JPS5828290A

JPS5828290A - ナフトキノン系化合物の製造方法

Info

Publication number: JPS5828290A
Application number: JP56124764A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiro Hara; 原　康弘; Chuzo Suga; 菅　忠三
Original assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsui Petrochemical Industries Ltd
Priority date: 1981-08-11
Filing date: 1981-08-11
Publication date: 1983-02-19
Also published as: JPS6112680B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、高等植物の組織培養によって得られる未分化
の細胞群（カルス）を利用してその二次代謝産物を効率
よく製造する方法に関する。更に詳しくは、未分化の細
胞群の生育に適した液体培地で予め増殖させた細胞群を
、更に二次代謝産物の生産に適した改変液体培地で組織
培養することにより、二次代謝産物の製造を効率よく行
う方法に関する。

植物の未分化の細胞群（カルス）を組織培養してその二
次代謝産物を得る試みは、従来からいくつかなされてい
る。例えばムラサキ科の植物であるムラサキの根には、
シコニン等のナフトキノン系化合物が含まれており、各
種医療用途が知られているため、組織培養を利用して、
ムラサキの未分化の細胞群を増殖させ、ナフトキノン系
化合物を製造することが試みられている。

しかし従来の方法は、寒天固体培地を用いるものであり
、製造時の運転、操作が複雑で大量生産には適しておら
ず、また得られるナフトキノン系化合物の生成量も良好
なものとはいえない。

そこで液体培地を利用する方法を検討し、従来ムラサキ
の組織培養に用いられていた固体培地の成分をそのまま
用い、寒天を添加することなく液体培地の形態で用いた
が、細胞群は増殖するものの、シコニン等のナフトキノ
ン系の化合物の生成量はわずかてあり、またその生成量
もバラツキが大きく、安定していなかった。

本発明者らはさらに検討を進め、特定の関係にある２種
類の液体培地で段階的に組織培養すれば、未分化の細胞
群から得られる二次代謝産物の量が著しく増大すること
を見出し本発明に到達した。

すなわち本発明は無機成分および炭素源を必須成分とし
、これに植物ホルモン類、ビタミン類およびアミノ酸類
から選ばれる少なくとも１種類以上の成分を加えた液体
培地で培養すること（第一段階）によって得られる植物
の細胞を、当該液体培地の成分のうち少なくとも一成分
の濃度を低下させた改変液体培地で培養すること（第二
段階）を特徴とする植物の二次代謝産物の製造方法に関
する。

本発明の第一段階で使用される液体培地（Ａ）は、植物
の組織培養に通常用いられる培地であり、無機成分およ
び炭素源を必須成分とし、これに植物ホルモン類、ビタ
ミン類およびアミノ酸類の中の１種類以上を加えた液体
培地である。

無機成分としては、窒素、リン、カリウム、カルシウム
、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素
、銅、モリブデン、塩素、ナトリウム、ヨウ氷、コバル
ト等があり、具体的（こ番ま硝酸カリウム、硝酸ナトリ
ウム、硝酸カルシウム、リン酸１カリウム、リン酸２ナ
トリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネ
シウム、硫酸す）　ＩＪウム、硫醗第−鉄、硫酸第二鉄
、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅飄モリブデ
ン酸ナトリウム、三酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、
塩化コバルトなどが例示される。

また炭素源には、ショ糖等の炭化水素、その誘導体、脂
肪酸等の有機酸、エタノール等の１級アルコールなどが
例示される。

植物ホルモン類には、インドール酢酸（工ＡＡ）、ナフ
タレン酢１２（ＮＡＡ）、ｐ−クロロフェノキシイン酪
酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）な
どのオーキシン類、カイネチン、ゼアチン、ジヒドロゼ
アチン等のサイトカイニン類力５伊Ｊ示される。

ビタミン類には、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ）、
ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ノシントテン酸、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチン酸
などが例示される。

アミノ酸類にはグリシン、アラニン、グルタミン、シス
ティンなどが例示される。

液体培地（Ａ）中の各成分の濃度は広い範囲で変えるこ
とができる。通常は無機成分を約０．１μＭ〜約１００
ｍＭ程度、炭素源を約１　ｇ／ｅ　−５０ｇ／１１程度
、さらに植物ホルモン類を約０・０１μＭ〜約１０μＭ
程度、ビタミン類およびアミノ酸類を、それぞれ約０−
１　ｍｇ／ｎ　〜約１ｏｏｍｇ／Ａ’程度添加して調製
サレる。

