JPH0213390A - タベルソニン誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、急性白血病５Ｍ性リンパ腫及び小児腫瘍等
の治療薬として重要なビンクリスチンやビンブラスチン
の生合成中間体と考えられるタベルソニン（ｔａｂｅｒ
ｓｏｎｉｎｅ）誘導体の製造方法に関する。

［従来の技術］ タベルソニンは、キョウチクトウ科チョウジソウ属の多
年生植物であるチョウジソウ（Ａ■５ｏｎｉａｅｌｌｉ
ｐｔｉｃａ　Ｒｏｅｓ、　ｅＬ、　５ｃｈｕｌＬ）やア
メリカチョウジソウ（Ａ、　ｔａｂｅｒｎａｅｍｏｎＬ
ａｎａ　Ｗａｆｔ）の種子に多く含まれているアスピド
スペルマ型のインドールアルカロイドである。急性白血
病、悪性リンパ腫及び小児腫瘍等の治療薬として重要な
ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）やビンブラ
スチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）はビンドリン（ｖｉ
ｎｄｏｌｉｎｅ）とカタランチン（ｃａｔｈａｒａｎＬ
ｈｉｎｅ）を構成単位として成る二量体である。タベル
ソニンは、そのビンドリンの生合成中間体の−っである
と考えられている。

現在、ビンクリスチン又はビンクリスチンの製造は、ニ
チニチソウ植物体からの抽出によって行なわれており、
植物のカルス培養を利用した方法は知られていない。さ
らに、ニチニチソウのカルス培養によりビンドリンの生
成か認められた例もない、もし、タベルソニンからの上
記タベルソニン誘導体の合成が組織培養を利用して行な
うことかできれば、ビンクリスチン又はビンブラスチン
の化学合成の原料になるので有利である。

一方、ビンカ属植物であるニチニチソウの組織培養に関
する先行技術としては特開昭６１−１２４：１９１号及
び特開昭６２−４４１７４号ニニチニチソウのカルス又
は腫瘍組織の培養培地中にハイドロキノンを添加するこ
とによりアルブチンを高収率で得る方法が記載されてい
る。また、特開昭５１−２７４６９４にアクロバクテリ
ウム属に属する微生物をビンカ属植物に感染させ、その
形質転換された培養細胞よりビンカアルカロイドを採取
する方法が記載されている。さらに、特開昭５１−２５
４１２７号にニチニチソウのアルカロイド高生産能を持
つ器官培養株からビンカアルカロイドを回収する方法が
記載されている。これらの先行技術はいずれもニチニチ
ソウの組織培養を利用しているが、タベルソニン誘導体
の製造とは無関係である。

［発明か解決しようとする問題点］ この発明の目的は、植物組織培養による、タベルソニン
からのタベルソニン誘導体の筒便な製造方法を提供する
ことである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、ビンカ屈に属する植
物のカルス又は茎葉器官培養株の組織培養培地中にタベ
ルソニンを添加して組織培養を行なうと、培養物中に多
量のタベルソニン変換物が蓄積されることを見出し、こ
の発明を完成した。

すなわち、この発明は、ビンカ属に属する植物のカルス
又は茎葉器官培養株の組織培養培地中にタベルソニンを
添加して組織培養を行ない、培養物よりタベルソニン誘
導体を回収することを含むタベルソニン誘導体の製造方
法を提供する。

［発明の効果１ この発明により、タベルソニンからのタベルソニン誘導
体の合成か、植物組織培養により簡便に行なうことがで
きるようになった。タベルソニン誘導体は、上述のよう
に、医薬品として１要なビンクリスチンやビンブラスチ
ンの中間体であると考えられるのて、この発明により、
ビンクリスチンやビンブラスチンの化学合成のための原
料を容易に提供できるようになった。

［発明の詳細な説明］ この発明の方法に用いられるビンカ属に属する植物は、
ビンカ属に属するものであればいずれのものであっても
よいか、好ましい例としてニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ　
ｒｏｓｅａ）、ヒメツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ　ｍ
１ｎｏｒ）及びビンカ・シホルミス（Ｖｉｎｃａ　ｄｉ
ｆｆｏｒｍｉｓ）を挙げることかでき、最も好ましくは
ニチニチソウである。

