JP2005073643A - 微生物由来ｄｎａの抽出方法 - Google Patents
微生物由来ｄｎａの抽出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005073643A JP2005073643A JP2003310259A JP2003310259A JP2005073643A JP 2005073643 A JP2005073643 A JP 2005073643A JP 2003310259 A JP2003310259 A JP 2003310259A JP 2003310259 A JP2003310259 A JP 2003310259A JP 2005073643 A JP2005073643 A JP 2005073643A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- microorganism
- protein
- soil
- derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
【課題】 環境中に存在する微生物由来のＤＮＡを効率よく回収する方法を提供する。
【解決手段】 環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程と、試料に含まれるＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加するタンパク質添加工程とを有する。
【選択図】 図１
【解決手段】 環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程と、試料に含まれるＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加するタンパク質添加工程とを有する。
【選択図】 図１
Description
本発明は、環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法に関する。
近年、環境中、例えば、廃棄物処分場における有害ガス発生や汚染物質の長期残留等の問題に対する解決策が検討されている。これらの問題を解決するにあたって、廃棄物処分場の土壌に生息する多様な微生物群により形成される微生物叢の寄与が大きいと認識されている。
例えば、硫化水素等の有害ガス発生には、廃棄物中に含まれる有機物の微生物による分解が関与していると考えられている。
また、有機塩素化合物（ダイオキシン等）、芳香族炭化水素（タール等）等の汚染物質を分解可能な微生物を前記廃棄物処分場で増殖できれば、微生物の働きを利用した汚染物質の除去が効率よく行える。
従って、前記微生物叢を形成する微生物の同定や機能解析等の研究が重要である。
例えば、硫化水素等の有害ガス発生には、廃棄物中に含まれる有機物の微生物による分解が関与していると考えられている。
また、有機塩素化合物（ダイオキシン等）、芳香族炭化水素（タール等）等の汚染物質を分解可能な微生物を前記廃棄物処分場で増殖できれば、微生物の働きを利用した汚染物質の除去が効率よく行える。
従って、前記微生物叢を形成する微生物の同定や機能解析等の研究が重要である。
従来、このような研究を行うに際し、前記廃棄物処分場等の土壌を採取し、この土壌から微生物由来のＤＮＡを回収した後、このＤＮＡを用いて前記微生物の種類や菌数等を遺伝子レベルで解析する方法が採用されてきた。土壌から微生物由来のＤＮＡを回収する方法としては、例えば、土壌に生息する微生物群を培養した後、微生物由来のＤＮＡを回収する方法（間接抽出法）と、採取した土壌試料から直接微生物由来のＤＮＡを回収する方法（直接抽出法）等が知られていた（例えば、非特許文献１参照）。
ジーゾン ゾウ（Ｊｉｚｈｏｎｇ ｚｈｏｕ）， メアリー アン ブランズ（Ｍａｒｙ Ａｎｎ Ｂｒｕｎｓ），及びジェームス Ｍ． ティージェ（Ｊａｍｅｓ Ｍ． Ｔｉｅｄｊｅ）、「異なる組成の土壌からのＤＮＡ回収（ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ Ｓｏｉｌｓ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジ（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、アメリカ微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９６年２月、第６２巻、第２号、ｐ３１６−３２２
土壌から微生物由来のＤＮＡを回収する方法のうち、間接抽出法では、採用した培養条件で生育可能な微生物のＤＮＡのみが回収され、解析対象となる微生物がその培養条件で生育しない場合は所望のＤＮＡが回収できない。また、培養条件に依存した微生物の菌体増殖がおこるので、間接抽出法により回収されたＤＮＡから導かれる微生物の存在比は、採取した土壌中の微生物の存在比を反映するものであるとはいい難い。従って、微生物叢そのものの性状についての情報が得られ難い。
一方、直接抽出法では、微生物由来のＤＮＡの回収率が低い。この理由として、以下のことが考えられえる。つまり、土壌中には、フミン質（腐植質）が含まれていることが知られている。フミン質とはタンパク質を加水分解するとき生ずる黒色不溶物のことであり、一般に、ＤＮＡとの親和性が高い。このフミン質がＤＮＡの抽出に悪影響を与え、ＤＮＡ抽出阻害物質となってＤＮＡの回収率が低下する。この場合、解析されるＤＮＡは、例えば、微生物叢を構成する微生物の中でも優先種（多数派）のＤＮＡが中心となっていると考えられる。
さらに、フミン質が含まれた状態で回収されたＤＮＡを、その後の処理（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素処理、核酸のハイブリダイゼーション等）に供した場合においても各処理に悪影響を及ぼす虞がある。
