CN102031252B - 一种快速提取土壤总dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速提取土壤总DNA的方法。本发明提供的方法，依次由以下步骤组成：(1)采用SDS-溶菌酶法裂解土壤样本，得到裂解液；(2)沉淀裂解液中的DNA，收集沉淀；(3)将沉淀溶解后进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化琼脂糖凝胶上的DNA条带，得到土壤总DNA。本发明以粘性土壤、亚粘土、亚沙土为材料，采取SDS和溶菌酶结合的方法裂解细胞释放DNA，用PEG进行沉淀DNA，然后将得到的粗DNA进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶纯化。该方法操作步骤简单，在操作中损失的DNA比较少，得到的DNA量稳定。并且在提取过程中不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体伤害。采用本发明的方法提取得到的DNA的纯度和产量均可以满足PCR实验。
Description
技术领域
本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及一种快速提取土壤总DNA的方法。
背景技术
目前用于土壤总DNA提取方法主要有三种，直接法、间接法和试剂盒法。直接法是直接从土壤中裂解细胞，但目前的传统方法操作步骤太多，所以导致DNA产量低，且最后得到的DNA量不稳定。间接法是先分离细胞再裂解，但许多微生物与土壤颗粒紧密结合，细胞不易分离，导致最终的DNA产量低，且耗时较长。试剂盒法具有简单、快速的优点，但价格昂贵，对大批量样品提取不经济，而且有时候DNA提取不出来。
提取土壤总DNA的传统方法包括如下步骤(JIZHONG ZHOU，et.al，DNA Recoveryfrom soils of Diverse composition，Applied and EnvironmentMicrobiology，Feb.1996，p.316-322.)：
(1)取1g土壤样品，加入3ml DNA提取缓冲液和20μl蛋白酶K，37℃下225rpm水平振荡30min；加入300μl 20％(质量百分含量)SDS水溶液，65℃下水浴2h；室温下6000g离心10min，收集上清液；
(2)在步骤(1)剩余的沉淀中加入1ml DNA提取缓冲液和100μl 20％(质量百分含量)SDS水溶液，振荡10min；65℃水浴10min；室温下6000g离心10min，收集上清液；
(3)在步骤(2)剩余的沉淀中加入1ml DNA提取缓冲液和100μl 20％(质量百分含量)SDS水溶液，振荡10min；65℃水浴10min；室温下6000g离心10min，收集上清液；
(4)将步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)的上清液混合，然后加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25体积苯酚、24体积份氯仿与1体积份异戊醇混合)，12000g离心20min，收集上清液；
(5)加入0.6倍步骤(4)的上清液体积的异丙醇，在室温(25℃左右)下放置1h；室温下16000g离心20min，收集沉淀(粗DNA)；
(6)加入500μl 70％(体积百分含量)冰乙醇水溶液，12000g离心10min，收集沉淀；加入500μl 70％(体积百分含量)冰乙醇水溶液，12000g离心10min，收集沉淀；
(7)沉淀自然干燥后加入去离子水。
步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中的DNA提取缓冲液由溶质和水组成，溶质及其浓度如下：100mM Tris-HCl(pH8.0)；100mM EDTA·2Na(pH8.0)；100mM磷酸钠(pH8.0)；1.5M NaCl；1％(质量百分含量)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速提取土壤总DNA的方法。
本发明提供的提取土壤总DNA的方法，依次由以下步骤组成：
(1)采用SDS-溶菌酶法裂解土壤(样本)，得到裂解液；
(2)沉淀裂解液中的DNA，收集沉淀；
(3)将沉淀溶解后进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化琼脂糖凝胶上的DNA条带，得到土壤总DNA。
所述步骤(2)中的沉淀裂解液中的DNA可包括如下步骤：加入聚乙二醇，2℃-6℃静置20min-40min。所述步骤(2)中的沉淀裂解液中的DNA优选包括如下步骤：加入聚乙二醇，4℃静置30min。
所述步骤(2)中可采用20℃-30℃下13000×g-15000×g离心10min-30min的方式收集所述沉淀。所述步骤(2)中优选采用25℃下14000×g离心20min的方式收集所述沉淀。
在进行所述静置前还可加入可溶性乙酸盐。
所述聚乙二醇可以以聚乙二醇水溶液的形式加入。
所述聚乙二醇优选为PEG8000。
所述可溶性乙酸盐可以以乙酸盐水溶液的形式加入。
所述可溶性乙酸盐优选为乙酸钠。
所述聚乙二醇水溶液具体可为40％(质量百分含量)的聚乙二醇水溶液，所述聚乙二醇水溶液的加入体积具体可为所述裂解液体积的0.42倍。
所述乙酸盐水溶液具体可为3M的乙酸盐水溶液，所述乙酸盐水溶液的加入体积具体可为所述裂解液的体积的0.125倍。