カルス又は茎葉器官培養株の出発原料はビンカ属植物の
いずれの組織に由来するものであってもよいが、カルス
の誘導においては茎、葉、葉柄部が好ましく、茎葉器官
培養株の誘導においては無菌化した種子より発芽させた
幼芽が好ましい。

これを常法に従い、オーキシン及びサイトカイニンを添
加した培地で培養すればカルス又は茎葉器官培養株が得
られる。すなわち、カルス誘導においては、組織片を例
えば７０％エタノール水溶液及び５％次亜塩素酸ナトリ
ウム水溶液等を用いて無菌化し、オーキシンやサイトカ
イニン等の植物成長Ｊｌ箇物質とショ糖等の炭素源を含
んだ寒天栄養培地とに置床する。これを通常２０°Ｃな
いし３０°Ｃの温度下、好ましくは２５°Ｃの暗所下に
て培養を行なうことによりカルスを誘導できる。

一方、茎葉器官培養株の誘導においては、種子をＥ記と
同様の方法で無菌化し、植物成長物質を含まない寒天栄
養培地上で発芽させ、この幼芽を植物成長物質物質を含
んだ寒天栄養培地上で通常２０℃ないし３０℃の温度下
、好ましくは２５℃の明所下（約１０００〜４０００ル
クスの光照射下）において培養することにより多数の分
岐が認められる茎葉器官培養株（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　５
ｈｏｏｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ）か誘導される。カルス誘導
並びに茎葉器官培養株の誘導の際に用いる寒天培養培地
は公知の植物組織培養に用いられるいかなるものでも使
用することかできる０例えばＭｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　
Ｓｋｏｏｇ培地（Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ、　、
　１５．４７３　（１９６２））に必要に応じて植物成
長物質として２．４−シクロロブエノキシ酢酸（２，４
−Ｄ）等のオーキシン類や６−ベンジルアデニン（６−
ＢＡ）等のサイトカイニン類、さらに炭素源としてショ
糖等を添加した寒天培地を用いることができる。添加す
るオーキシン類及すイトカイニン類の濃度は通常１０　
ｍｇ／ｆｊ、以下か好ましく、ショ糖及び寒天の濃度は
それぞれ２〜３重量％及び０．６〜１．０重量％、好ま
しくは３重量％及び０．９重量％である。

このようにして誘導したカルス又は茎葉器官培養株を上
記の培地から寒天を除いた液体培地に移植し、培養する
。培養は振盪しながら行なうことか好ましい、振盪培養
は回転式、往復式のいずれでもよいか、カルスの場合は
往復式、茎葉器官培養株の場合は回転式が好ましい、す
なわち、カルスの懸濁培養においては振幅数５０〜１０
０　ｓｐｓ、好ましくは８０ｓｐｍ、茎葉器官培養株の
液体培養においては回転数１０　ｒｐｍ以下、好ましく
は２〜４ｒｐ醜の回転振盪培養を行なうことか好ましい
。

培養中は光を照射することが好ましいが、カルスの懸濁
培養の場合には暗所下での培養も行なうことができる。

培養温度は２０℃ないし３０℃が好ましく、２５℃か最
も好ましい。

この培養において、培地中にタベルソニンか添加される
。タベルソニンの添加はカルス又は茎葉器官ポ養株の移
植と同時か又は移植後約２０日以内であればいつでもよ
いが、好ましくは７日目から１４４日目間に行なう、ま
た、タベルソニンの添加量は培地当たり約ＺＯＯｐｐ■
Ｃ３４ｇＭ）以下であればいずれの濃度でもタベルソニ
ン誘導体は生産されるが、特に１００　ｐｐ■（６７＃
Ｍ）程度が好ましい、タベルソニン添加後の培養日数は
好ましくは１〜１４日、特に好ましくは１週間程度であ
り、その後、培養液と細胞とに分離して生成されたタベ
ルソニン誘導体を回収する。

タベルソニン誘導体は、細胞（又は茎葉器官培養株）内
及び培養液中の両方から回収することかできる。ホモジ
ナイズした細胞（又は茎葉器官培養株）又は培養液を例
えば酢酸エチルのような有機溶媒で抽出し、例えば逆相
高速液体クロマトグラフィーによって分取することによ
ってタベルソニン誘導体を得ることができる。

この発明の方法によると、主としてロクネリシン及びロ
クネリニンを得ることかできる。

［実施例］ 以下、この発明を実施例に基づいてより具体的に説明す
る。この発明は、下記実施例に限定されるものではない
。なお、下記実施例において、％は特に明示のない限り
ｆ［量％を意味する。