そのため、微生物叢を形成する微生物の同定や機能解析等の研究を行うに際し、前記微生物叢を構成する微生物のうちの一部の微生物についてのみの情報しか得られない虞があるため、採取した土壌中の微生物の存在比を反映することができない。従って、この場合も、微生物叢そのものの性状についての情報が得られ難い。
さらに、フミン質が含まれた状態で回収されたＤＮＡを、その後の処理（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素処理、核酸のハイブリダイゼーション等）に供した場合においても各処理に悪影響を及ぼす虞がある。
そのため、微生物叢を形成する微生物の同定や機能解析等の研究を行うに際し、前記微生物叢を構成する微生物のうちの一部の微生物についてのみの情報しか得られない虞があるため、採取した土壌中の微生物の存在比を反映することができない。従って、この場合も、微生物叢そのものの性状についての情報が得られ難い。
また、有害ガス発生や汚染物質分解に関与する微生物は、多数派よりむしろ少数派に属する場合が多いと考えられており、このような少数派の微生物由来のＤＮＡを土壌から回収するのは、上述した理由から困難である。
従って、本発明の目的は、環境中に存在する微生物由来のＤＮＡを効率よく回収する方法を提供することにある。
（構成１）
上記目的を達成するための本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第１特徴構成は、環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、前記環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程と、前記試料に含まれるＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加するタンパク質添加工程とを有する点にある。
上記目的を達成するための本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第１特徴構成は、環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、前記環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程と、前記試料に含まれるＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加するタンパク質添加工程とを有する点にある。
後述の実施例１に示したように、３種類の土壌試料＜（ａ）廃棄物処分場における廃棄物層近くの自然土、（ｂ）廃棄物層の土、（ｃ）自然土壌＞から微生物由来のＤＮＡの抽出を直接抽出法により試み、その結果を図３に示した。図３におけるレーン１〜３は、本発明の第１特徴構成のＤＮＡ抽出方法により抽出したＤＮＡ濃縮液、レーン４はマーカー、レーン５〜７は、従来のＤＮＡ抽出方法により回収したＤＮＡ濃縮液、をそれぞれ電気泳動したものに対応する。
従来のＤＮＡ抽出方法においては、非特許文献１によると、土壌試料から微生物由来ＤＮＡを効率よく回収するため、ＤＮＡの抽出工程において、フミン質を取り除く処理（ＣＴＡＢ：ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド、或いは、ＰＶＰＰ：ポリビニルポリピロリドンを添加する）が施されていた。
しかし、本発明者らがこの方法（ＣＴＡＢを添加する：比較例参照）を用いて廃棄物処分場の土壌（試料（ａ）及び（ｂ））から微生物由来のＤＮＡの回収を試みたところ、ほとんどＤＮＡを回収することができなかった（図３：レーン５、６参照）。
ここで、（ｃ）自然土壌（レーン７）からは、スメア状ではあるが約２１ｋｂ付近に高分子ＤＮＡが抽出されている。この高分子ＤＮＡは、一部が壊れた状態であるものの、ＣＴＡＢが自然土壌に含まれているフミン質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制しているため、抽出されたと考えられる。
しかし、本発明者らがこの方法（ＣＴＡＢを添加する：比較例参照）を用いて廃棄物処分場の土壌（試料（ａ）及び（ｂ））から微生物由来のＤＮＡの回収を試みたところ、ほとんどＤＮＡを回収することができなかった（図３：レーン５、６参照）。
ここで、（ｃ）自然土壌（レーン７）からは、スメア状ではあるが約２１ｋｂ付近に高分子ＤＮＡが抽出されている。この高分子ＤＮＡは、一部が壊れた状態であるものの、ＣＴＡＢが自然土壌に含まれているフミン質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制しているため、抽出されたと考えられる。
一般に、有機物成分を多量に含有する廃棄物処分場等の土壌では、自然土壌に比べ夾雑物の混入が多い。従って、本発明者らは、廃棄物処分場の土壌（試料（ａ）及び（ｂ））からほとんどＤＮＡを回収することができなかった原因として、夾雑物が多く含まれる廃棄物処分場の土壌には、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質が存在すると考えた。そして、そのＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制する方法について鋭意研究を行った。
その結果、上記第１特徴構成のように、土壌から微生物由来のＤＮＡを回収する際に、溶菌工程と、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加するタンパク質添加工程とを有するＤＮＡ抽出方法を採用すると、土壌試料（ａ）〜（ｃ）からは、何れも同レベルで多量の高分子ＤＮＡ（約２１ｋｂ）を抽出可能であることが判明した（図３：レーン１〜３参照）。
