CN104946628A

CN104946628A - 丝状真菌基因组的提取方法

Info

Publication number: CN104946628A
Application number: CN201510364596.8A
Authority: CN
Inventors: 张春晓; 韩梁彦; 王丽丽
Original assignee: Hebei University of Science and Technology
Current assignee: Hebei University of Science and Technology
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明涉及一种丝状真菌基因组的提取方法，使用蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液对产黄青霉菌、黑曲霉菌、里氏木霉菌、桔青霉菌等丝状真菌菌丝进行酶解，并将酶解处理与超声处理、高温加热处理进行有效结合，从而获得供PCR鉴定用含有丝状真菌基因组的上清液。由本发明的提取方法获得的丝状真菌菌丝酶解液，其上清液直接用于PCR反应，无需进行提纯操作，便能够得到丝状真菌18S rDNA基因条带，操作过程简单、安全、稳定，避免了有毒提取试剂的使用，减少对实验人员的伤害。

Description

丝状真菌基因组的提取方法

技术领域

本发明涉及一种丝状真菌基因组提取方法，尤其涉及一种产黄青霉菌基因组的提取方法。

背景技术

工业微生物中，丝状真菌是一类十分重要的类群，尤其在抗生素、有机酸、酶制剂三大生产领域，丝状真菌的生产性能极为突出，如产黄青霉(Penicillium chrysogenum)是青霉素的重要生产丝状真菌；黑曲霉（Aspergillus niger）是柠檬酸的重要工业发酵菌种; 里氏木霉(Trichoderma reesei ) 是纤维素酶的重要工业发酵菌种。为进一步提高青霉素、柠檬酸及纤维素酶的产量，从分子水平上对工业菌株进行改造有着广泛的应用前景。丝状真菌基因组DNA的提取是进行分子生物学研究的基础，但丝状真菌由于其细胞壁结构坚固，成分复杂，破壁困难，因此丝状真菌基因组提取方法与细菌相比要复杂得多。现行有效的丝状真菌基因组提取方法主要有：酶解法，研磨法、冻融法和微波法、CTAB法、SDS法、试剂盒法、尿素提取法等。这些方法都可以提出较高质量的基因组DNA，能够满足后续的如PCR反应的基因操作需求，但对于成千上万个丝状真菌转化子的分子鉴定及筛选，应用这些常规方法提取基因组，其繁杂的提取过程是限制实验进展的一个重要环节；另外，常规的提取方法中均采用多种试剂对细胞进行破壁处理、酚/氯仿抽提去除蛋白质、乙醇或异丙醇沉淀等多步骤提取DNA，提取过程冗长，且有机试剂具腐蚀性和毒性，对操作者身体健康不利。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种简易、安全，不需使用有毒试剂的丝状真菌基因组的提取方法。

为实现上述目的，本发明的一种丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、获取丝状真菌菌丝；

b、加入酶液：向丝状真菌菌丝加入蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液，得到丝状真菌菌丝液；

c、超声处理：将步骤b获得的丝状真菌菌丝液于40~70W超声5~15min；

d、酶解：将步骤c处理后的丝状真菌菌丝液在25~40℃酶解10~15h，得到丝状真菌菌丝酶解液；

e、将丝状真菌菌丝酶解液静置，待丝状真菌菌丝酶解液分层后，获得供PCR鉴定用含有丝状真菌基因组的上清液；

在步骤a与步骤b之间或步骤d与步骤e之间，设有对丝状真菌菌丝或丝状真菌菌丝酶解液进行高温加热处理步骤，所述高温加热处理步骤中的加热温度为75~100℃，加热时间为5~15min。

对丝状真菌细胞仅进行酶解破壁处理，会因破壁后存在的大量杂质影响，造成DNA不稳定，使后续PCR过程扩增得不到基因条带。本发明采取酶解法, 结合超声处理与高温加热处理的方式：向丝状真菌菌丝加入蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液，然后通过超声处理将丝状真菌菌丝分散到混合酶液中，破坏菌丝的致密状态，使大部分菌丝能够接触到混合酶液而被酶解，同时，超声作用有助于后续酶解反应的进行；之后通过高温处理对细胞裂解后释放的DNase等降解DNA的活性物质及混合酶液中存在的影响PCR反应的活性物质进行灭活，从而使丝状真菌菌丝酶解液的上清液可以直接进行PCR扩增得到丝状真菌18S rDNA基因条带。制备方法中高温加热处理也可在丝状真菌菌丝液加入混合酶液前进行，同样能够对细胞内存在的降解DNA及影响PCR反应的物质起到灭活的作用。本发明的提取方法操作流程简单，且不需使用试剂对DNA进行提纯，避免了毒性试剂对实验人员的伤害，简化了提取过程，使提取方法更安全，稳定。