実施例１ （１）ニチニチソウカルスの誘導 マダガスカル産ニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ　ｒｏｓｅａ
Ｌ、）の植物体より新鮮な葉又は茎を摘出し、水で洗浄
後、７０％エタノール水溶液に数秒間浸漬し、減菌水で
３回洗浄した０次に５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に
５〜１５分間浸漬して再度滅菌水で３回洗浄した。この
ようにして無菌化した組織を５１■角程度の大きさに切
断し、これを１．０１ｇ／交の２．４−Ｄと０．１亀ｇ
／ｆＬのカイネチンを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓ
ｋｏｏｇ寒天培地（ショ糖３％、寒天０．９％）に置床
し、２５°Ｃ１暗所下で３週間培養することにより組織
切片よりカルスが形成された。

（２）ニチニチソウカルスの継代培養 （１）で誘導されたカルスな表１に示した寒天栄養培地
（ショ糖３％、寒天０．９％）又は同組成の液体培地に
より３週間毎に継代培養を行なった。培養は２５°Ｃ暗
所下又は明所下（３０００ルクス、１２時間光照射）に
おいて、静置培養又は往復振盪培養（８０５ｐａ）を行
ない、増殖させた。

表１ 培地番号　植物成長調ｆｌＪ物質（■ｇ／見）　基本培
地ｌ　　　　ＮＡＡ　１．Ｋ　Ｏ，１，（ＧＡ　Ｏ，１
り　　　ＲＴ２　　　２．４−ＤＩ、ＫＯ，ｌ、（ＣＡ
Ｏ，ｌ＄）　　ＲＴ３　　　　ＮＡＡＩ、ＫＯ，ｌ　　
　　　　　　　ＭＳ４　　　　ｒＡＡ　Ｏ，２，６−Ｂ
Ａ　２　　　　　　　Ｍ　５ＮＡＡ　：ナフタレン酢酸
、Ｋ：カイネチンＣＡ：カザミノ酸、ＩＡＡ：インドー
ル酢酸＆−ＢＡ：　６−ベンジルアデニン、 ＲＴ　：　Ｒｅｖｉｓｅｄ　Ｔｏｂａｃｃｏ培地（３％
ショ糖含有）Ｍ　Ｓ　：　Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓ
ｋｏｏｇ培地＜３％ショ糖含有）（３）タベルソニンの
調製 添加するタベルソニンはニチニチソウと同じキョウチク
トウ科に届するチョウジソウ属植物の種子より調製した
。すなわち、アメリカチョウジソウ（Ａ＠５ｏｎｉａ　
ｔａｂｅｒｎａｅｇｌｏｎｔａｎａ　Ｗａｉｔ）の種子
、３．１２　ｋｇ　　（生重量）より公知の方法［Ｃｈ
ｅｌ。

Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、　２６．１１８２　（１９
７８）］でタベＪレソニンを抽出し、約４．４ｇの結晶
を得た。

（４）タベルソニン誘導体の製造 １記（２）で誘導したニチニチソウカルスｌＯ〜１５ｇ
を表１に示す培Ｊ′Ｉ１１の液体培地（２５０ｍｌ培地
／１文フラスコ）に移植し、約３０００ルクスの光照射
下（１２時間照射）、２５℃で往復振盪培養（８０ｓｐ
ｍ）を行なった。この前培養の行程は２週間で終了し、
さらに同組成の液体培地に移植した。に、記の条件で２
週間振盪培養後、少量の水に溶かしたタベルソニンを培
地当たりの最終濃度かｔｏｏ　ｐｐ霞（６７ｕＭ）とな
るように無菌的に添加した。さらに、タベルソニン添加
後１週間培養した後、培養液と細胞に分け、タベルソニ
ン誘導体を回収した。

（５）タベルソニン誘導体の回収 培ａ物をナイロンクロスでろ過し、細胞と培養液に分け
、細胞はホモジナイズ後メタノールにて抽出を行ない、
該抽出物をｌＮｌｌＣｌに溶かした後、酢酸エチルを用
い゛Ｃ溶媒分離を行なった。得られた水層分画はさらに
炭酸水素ナトリウムによりｐＨを８〜９にｍｆＭ後、再
び酢酸エチルにより溶媒分離し、該抽出物を得た。一方
、培養液はアンモニアアルカリ性とした後、酢酸エチル
で溶媒分離を行ない、同様に酢酸エチル抽出物を得た。