所述步骤(3)中的所述琼脂糖凝胶电泳的参数可为：0.7％-1％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳；50V-80V电压；先垂向电泳15min-25min，然后将凝胶旋转后横向电泳5min-15min。所述步骤(3)中的所述琼脂糖凝胶电泳的参数优选为：0.8％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳；65V电压；先垂向电泳20min，然后将凝胶旋转后横向电泳10min。
所述步骤(3)中，可用TE缓冲液溶解所述沉淀。
所述TE缓冲液具体如下：pH为8.0，由水和溶质组成，所述溶质及其在所述TE缓冲液中的浓度如下：10mM Tris-HCl，1mM EDTA。
所述步骤(1)中的SDS-溶菌酶法可包括如下步骤：用DNA提取缓冲液重悬土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混匀后36℃-38℃反应15min-25min；加入SDS，60℃-70℃水浴20min-40min，20℃-30℃下9000×g-11000×g离心5min-15min，得到的上清液即为裂解液。所述步骤(1)中的SDS-溶菌酶法优选包括如下步骤：用所述DNA提取缓冲液重悬土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混匀后37℃反应20min；加入SDS，65℃水浴30min，25℃下10000×g离心10min，得到的上清液即为裂解液。
所述DNA提取缓冲液具体如下：由水和溶质组成；所述溶质及其在所述DNA提取缓冲液中的浓度如下：100mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM EDTA·2Na(pH8.0)，100mM磷酸钠(pH8.0)，1.5M NaCl。
所述蛋白酶K可以以蛋白酶K溶液的方式加入。
所述溶菌酶可以以溶菌酶溶液的方式加入。
所述SDS可以以SDS水溶液的形式加入。
所述蛋白酶K溶液具体可为20mg/ml的蛋白酶K溶液；所述溶菌酶溶液具体可为50mg/ml的溶菌酶溶液；所述SDS水溶液具体可为20％(质量百分含量)的SDS水溶液；所述土壤、所述DNA提取缓冲液、所述蛋白酶K溶液、所述溶菌酶溶液的配比具体可为：0.5g土壤：1ml DNA提取缓冲液：10μl蛋白酶K溶液：50μl溶菌酶溶液；所述SDS水溶液的加入体积具体可为所述DNA提取缓冲液、所述蛋白酶K溶液和所述溶菌酶溶液的体积总和的十分之一。
本发明提供的方法以粘性土壤、亚粘土、亚沙土为材料，采取SDS和溶菌酶结合的方法裂解细胞释放DNA，用PEG进行沉淀DNA，然后将得到的粗DNA进行琼脂糖凝胶电泳，再进行切胶纯化。该方法操作步骤简单，在操作中损失的DNA比较少，得到的DNA量稳定。并且在提取过程中不使用酚、氯仿，减少了对实验人员的身体伤害。采用本发明的方法提取得到的DNA的纯度和产量均可以用于PCR实验。
附图说明
图1为通过电泳鉴定土壤总DNA的提取效果的电泳图；A：采用步骤一的方法提取土壤总DNA；B：采用步骤二的方法提取土壤总DNA。
图2为通过PCR鉴定步骤一的方法提取土壤总DNA的提取效果的电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。SDS即十二烷基硫酸钠。
实施例1、相关试剂的配制
DNA提取缓冲液由水和溶质组成；所述溶质及其在所述DNA提取缓冲液中的浓度如下：100mM Tris-HCl(pH8.0)，l00mM EDTA·2Na(pH8.0)，100mM磷酸钠(pH8.0)，1.5MNaCl。
TE缓冲液由水和溶质组成；所述溶质及其在所述TE缓冲液中的浓度如下：10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；121℃灭菌30min。
实施例2、土壤总DNA的提取
采集花坛中的新鲜土壤，立即分别采用本发明的方法和背景技术中的传统方法进行总DNA的提取。
一、采用本发明的方法进行总DNA的提取
(1)在2ml的EP管中加入土壤样品0.5g，加入1ml DNA提取缓冲液，漩涡混匀；再加入10μl 20mg/ml蛋白酶K溶液和50μl 50mg/ml溶菌酶溶液，混匀；37℃(36-38℃均可)摇床200rpm震荡20min(15-25min均可)(震荡是为了反应充分，增加DNA提取效率)；加入20％(质量百分含量)SDS水溶液(加入体积为DNA提取缓冲液、蛋白酶K溶液和溶菌酶溶液的混合液的体积的十分之一)，65℃(60-70℃均可)水浴30min(20-40min均可)，每10min上下颠倒混匀一次；25℃(20-30℃均可)下10000×g(9000-11000×g均可)离心10min(5-15min均可)，收集上清液(裂解液)；
(2)加入0.125倍裂解液体积的3M乙酸钠水溶液，混匀后再加入0.42倍裂解液体积的40％(质量百分含量)PEG8000水溶液，4℃(2-6℃均可)静置30min(20-40min均可)；25℃(20-30℃均可)下14000×g(13000-15000×g均可)离心20min(10-30min均可)，收集沉淀(粗DNA)。
(3)将沉淀用70％(体积百分含量)冰乙醇水溶液洗涤1-2次，每次500ul；37℃晾干，加50μl TE缓冲液溶解，得到的溶液为DNA溶液甲。
(4)将DNA溶液甲进行0.8％(0.7％-1％均可)(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，电泳参数为：65V(50～80V均可)电压；先垂向电泳20min(15-25min均可)，然后将凝胶旋转90度，横向电泳10min(5-15min均可)。