つまり、本発明のＤＮＡ抽出方法によれば、土壌試料を採取した場所に拘らず、効率よくＤＮＡを抽出できることが判明した。さらに、これらＤＮＡ試料の電気泳動結果はスメア状になっていないことから、高分子ＤＮＡを維持した状態で抽出できるものと認められた。
従って、本発明のＤＮＡ抽出方法は、廃棄物層およびその周縁の土壌に存在すると考えられるフミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制できる方法であると認められる。
以上より、従来のＤＮＡ抽出方法では、フミン質を除去したにもかかわらず、廃棄物処分場の土壌からＤＮＡを回収することはできなかったのに対して、本発明のＤＮＡ抽出方法を採用することによって、種々の夾雑物を含む廃棄物処分場のような土壌であっても微生物由来ＤＮＡを高収率で回収することができた。しかも、本発明のＤＮＡ抽出方法によって抽出され回収されたＤＮＡは高分子の状態を維持しており、その後の解析操作（ＰＣＲによる微生物の同定等）を遂行可能な品質を保持していると考えられる（図４（イ）参照）。
従って、本発明のＤＮＡ抽出方法を採用すると、微生物由来のＤＮＡの回収率が高く、その結果、土壌における微生物叢そのものの性状についての情報が得られ易くなる。これにより、発明のＤＮＡ抽出方法は、微生物叢のモニタリング、有用微生物の探索等のための微生物由来ＤＮＡの解析に供するサンプルを調製するのに有効な方法となり、かつ、ＤＮＡ抽出後の解析（ＰＣＲ、制限酵素処理、核酸のハイブリダイゼーション等）において正確な結果を得やすい方法であると認められる。
（構成２）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第２特徴構成は、上記第１特徴構成に加えて、前記溶菌工程と前記タンパク質添加工程とを同時に行う点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第２特徴構成は、上記第１特徴構成に加えて、前記溶菌工程と前記タンパク質添加工程とを同時に行う点にある。
後述の実施例５には、溶菌工程を先に行う場合、３０分以内にタンパク質添加工程を行うと効率よく高分子ＤＮＡが抽出できることが示されている（図１０：レーン８〜１１参照）。
特に、溶菌工程を行った後、０分経過後（レーン８）にタンパク質添加工程を行った場合において（つまり、溶菌工程とタンパク質添加工程とを同時に行う）、最も濃い高分子ＤＮＡバンドが確認されている。
そのため、溶菌工程とタンパク質添加工程とを同時に行うと、最も効率よくＤＮＡを抽出できるものと認められる。
特に、溶菌工程を行った後、０分経過後（レーン８）にタンパク質添加工程を行った場合において（つまり、溶菌工程とタンパク質添加工程とを同時に行う）、最も濃い高分子ＤＮＡバンドが確認されている。
そのため、溶菌工程とタンパク質添加工程とを同時に行うと、最も効率よくＤＮＡを抽出できるものと認められる。
つまり、上記第２特徴構成のように、前記溶菌工程と前記タンパク質添加工程とを同時に行うことにより、種々の夾雑物を含む土壌から微生物由来の高分子ＤＮＡを高収率で回収することが可能となる。
また、両工程を同時に行うため、ＤＮＡ抽出時間を短縮することが可能となり、効率よくＤＮＡ抽出作業を行うことができる。
つまり、本発明に係るＤＮＡの抽出方法は、溶菌工程の他に、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加する、という簡便な工程を付加するだけで、微生物由来の高分子ＤＮＡを高収率で回収することが可能となるため、簡便なＤＮＡ抽出方法である。
（構成３）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第３特徴構成は、上記第１特徴構成に加えて、前記溶菌工程を行った後、３０分以内に前記タンパク質添加工程を行う点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第３特徴構成は、上記第１特徴構成に加えて、前記溶菌工程を行った後、３０分以内に前記タンパク質添加工程を行う点にある。
上述のように、後述の実施例５には、溶菌工程を先に行う場合、３０分以内にタンパク質添加工程を行うと効率よく高分子ＤＮＡが抽出できることが示されている（図１０：レーン８〜１１参照）。
つまり、上記第３特徴構成のように、前記溶菌工程を行った後、３０分以内に前記タンパク質添加工程を行うことにより、種々の夾雑物を含む土壌から微生物由来の高分子ＤＮＡを高収率で回収することが可能となる。
つまり、本発明に係るＤＮＡの抽出方法は、溶菌工程の他に、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加する、という簡便な工程を付加するだけで、微生物由来の高分子ＤＮＡを高収率で回収することが可能となるため、簡便なＤＮＡ抽出方法である。
（構成４）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第４特徴構成は、上記第１〜３の特徴構成の何れか一項に加えて、前記試料中の夾雑物を除去する精製工程を行う点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第４特徴構成は、上記第１〜３の特徴構成の何れか一項に加えて、前記試料中の夾雑物を除去する精製工程を行う点にある。
上記第４特徴構成によれば、環境中から採取した試料に含まれる夾雑物を除去できるため、純度の高いＤＮＡを得ることができる。そのため、ＤＮＡ抽出後の解析（ＰＣＲ、制限酵素処理、核酸のハイブリダイゼーション等）において、さらに正確な結果を得やすくなる。