該抽出物に含まれるタベルソニン誘導体を逆相のカラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーにより分取した。

この逆相高速液体クロマトグラフィーの具体的条件はカ
ラムにＯＤＳカラム（１０ｘ　３００−謹）を使用し、
移動相としてアセトニトリル−酢酸アンモニウム（０，
０５１１）バッファー（５０：４２、ｐＨ４，０）を毎
分４１の速度で流し、ＵＶ３００ｎ論で検出を行なった
０分取した分画を質量分析、赤外吸収、　’ＩＩ−ＮＭ
Ｒ及び１コＣ−ＮＩＩＩＲで分析した結果、主としてタ
ベルソニンがエポキシ化されたロクネリシン及びタベル
ソニンがメトキシ化されたロクネリンか回収されたこと
が判明し、その生産量はそれぞれ４５．８．Ｍ及び５．
４井Ｍであった。なお、上記分析結果を下記に示す。

ロクネリシン 性状：無色結晶 融点＝１９３℃〜１９５℃ 比旋光度：　［ａ　］ｎ＝　−５０５，９°（ｃ−０，
１０，ＥｔＯＨ）Ｉ　Ｒ”’　ｃｍ−’　：コ３７５　
（Ｎ）１）、２１１５［１−２７５０（ボールにヘメ マンハント）、１６７０（共役エステルＣ＝０）、１６
１０　（共役Ｃ＝Ｃ） 質量スペクトルｍ／ｚ：　３５２（Ｍ”）、２１４，１
３８’＋１−ＮＭＲδ：　０．７４（：ＩＨ，ｔ、　Ｊ
−１７，５Ｈｚ、　１８−Ｈｚ）、１７９　（３Ｈ，ｓ
、　（：ＯＯＭｅ）、　［ｉ、８Ｇ−７，１５（４１１
，ｍ、　Ａｒｏｍ。

Ｈ）、　８．９：ｌ　（１１１，ｂｒ、　ｓ、　Ｎ）Ｉ
）ロクネリニン 性状：無色結晶 融点：１６７℃〜１６９℃ 比旋光度：　［ａ　］　ｏ　＝　−８６，４’（ｃｓＯ
，２２，ＥｔＯＩＩ）Ｉ　ＲＫＱ’　ｃｍ−’　：　３
３７５（ＮＨ）、２８５０−２７５０　（ボールマンハ
ンド）、１６７５（共役エステルＣ＝０）。

１６１５　（共役Ｃ＝Ｃ） 質量スペクトルｍＨｚ：コ８２（Ｍ”）、２４４．１３
８’ＩＩ−ＮＭＲδ：　［１，７４（３Ｈ，ｔ、　Ｊ−
７，５ｆｉｚ、　１８−Ｈ３）、３．７９　（３Ｈ，ｓ
、　ＣＯＯＭｅ）、　５．３７　ＣＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝
８．２Ｈｚ、。

１Ｏ−Ｈ）、　６．４０　（Ｉｌｌ、　ｄ、　Ｊ−Ｈｌ
ｚ、　１２−Ｈ）、　７．０１　（Ｉｌｌ。

ｄ、　ＪＪＨｚ、　９−１ｆ）、　８．８９　（ＬＨ，
ｂｒ、ｓ、、　Ｎ１１）一方、比較のため、上記（４）
においてタベルンニンを加えないことを除き、上記と同
様の操作を行なったところ、ロクネリシンもロクネリニ
ンも全く検出されなかった。

裏ム亘ユ 実施例１（４）における培養を、表１に示す培地３の液
体培地を用いることを除いて実施例１と同様の操作を行
なった。その結果、実施例１と同様ロクネリシン及びロ
クネリニンが得られ、その生産量はそれぞれ３１．９．
ｌｉ及び８．９μＭであった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ビンカ属に属する植物のカルス又は茎葉器官培養
   株の組織培養培地中にタベルソニンを添加して組織培養
   を行ない、培養物よりタベルソニン誘導体を回収するこ
   とを含むタベルソニン誘導体の製造方法。
2. （２）前記ビンカ属に属する植物はニチニチソウである
   請求項１記載の方法。