作为对上述方式的限定，所述高温加热处理步骤中的加热温度为95~98℃，加热时间为10~15min。

作为对上述方式的限定，所述步骤e中丝状真菌菌丝酶解液静置前，用双蒸水稀释，混匀。

所获样品量大时通过稀释有利于PCR反应。

作为对上述方式的限定，所述步骤b每0.05~0.1mg丝状真菌菌丝加入混合酶液1mL，所述混合酶液中蜗牛酶浓度4~8mg/mL，纤维素酶浓度2000~6000U/mL。

酶浓度过低，不足以破坏细胞壁，致使DNA不能有效释放；酶浓度过高，细胞壁裂解完全，细胞膜受到破坏，致使DNA释放出来而被酶解液中物质降解，从而使PCR反应结果受到影响。

作为对上述方式的限定，所述混合酶液中蜗牛酶浓度6~8mg/mL，纤维素酶浓度2000~4000U/mL。

作为对上述方式的限定，所述步骤b混合酶液的配制溶剂为渗透剂，所述渗透剂为0.7mol/L的NaCl溶液、1mol/L山梨醇溶液或裂解液中的一种，所述裂解液为50mM磷酸缓冲液，0.7mol/L KCl，pH5.8的溶液。

混合酶液由蜗牛酶和纤维素酶分别溶解在渗透剂中制得，渗透剂的作用是稳定产黄青霉菌细胞形成的原生质体，降低原生质体受杂质的影响。

作为对上述方式的限定，所述步骤c的超声功率为50W。

作为对上述方式的限定，所述步骤d的酶解温度为28℃，酶解时间为14h。

作为对上述方式的限定，所述丝状真菌为产黄青霉菌、黑曲霉菌、里氏木霉菌或桔青霉菌中的一种。

综上所述，采用本发明的技术方案，获得的丝状真菌菌丝酶解液的上清液不需通过试剂提取处理可直接进行PCR反应，得到18S rDNA基因条带。本发明的丝状真菌基因组提取方法，针对丝状真菌细胞壁的特性，将酶解法、超声处理和高温加热处理有序有效的结合，使操作过程简单、安全、稳定，避免了有毒提取试剂的使用，减少对实验人员的伤害。

附图说明

下面结合附图及具体实施方式对本发明作更进一步详细说明：

图1为本发明实施例1.1的PCR鉴定结果；

图2为本发明实施例1.2的PCR鉴定结果；

图3为本发明实施例2.1的PCR鉴定结果；

图4为本发明实施例2.2的PCR鉴定结果；

图5为本发明实施例2.3.1的PCR鉴定结果；

图6为本发明实施例2.3.2的PCR鉴定结果；

图7为本发明实施例2.3.3的PCR鉴定结果。

具体实施方式

实施例一

本实施例涉及丝状真菌基因组的提取方法。

实施例1.1

本实施例涉及一种丝状真菌基因组的提取方法。

实施例1.1.1

本实施例涉及一种产黄青霉基因组的提取方法，包括以下提取步骤：

a、获取产黄青霉菌丝：将产黄青霉菌的米孢子接种于固体培养基培养，挑取克隆获得产黄青霉菌丝；或接种于含有玉米浆61g/L、蔗糖 20g/L、CaCO₃5g/L的产黄青霉液体生长培养基，26℃震荡培养48h，10000rpm 2min离心收集，获得产黄青霉菌丝；

b、加入酶液：向步骤a的产黄青霉菌丝中加入含蜗牛酶浓度10mg/mL的蜗牛酶液60μL、含纤维素酶浓度10000U/mL的纤维素酶液40μL，共计混合酶液100μL，得到产黄青霉菌丝液；混合酶液由商业购得的蜗牛酶和纤维素酶分别溶于渗透剂制得，蜗牛酶为混合酶，以质量计浓度，纤维素酶为单一酶，以酶活计浓度，渗透剂使用0.7mol/L的NaCl溶液；