(5)用胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司的多功能DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)目录号：DP1502)将琼脂糖凝胶上的DNA回收，得到土壤总DNA，-20℃保存。
二、采用背景技术中的传统方法进行总DNA的提取
土壤样品0.5g。
三、总DNA提取量的鉴定
重复进行两次步骤一的总DNA提取，获得的总DNA质量分别为1876.5ng和1902ng。重复进行两次步骤二的总DNA提取，获得的总DNA质量分别为1017.4ng和1769.4ng。
结果表明，采用本发明的方法进行土壤总DNA提取，稳定性好，产量高。
四、通过电泳鉴定土壤总DNA的提取效果
分别将步骤一得到的土壤总DNA和步骤二得到的土壤总DNA进行0.8％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。图1A中，M：marker；1和2为同一土壤样品，重复进行两次步骤一的操作提取的土壤DNA；图1B中，M：marker；1和2为同一土壤样品，重复进行两次步骤二的操作提取的土壤DNA。结果表明，本发明的方法从同一土壤中提取的总DNA的稳定性好，产量高。
五、通过PCR鉴定土壤总DNA的提取效果
分别将步骤一得到的土壤总DNA和步骤二得到的土壤总DNA作为模板，以16S-1507R和16S-27F组成的引物对(16s rDNA引物对是针对土壤所有细菌16s rDNA基因保守区的引物)扩增土壤微生物的16S rDNA。
16S-1507R：5’-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3’(序列表的序列1)；
16S-27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’(序列表的序列2)。
PCR程序见表1。
表1 PCR程序
将PCR扩增产物进行0.8％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，扩增的目的DNA片段大小为1500bp，结果见图2。图2中：M：marker；1：阴性对照(以ddH2O为模板进行PCR反应后得到的产物)；2：以步骤一得到的土壤总DNA为模板得到的PCR扩增产物。
结果表明，采用本发明的方法提取得到的土壤总DNA的PCR扩增产物在2000bp和1000bp之间有强带。这表明，本方法提供的提取土壤总DNA的方法完全可以满足做PCR的要求。
Claims (3)
1.提取土壤总DNA的方法，依次由以下步骤组成：
(1)采用SDS-溶菌酶法裂解土壤样本，得到裂解液；
(2)沉淀裂解液中的DNA，收集沉淀；
(3)将沉淀溶解后进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化琼脂糖凝胶上的DNA条带，得到土壤总DNA；
所述步骤(2)中的沉淀裂解液中的DNA包括如下步骤：加入3M的乙酸钠水溶液，混匀后再加入质量百分含量为40％的PEG8000水溶液，2℃-6℃静置20min-40min；所述步骤(2)中采用20℃-30℃下13000×g-15000×g离心10min-30min的方式收集所述沉淀；
所述乙酸钠水溶液的加入体积为所述裂解液的体积的0.125倍；所述PEG8000水溶液的加入体积为所述裂解液体积的0.42倍；
所述步骤(3)中的所述琼脂糖凝胶电泳的参数为：质量百分含量为0.7％-1％的琼脂糖凝胶电泳；50V-80V电压；先垂向电泳15min-25min，然后将凝胶旋转后横向电泳5min-15min。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，用TE缓冲液溶解所述沉淀；所述TE缓冲液的pH为8.0，由水和溶质组成，所述溶质及其在所述TE缓冲液中的浓度如下：10mM Tris-HCl，1mM EDTA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的SDS-溶菌酶法包括如下步骤：用DNA提取缓冲液重悬土壤，加入蛋白酶K和溶菌酶，混匀后36℃-38℃反应15min-25min；加入SDS，60℃-70℃水浴20min-40min，20℃-30℃下9000×g-11000×g离心5min-15min，得到的上清液即为裂解液；
所述DNA提取缓冲液由水和溶质组成；所述溶质及其在所述DNA提取缓冲液中的浓度如下：100mM pH8.0的Tris-HCl，100mM pH8.0的EDTA·2Na，100mM pH8.0的磷酸钠，1.5M NaCl；
所述蛋白酶K是以蛋白酶K溶液的方式加入的；所述溶菌酶是以溶菌酶溶液的方式加入的；所述SDS是以SDS水溶液的形式加入的；
所述蛋白酶K溶液为20mg/ml的蛋白酶K溶液；所述溶菌酶溶液为50mg/ml的溶菌酶溶液；所述SDS水溶液为质量百分含量为20％的SDS水溶液；所述土壤、所述DNA提取缓冲液、所述蛋白酶K溶液、所述溶菌酶溶液的配比为：0.5g土壤∶1ml DNA提取缓冲液∶10μl蛋白酶K溶液∶50μl溶菌酶溶液；所述SDS水溶液的加入体积为所述DNA提取缓冲液、所述蛋白酶K溶液和所述溶菌酶溶液的体积总和的十分之一。
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