液体培地（Ａ）は、植物の未分化の細胞群の育成項一促
進に好適であるものが望ましい。具体的には、スクーグ
の培地、ガンボルグのＢ−５培地およびこれらの改変培地が例示される。

本発明に使用される未分化の細胞群は、植物の植物体、
例えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取された組
織片を殺菌処理後、固体培地に添加し、組織片の一部を
未分化の細胞群に増殖させたものが通常用いられる。

適用される植物には、とくに限定されないが西洋クルミ
などのクルミ科植物、ムラサキなどのムラサキ科植物、
ベニバナイチヤクソウ、ウメガサソウなどのイチヤクソ
ウ科植物、ルリマッリなどのイソマツ科、ヘンナなどの
ミソノ・ギ科植物が例示される。

ムラサキ科の植物の場合は、好適例として以下のものが
ある。すなわち、ムラサキ科の植物の植物体の組織片を
殺菌処理後、寒天で固めたリンスマイヤー・スクーグの
固体培地上に置床し、約１０〜３５℃で約７〜３０日程
度経過後、組織片の一部をカルス化させる。このように
して得られた細胞群を継代培養すると生育速度が漸次高
まり、安定化した細胞群が得られる。この細胞群を前記
の液体培地（Ａ）に添加して培養が行われる。

液体培地（Ａ）中の細胞群の初期濃度は、広い範囲で変
えることができる。通常は液体培地１１に対して、細胞
群を約１ｇ〜約２００ｇ（新鮮重量）程度添加すること
が望ましい。

第一段階において、液体培地（Ａ）は、細胞群の増殖に
適したものであることが望ましく、さらに細胞群は、液
体培地（Ａ）中において継代培養し、漸次生育速度を高
めておくことが望ましい。

ムラサキ科の植物の場合、第一段階においてもナフトキ
ノン系の化合物からなる二次代謝産物がある程度生成す
る場合もあるが、その量は少なく、細胞群の増殖に適し
た条件が必ずしも二次代謝産物の生成に良好な条件とは
ならない。

本発明においては、第一段階の組織培養において、細胞
群の増殖を、とくに旺盛に行わせしめることが好ましく
、このような経歴をもつ細胞群を用いれば、第二段階の
改変液体培地（Ｂ）におけるナフトキノン系化合物など
の二次代謝産物の生装置をさらにいっそう増大させるこ
とができる。

ムラサキの場合においては、とくに第一段階で細胞群に
ナフトキノン系化合物を生産させることなく、増殖のみ
を行わせた後、第二段階へ進めることが好適である。

第一段階の液体培地（Ａ）で組織培養された細胞群は、
液体培地（Ａ）から分離されて、第二段階の改変液体培
地（Ｂ）に添加して、組織培養が続行される。

改変液体培地（Ｂ）の成分構成は、液体培地（Ａ）の培
地成分のうち、少なくとも一成分の濃度を低下させたも
のである。

液体培地（Ｂ）において、液体培地（Ａ）よりも濃度を
低下させる成分としては、無機成分、植物ホルモン類、
ビタミン類およびアミノ酸類の中から選ばれる少なくと
も１種類以上の成分が好ましい。

これらのうちでも、濃度を低下させる成分として、トく
にアンモニウムイオン、硝酸イオン、リン酸イオン、カ
リウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、マンガン
イオン、コバルトイオン、ヨウ素イオン、ナトリウムイ
オン、塩素イオンなどの無機成分、サイトカイニン類、
ビタミン類およびアミノ酸類から選ばれる少なくとも１
種類以上の成分が好適である。

上記の好適な成分の濃度を低下させる限りにおいては、
その他の成分の濃度を変化させても二次代謝産物の生産
は大きな影響を受けない場合が多い。

ただしムラサキ科の植物の場合は、かえって上記以外の
成分の濃度を増加させることが好ましい場合がある。こ
のような成分として銅イオンおよび硫酸イオンがある。

濃度を低下させる成分の液体培地（Ｂ）における濃度は
、液体培地（Ａ）における濃度の約１／２以下とするこ
とがとくに望ましい。また濃度を低下させる成分の濃度
をさらに低下させて約１／１０以下あるいは実質上その
成分が添加されていない液体培地（Ｂ）を用いることも
可能である。

