す。
【0017】本発明の組織培養における培養温度として
は、通常は約10〜約35℃、特に約23〜28℃が生育速度が
早く好適である。
【0018】本発明の組織培養における光照射量として
は、通常は約1000〜約3000lux、特に約1500〜2000luxが
好適である。
【0019】
【実施例】以下、実施例および比較例により本発明を更
に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例
に限定されるものではない。 (実施例1)以下、図1を用いて操作内容を説明する。
【0020】滅菌水を適量添加した脱脂綿(0.75ml/c
m3)に、前もって2%アンチホルミン液または70%エタ
ノール溶液等で滅菌処理したニチニチソウ(Catharanth
us roseus var. Little Bright, マダカスガル原産)の
種子aを無菌的に置床し、暗黒下にて25℃で7日間静置
してニチニチソウの幼苗bを誘導した。次いでこの幼苗
bの根部を破線の示す箇所で切断し、切断後の幼苗cを
ベンジルアデニンが0.1ppmの濃度になるように添加した
ムラシゲ・スクーグ培地の寒天培地(ゲランガム0.2重
量%)に移植後、約1500luxの光照射下で25℃にて3週
間静置培養した。そして複数の腋芽が形成し、且つ基部
からの丈高が3〜5cmの苗条dを得た。
【0021】このようにして得られた苗条dを破線の示
す箇所で切断し、苗条dから腋芽を全て採取した。採取
した腋芽eをそれぞれを個別に上記培地に移植し、次い
で上記培養条件下で3週間培養した。この結果、上記の
腋芽由来で、且つ上記苗条と同様な形態を有する数〜十
数株の苗条fを得た。
【0022】培養終了後、各苗条fの破線枠部分を切り
取り、これらを40℃で1夜風乾した。得られた乾燥試料
は重量測定後、メタノール等によりアルカロイド特にビ
ンドリンを抽出し、次いで高速液体クロマトグラフィー
を用いて標準品ビンドリンと比較定量する事でビンドリ
ン含量を測定した。ここで測定した苗条由来の試料の各
ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表1に示す。
【0023】
【表1】
【0024】(実施例2)実施例1でビンドリン含量を
測定した苗条の内、最もビンドリン含量の高かった苗条
1株を選抜し、これの腋芽を全て採取した。そしてこれ
ら腋芽を該実施例に示した培地と同様の培地に個別に移
植し、更には同様の培養条件下で培養することで、該実
施例と同様な形態を有する数〜十数株の苗条を得た。
【0025】培養終了後、該実施例と同様な操作方法で
乾燥及び抽出を行いビンドリン含量を測定した。ここで
測定した苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビ
ンドリン含量を表2に示す。
【0026】
【表2】
【0027】(実施例3、4)実施例2と同様の操作を
繰り返し2回行った。そしてその結果得た苗条由来の試
料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表3、
表4にそれぞれ示す。
【0028】
【表3】
【0029】
【表4】
【0030】(比較例1)以下、図2を用いて操作内容
を説明する。実施例1と同様の操作により幼苗bを誘導
した後、この幼苗bの根部を破線の示す箇所で切断し、
切断後の幼苗cをインドール酢酸が0.1ppmの濃度になる
ように添加したムラシゲ・スクーグの寒天培地に移植
し、該実施例と同様の培養条件下で3週間培養した。そ
して腋芽を有さず、且つ丈高が10〜15cmの苗条dを得
た。
【0031】このようにして得られた苗条dの茎部を、
破線が示すように最低2枚の葉を含むよう1〜1.5cm間
隔で切り分け、数〜十数株の苗条切断片eを作成した
後、それぞれを個別に上記培地に移植した。そして該実
施例と同様の培養条件下で3週間培養し、苗条の切断片
由来で、且つ上記苗条と同様な形態を有する複数の苗条
を得た。
【0032】培養終了後、該実施例と同様な操作方法で
乾燥及び抽出を行いビンドリン含量を測定した。ここで
測定した苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビ
ンドリン含量を表5に示す。
【0033】
【表5】
【0034】(比較例2)比較例1でビンドリン含量を
測定した苗条の内、最もビンドリン含量の高かった苗条
1株を選抜し、該比較例と同様の操作方法での苗条切断
片を作成した。そしてこれら切断片を該比較例に示した
培地と同様の培地に個別に移植し、更には同様の培養条
件下で3週間培養した。そして該比較例と同様な形態を
有する複数の苗条を得た。
【0035】培養終了後、該実施例と同様な操作方法で
乾燥及び抽出を行いビンドリン含量を測定した。ここで
測定した苗条由来の試料の各ビンドリン含量及び平均ビ
ンドリン含量を表6に示す。
【0036】
【表6】
【0037】(比較例3、4)比較例2と同様の操作を
繰り返し2回行った。そしてその結果得た苗条由来の試
料の各ビンドリン含量及び平均ビンドリン含量を表7、
表8にそれぞれ示す。
【0038】
【表7】
【0039】
【表8】
【0040】以上に示した実施例及び比較例の結果を比
較すると、実施例では、選抜回数を重ねるごとに平均ビ
ンドリン含量が増加するのに対し、比較例では選抜回数
を重ねても平均ビンドリン含量のはっきりとした増加は
みられない。
【0041】
【発明の効果】本発明の方法により植物組織培養法を用
いて二次代謝産物の生産能力が高い苗条を簡便に取得す
ることが可能となる。植物の二次代謝産物の中には各種
医薬、色素、甘味剤等有用な物質が多いのでこの発明に
よりこれらの原料を容易にかつ大量に提供できるように
なる。
【図面の簡単な説明】
【図 1】 本願発明の概要を示す図である。
【図2】 従来技術の概要を示す図である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ニチニチソウ属植物の二次代謝産物の生
    産能力の高い苗条を組織培養によって得るに当たって、
    該苗条から腋芽を形成させ、これら腋芽の中から二次代
    謝産物の生産能力の高い苗条を選抜し、次にこれらを培
    養して再度苗条を得、以後この操作を繰り返すことを特
    徴とする二次代謝産物高生産性苗条の取得方法。
JP8727193A 1993-04-14 1993-04-14 植物組織培養による二次代謝産物高生産性苗条の取得方法 Pending JPH06296443A (ja)

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JP8727193A JPH06296443A (ja) 1993-04-14 1993-04-14 植物組織培養による二次代謝産物高生産性苗条の取得方法

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JPH06296443A true JPH06296443A (ja) 1994-10-25

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ID=13910107

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JP8727193A Pending JPH06296443A (ja) 1993-04-14 1993-04-14 植物組織培養による二次代謝産物高生産性苗条の取得方法

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