c、超声处理：将步骤b获得的产黄青霉菌丝液进行超声处理，超声强度50W，超声时间15min；

d、酶解：将步骤c处理后的产黄青霉菌丝液在28℃酶解14h，得到产黄青霉菌丝酶解液；对产黄青霉菌丝酶解液进行高温加热处理，在95℃加热10min；

e、将产黄青霉菌丝酶解液加入50~100μL双蒸水（ddH₂O）稀释，混匀，静置直至分层，获得供PCR鉴定用含有产黄青霉菌基因组的上清液。

实施例1.1.2

本实施例涉及一种黑曲霉基因组的提取方法，包括以下提取步骤：

a、获取黑曲霉菌丝：将黑曲霉接种于察氏培养基（硝酸钠3g/L,磷酸氢二钾1g/L,硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.5g/L, 氯化钾0.5g/L,硫酸亚铁0.01g/L,蔗糖30g/L,琼脂20g/L）培养，26℃培养6d，获得黑曲霉菌丝；

b、加入酶液：向步骤a的黑曲霉菌丝中加入含蜗牛酶浓度10mg/mL的蜗牛酶液70μL、含纤维素酶浓度10000U/mL的纤维素酶液30μL，共计混合酶液100μL，得到黑曲霉菌丝液；混合酶液由商业购得的蜗牛酶和纤维素酶分别溶于渗透剂制得，蜗牛酶为混合酶，以质量计浓度，纤维素酶为单一酶，以酶活计浓度，渗透剂使用0.7mol/L的NaCl溶液；

c、超声处理：将步骤b获得的黑曲霉菌丝液进行超声处理，超声强度50W，超声时间15min；

d、酶解：将步骤c处理后的黑曲霉菌丝液在28℃酶解14h，得到黑曲霉菌丝酶解液；对黑曲霉菌丝酶解液进行高温加热处理，在98℃加热10min；

e、将黑曲霉菌丝酶解液加入50~100μL双蒸水（ddH₂O）稀释，混匀，静置直至分层，获得供PCR鉴定用含有黑曲霉菌基因组的上清液。

实施例1.1.3

a、获取里氏木霉菌丝：将里氏木霉接种于PDA固体培养基（土豆20g，葡萄糖20g，琼脂15g，ddH₂O定容至1L）培养，28℃恒温培养5-7d，获得里氏木霉菌丝；

b、加入酶液：向步骤a的里氏木霉菌丝中加入含蜗牛酶浓度10mg/mL的蜗牛酶液80μL、含纤维素酶浓度10000U/mL的纤维素酶液20μL，共计混合酶液100μL，得到里氏木霉菌丝液；混合酶液由商业购得的蜗牛酶和纤维素酶分别溶于渗透剂制得，蜗牛酶为混合酶，以质量计浓度，纤维素酶为单一酶，以酶活计浓度，渗透剂使用0.7mol/L的NaCl溶液；

c、超声处理：将步骤b获得的里氏木霉菌丝液进行超声处理，超声强度50W，超声时间15min；

d、酶解：将步骤c处理后的里氏木霉菌丝液在35℃酶解10h，得到里氏木霉菌丝酶解液；对里氏木霉菌丝酶解液进行高温加热处理，在95℃加热15min；

e、将里氏木霉菌丝酶解液加入50~100μL双蒸水（ddH₂O）稀释，混匀，静置直至分层，获得供PCR鉴定用含有里氏木霉菌基因组的上清液。

实施例1.1.4

a、获取桔青霉菌丝：将桔青霉接种于含有玉米浆61g/L、蔗糖 20g/L、CaCO₃5g/L的固体培养基，30℃恒温培养2d，获得桔青霉菌丝；

b、加入酶液：向步骤a的桔青霉菌丝中加入含蜗牛酶浓度10mg/mL的蜗牛酶液60μL、含纤维素酶浓度10000U/mL的纤维素酶液40μL，共计混合酶液100μL，得到桔青霉菌丝液；混合酶液由商业购得的蜗牛酶和纤维素酶分别溶于渗透剂制得，蜗牛酶为混合酶，以质量计浓度，纤维素酶为单一酶，以酶活计浓度，渗透剂使用0.7mol/L的NaCl溶液；