第二段階の液体培地（Ｅ）における細胞群の生育速度は
、液体培地（Ａ）に比べると低下するが、ナフトキノン
系化合物などの二次代謝産物の量は、逆に著しく増大す
る。

液体培地０）における細胞群の初期濃度も、液体培地（
Ｎの場合と同様に広い範囲で変えることができる。

本発明はとくにムラサキ科の植物を利用して、二次代謝
産物であるシコニン等のナフトキノン系の化合物を得る
場合に、好適な効果が得られる。

ムラサキ科の植物の場合、組織培養において光は必ずし
も必要ではなく、かえって暗所での培養がシコニン等の
二次代謝産物の生育に望ましく、培養温度は約１０°Ｃ
未満５５°Ｃ１とくに約２３６Ｃ〜約２８℃が好適であ
る。約１０°Ｃ未満には細胞群の増殖速度が小さく、約
３５°Ｃを越えても同様に細胞群の増殖速度は小さくな
る。

細胞群および液体培地（Ｂ）からナフトキノン系化合物
を分離採取するには、従来から天然品の「紫根」に適用
されている抽出等の方法を採用することができる。

本発明によれば、高等植物の未分化の細胞群（カルス）
から二次代謝産物を効率よく製造することができる。ま
た液体培地が用いられるので、スケールアップや連続操
作が容易であり、簡便な操作て二次代謝産物を多量に製
造することができる０本発明の方法は、必ずしも２種類の液体培地を用いて、
２段階の培養を行う場合のみばかりか、本発明の条件を
満たす関係にある３種類以上の液体培地を用いて、３段
階以上の態様で組織培養することも可能である。

実施例１〜３および比較例〔第一段階の培養〕１００ｍ／のエルレンマイヤーフラスコに第１表に示し
た組成からなるリンスマイヤー・スクーグの改変液体培
地（ただしインドール酢酸１μＭ１カイネチン１０７７
Ｍおよびショ糖３ｏｇ／＃を含む）３０ｍｌを入れ、１
２０℃、１０分間滅菌した。

冷却後０．５ｇのムラサキの新鮮カルス（予め静置培養
法により得た。）を入れて２５℃で１４日間ロータリー
シェーカー上で振幅２５ｍｍ＋、１１００ｒｐで旋回培
養した。

上記培養で得られたカルス０．５ｇを用いて、上記操作
を繰り返す（通常２回）。これにより改変液体培地にお
ける細胞の生育が安定する。

〔第二段階の培養〕

第一段階で使用した改変液体培地（Ｎの組成のうち、少
なくとも１種類の成分の濃度を低下させた第１表に示す
培地（Ｂ１、Ｂ２またはＢ５）を用いて行った。

すなわち培地（ａｌ、Ｂ２またはＢ３）５０ｍｇに、第
一段階で得られた湿潤カルスを０．５ｇ入れ、第一段階
と同様の方法で旋回培養した。

培養後のムラサキのカルスを濾過により採取し、３５℃
で２４時間乾燥させた後、その重量（乾重）を測定し、
液体培地１１あたりの培養細胞の生育転意を求めた。

また得られたカルスから抽出により、シコニンを分離し
、その重量を測定し、液体培地１ｅあたりの総シコニン
生装置を求めた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）無機成分および炭素源を必須成分とし、これに植
物ホルモン類、ビタミン類およびアミノ酸類から選ばれ
る少なくとも１種類以上の成分を加えた液体培地で培養
すること（第一段＃）によって得られる植物の細胞を、
当該液体培地の成分のうち少なくとも１成分の濃度を低
下させた改変液体培地で培養すること（第二段階）を特
徴とする植物の二次代謝産物を製造する方法。
（２）植物がムラサキ科の植物であることを特徴とする
特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
（３）二次代謝産物がナフトキノン系化合物であること
を特徴とする特許請求の範囲第（１）項または第（２）
項記載の方法。
（４）第二段階で濃度を低下させる成分が、アンモニウ
ムイオン、硝酸イオン、リン酸イオン、カリウムイオン
、カルシウムイオン、鉄イオンへマンガンイオン、コバ
ルトイオン、ヨウ素イオン、ナトリウムイオン、塩素イ
オン、サイトカイニン類、ビタミン類およびアミノ酸類
から選ばれる少なくとも１種類以上の成分であることを
特徴とする特許請求の範囲第（１）項ないし第（３）項
のいずれかに記載の方法。
（５）第二段階において、当該成分の濃度を多くとも第
一段階において用いる濃度の１／２以下に低下させるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第（１）項ないし第（４
）項のいずれかに記載の方法。