c、超声处理：将步骤b获得的桔青霉菌丝液进行超声处理，超声强度50W，超声时间15min；

d、酶解：将步骤c处理后的桔青霉菌丝液在28℃酶解14h，得到桔青霉菌丝酶解液；对桔青霉菌丝酶解液进行高温加热处理，在98℃加热10min；

e、将桔青霉菌丝酶解液加入50~100μL双蒸水（ddH₂O）稀释，混匀，静置直至分层，获得供PCR鉴定用含有桔青霉菌基因组的上清液。

将实施例1.1.1-1.1.4获得的四种丝状真菌菌丝酶解液的上清液进行PCR反应。PCR反应应用18SrDNA丝状真菌通用引物 18SNS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和18SNS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’扩增，PCR反应总体积为25μL，10×Easy Taq buffer2.5μL，引物（10μmol/L）各0.5μL，模板 DNA1μL，dNTPs1.0μL，Easy Taq（5U/μL,全式金有限公司产品） 0.25μL；反应条件为95℃5min预变性后94℃40s，56℃40s，72℃2min，共进行30个循环，后 72℃延伸10min；扩增产物采用1％琼脂糖凝胶进行电泳。取上述实施例1.1.1-1.1.4的四个上清液各20μL在酶解法加样孔点样，取传统研磨法获取的样品10μL在研磨法加样孔点样并加入DNA Marker5μL，电泳缓冲液为1*TAE，电泳结束后，取琼脂糖凝胶在凝胶成像仪上紫外线透射下观察结果并摄片。

PCR鉴定结果如图1所示，泳道1为Marker，泳道2为以H₂O为模版的阴性对照，泳道3为实施例1.1.1，泳道4为实施例1.1.2，泳道5为实施例1.1.3，泳道6为实施例1.1.4，泳道7为传统方法提取的产黄青霉基因组。根据PCR鉴定结果可见，经过上述提取方法得到的丝状真菌菌丝酶解液的稀释上清液作为DNA模板进行PCR反应，能够得到清晰DNA条带，与传统的研磨法精提基因组PCR结果条带一致。

实施例1.2

b、加入酶液：向步骤a的产黄青霉菌丝中加入含蜗牛酶浓度10mg/mL的蜗牛酶液80μL、含纤维素酶浓度10000U/mL的纤维素酶液20μL，共计混合酶液100μl，得到产黄青霉菌丝液；混合酶液由商业购得的蜗牛酶和纤维素酶分别溶于渗透剂制得，蜗牛酶为混合酶，以质量计浓度，纤维素酶为单一酶，以酶活计浓度，渗透剂使用0.7mol/L的NaCl溶液；

c、超声处理，将步骤c获得的产黄青霉菌丝液进行超声处理，超声强度50W，超声时间15min；

d、酶解：将步骤d处理的产黄青霉菌丝液在28℃酶解14h，得到产黄青霉菌丝酶解液；

e、将产黄青霉菌丝酶解液静置，分层后得到的上清液作为DNA模板进行PCR反应。

PCR反应应用丝状真菌通用引物18SrDNA扩增，PCR反应总体积为25μL，10×Easy Taq buffer2.5μL，引物（10μmol/L）各0.5μL，模板 DNA1μL，dNTPs1.0μL，Easy Taq 0.25μL；反应条件为95℃5min预变性后94℃40s，52-58℃40s，72℃2min，共进行30个循环，后 72℃延伸10min；扩增产物采用1％琼脂糖凝胶进行电泳，取上述实施例1.2的产黄青霉菌丝酶解液25μL在酶解法加样孔点样，取传统研磨法获取的样品10μL在研磨法加样孔点样并加入DNA Marker5μL，电泳缓冲液为1*TAE，电泳结束后，取琼脂糖凝胶在凝胶成像仪上紫外线透射下观察结果并摄片。

PCR鉴定结果如图2所示，泳道1为Marker，泳道2为以H₂O为模版的阴性对照，泳道3为实施例1.2，泳道4为传统方法对照。根据PCR鉴定结果可见，经过上述提取方法得到的产黄青霉酶解液作为DNA模板进行PCR反应，能够得到清晰DNA条带，与传统的研磨法精提基因组PCR结果条带基本一致。

将实施例1.1.1与实施例1.2进行对比，实施例1.1.1的处理效果更稳定，因为高温加热处理置于产黄青霉菌丝液酶解之后，一方面解决了菌丝液及细胞内杂质对DNA稳定性的影响，提高了DNA的浓度；另一方面使蜗牛酶、纤维素酶液中影响PCR的物质失活。

实施例二

本实施例涉及丝状真菌基因组的提取方法中酶解处理、超声处理、高温加热处理各环节的条件因素的影响，以产黄青霉菌进行实验，采用与实施例1.1.1相同的提取方法，不同之处在于条件参数的不同。

实施例2.1

本实施例涉及产黄青霉基因组的提取方法中酶解环节条件参数对PCR鉴定结果的影响。

实施例2.1.1

本实施例涉及产黄青霉基因组的提取方法中使用的酶种类、浓度及加入量对PCR鉴定结果的影响。

PCR鉴定结果如图3所示，泳道1为Marker，泳道2为以H₂O为模板的阴性对照，泳道3为实施例2.1.1.1，泳道4为实施例2.1.1.2，泳道5为实施例2.1.1.3，泳道6为实施例2.1.1.4，泳道7为传统方法对照。根据PCR鉴定结果可见，实施例2.1.1.1和实施例2.1.1.2均能够扩增得到与传统方法对照一致的目的基因条带，而实施例2.1.1.3和实施例2.1.1.4均未扩增得到目的基因。

混合酶液的加入量与菌丝量相对应，若加入过多酶液使酶浓度过高，既浪费试剂又对获得的酶解液中DNA过度稀释，模板量无法达到PCR反应要求；加入过少的酶液使酶液浓度过低，则菌丝酶解不完全，所获酶解液中的DNA量少，亦无法达到PCR反应要求。

实施例2.1.2

本实施例涉及产黄青霉基因组的提取方法中酶液配制溶剂使用不同渗透剂对PCR鉴定结果的影响。

PCR鉴定结果如图4所示，泳道1为Marker，泳道2为以H₂O为模板的阴性对照，泳道3为实施例2.1.2.1，泳道4为实施例2.1.2.2，泳道5为实施例2.1.2.3，泳道6为实施例2.1.2.4，泳道7为传统方法对照。根据PCR鉴定结果可见，实施例2.1.2.1、实施例2.1.2.2和实施例2.1.2.4均能够扩增得到与传统方法对照一致的目的基因条带，但实施例2.1.2.2和实施例2.1.2.4扩增得到的目的条带较弱，实施例2.1.2.3未扩增得到目的基因。

使用H₂O配制酶液，未扩增得到目的PCR条带，因为以水配制酶液作为酶解缓冲液时形成的原生质体提前释放，使得DNA被细胞内释放的DNase等降解，致使不能扩增得到有效PCR条带。三种渗透剂配制的三种酶液获得的PCR扩增效果有明显差异，以0.7mol/L的NaCl溶液最佳，因为PCR过程Taq酶发挥作用受到Na⁺和Cl^-的影响较小，同时NaCl溶液利于稳定DNA，而山梨醇和裂解液中的Na⁺及HPO₃ ^2- H₂PO₃ ^2-离子对Taq活性有影响。

实施例2.1.3

本实施例涉及产黄青霉基因组的提取方法中酶解温度、时间对PCR鉴定结果的影响。

PCR鉴定结果如图5所示，泳道1为Marker，泳道2为以H₂O为模板的阴性对照，泳道3为实施例2.1.3.1，泳道4为实施例2.1.3.2，泳道5为实施例2.1.3.3，泳道6为实施例2.1.3.4，泳道7为实施例2.1.3.5，泳道8为实施例2.1.3.6，泳道9为传统方法对照。根据PCR鉴定结果可见，实施例2.1.3.3和实施例2.1.3.4、实施例2.1.3.6均能够扩增得到与传统方法对照一致的目的基因条带，但实施例2.1.3.3和实施例2.1.3.6扩增得到的目的基因条带较弱，实施例2.1.3.1、实施例2.1.3.2和实施例2.1.3.5均未扩增得到目的基因。

酶解温度的选定既要考虑蜗牛酶和纤维素酶的酶活性，还要考虑制备得到的原生质体的稳定性，酶解温度过高不利于原生质体的存活，致使原生质体破裂，DNA提前释放而被酶解液中杂质降解；酶解时间过短酶解不完全，释放的原生质体数目较少，DNA产量较低，酶解时间过长，原生质体易破裂，导致酶解液中杂质对DNA的降解。

实施例2.2

本实施例涉及产黄青霉基因组的提取方法中超声处理环节超声时间对PCR鉴定结果的影响。

PCR鉴定结果如图6所示，泳道1为Marker，泳道2为以H₂O为模板的阴性对照，泳道3为实施例2.2.1，泳道4为实施例2.2.2，泳道5为实施例2.2.3，泳道6为实施例2.2.4，泳道7为实施例2.2.5，泳道8为传统方法对照。根据PCR鉴定结果可见，未经超声处理如实施例2.2.1和超声时间过长如实施例2.2.5未扩增得到目的基因；超声时间较短如实施例2.2.2扩增得到的目的基因条带较弱，超声时间在10-15min时如实施例2.2.3和实施例2.2.4均能够扩增得到与传统方法对照一致的目的基因条带。

超声的目的是使菌丝松散，利于酶解，超声时间过短无法使菌丝团散开，菌丝酶解不充分，致使释放的DNA量少，得不到有效的PCR条带；超声时间过长，可能破坏细胞壁结构，改变细胞质膜通透性，造成细胞内含物释放，进而使酶解液中不利于DNA稳定的杂质物质发挥作用，对细胞内对DNA进行降解，同时长时间的超声波也使得DNA碎片化，无法扩增得到目的条带。

实施例2.3

本实施例涉及产黄青霉基因组的提取方法中高温加热处理环节温度、时间对PCR鉴定结果的影响。

PCR鉴定结果如图7所示，泳道1为Marker，泳道2为以H₂O为模板的阴性对照，泳道3为实施例2.3.1，泳道4为实施例2.3.2，泳道5为实施例2.3.3，泳道6为实施例2.3.4，泳道7为实施例2.3.5，泳道8为实施例2.3.6，泳道9为实施例2.3.7，泳道10为实施例2.3.8，泳道11为实施例2.3.8，泳道12为传统方法对照。根据PCR鉴定结果可见，未经加热如实施例2.3.1、加热温度过低如实施例2.3.2、加热时间低于5min如实施例2.3.6和实施例 2.3.9均未扩增得到目的基因；90-98℃加热处理10-15min如实施例2.3.3、实施例2.3.4、实施例2.3.5、实施例2.3.7和实施例2.3.8均能够扩增得到与传统方法对照一致的目的基因条带。

高温加热可以将蜗牛酶、纤维素酶和细胞内对DNA有降解作用的物质失活，低于75℃不能有效灭活酶解液中可降解DNA的物质，高于100℃，操作复杂；加热时间过短，不能有效灭活酶解液中降解DNA的物质，加热时间过长，不利于高效率工作。75-100℃加热处理5-15min能够得到目的基因条带，当90-98℃加热处理10-15min时能够得到与传统方法对照一致的清晰的目的基因条带。

根据实施例二的系列实验结果可见，本发明的产黄青霉基因组的提取方法中，酶解、超声处理和高温加热处理缺一不可，且相辅相成，通过三个处理步骤的有序有效结合，使获得的产黄青霉菌丝酶解液的上清液能够直接用于PCR反应，不需使用试剂对DNA进行提纯，便可得到DNA条带，避免了毒性试剂对实验人员的伤害，简化了提取过程，使提取方法更安全，稳定。

Claims

1.一种丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、获取丝状真菌菌丝；

2.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述高温加热处理步骤中的加热温度为95~98℃，加热时间为10~15min。

3.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述步骤e中丝状真菌菌丝酶解液静置前，用双蒸水稀释，混匀。

4.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述步骤b每0.05~0.1mg丝状真菌菌丝加入混合酶液1mL，所述混合酶液中蜗牛酶浓度4~8mg/mL，纤维素酶浓度2000~6000U/mL。

5.根据权利要求4所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述混合酶液中蜗牛酶浓度6~8mg/mL，纤维素酶浓度2000~4000U/mL。

6.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述步骤b混合酶液的配制溶剂为渗透剂，所述渗透剂为0.7mol/L的NaCl溶液、1mol/L山梨醇溶液或裂解液中的一种，所述裂解液为50mM磷酸缓冲液，0.7mol/L KCl，pH5.8的溶液。

7.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述步骤c的超声功率为50W。

8.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述步骤d的酶解温度为28℃，酶解时间为14h。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于：所述丝状真菌为产黄青霉菌、黑曲霉菌、里氏木霉菌或桔青霉菌中的一种。