（構成５）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第５特徴構成は、上記第１〜４の特徴構成の何れか一項に加えて、前記タンパク質が、リゾチーム、インシュリン、ウシ血清アルブミンからなる群から選択される１種以上のタンパク質である点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第５特徴構成は、上記第１〜４の特徴構成の何れか一項に加えて、前記タンパク質が、リゾチーム、インシュリン、ウシ血清アルブミンからなる群から選択される１種以上のタンパク質である点にある。
後述の実施例１及び３に示したように、前記タンパク質添加工程において、ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤として、リゾチーム、インシュリン、ウシ血清アルブミンをそれぞれ添加した実験を行ったところ、何れにおいても同等の高いＤＮＡ回収率が得られることが判明した（図６参照）。
従って、上記第５特徴構成のように、リゾチーム、インシュリン、ウシ血清アルブミンからなる群から選択される１種以上のタンパク質を前記タンパク質添加工程において添加すると、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を効果的に抑制できると考えられる。
従って、上記第５特徴構成のように、リゾチーム、インシュリン、ウシ血清アルブミンからなる群から選択される１種以上のタンパク質を前記タンパク質添加工程において添加すると、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を効果的に抑制できると考えられる。
これより、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質は、リゾチームのように酵素活性を有するタンパク質に限定されないことが判る。そして、これらタンパク質が、例えば、ＤＮＡ抽出阻害物質を絡めとる等してＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制しているものと考えられる。
（構成６）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第６特徴構成は、上記第１〜５特徴構成の何れか一項に加えて、前記タンパク質添加工程において、タンパク質を終濃度２.０〜１６．０ｍｇ/ｍＬとなるように添加する点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第６特徴構成は、上記第１〜５特徴構成の何れか一項に加えて、前記タンパク質添加工程において、タンパク質を終濃度２.０〜１６．０ｍｇ/ｍＬとなるように添加する点にある。
後述の実施例４に記載したように、ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤としてのタンパク質を終濃度が０.５〜１６.０ｍｇ/ｍＬになるように添加した場合におけるそれぞれのＤＮＡ抽出量を調べた（図７〜８）。その結果、終濃度が２.０〜４.０ｍｇ/ｍＬ（図７：レーン５〜７）及び８.０〜１６.０ｍｇ/ｍＬ（図８：レーン５〜６）において、効率よくＤＮＡを抽出できることが判明した。
従って、上記第６特徴構成のように、前記タンパク質添加工程において、タンパク質を終濃度２.０〜１６．０ｍｇ/ｍＬとなるように添加すると、この濃度範囲で最も効率よくＤＮＡを抽出できると認められる。
（構成７）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第７特徴構成は、上記第１〜６の特徴構成の何れか一項に加えて、前記溶菌工程において、界面活性剤を添加し、室温で処理する点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第７特徴構成は、上記第１〜６の特徴構成の何れか一項に加えて、前記溶菌工程において、界面活性剤を添加し、室温で処理する点にある。
後述の比較例によると、界面活性剤を添加した場合の処理温度は６５℃であったが、このように処理して抽出されたＤＮＡは、ＤＮＡがデグラデーションを引き起こして微生物由来の高分子ＤＮＡの一部が壊れた状態となる（図３：レーン７参照）。
しかし、上記第７特徴構成のように、前記溶菌工程において、界面活性剤を添加して室温のような穏やかな温度条件で処理することにより、高分子ＤＮＡがデグラデーションを引き起こして微生物由来の高分子ＤＮＡの一部が壊れて低分子化するのを抑制することができると考えられる。
しかし、上記第７特徴構成のように、前記溶菌工程において、界面活性剤を添加して室温のような穏やかな温度条件で処理することにより、高分子ＤＮＡがデグラデーションを引き起こして微生物由来の高分子ＤＮＡの一部が壊れて低分子化するのを抑制することができると考えられる。
（構成８）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第８特徴構成は、
環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、
前記環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程を有し、
前記溶菌工程において界面活性剤を添加し、処理温度が２５〜５５℃である
点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第８特徴構成は、
環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、
前記環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程を有し、
前記溶菌工程において界面活性剤を添加し、処理温度が２５〜５５℃である
点にある。
後述の実施例６に示したように、廃棄物層の土壌試料から微生物由来のＤＮＡを抽出する実験を行った。
従来のＤＮＡ抽出方法においては、溶菌工程では、界面活性剤を添加した後、６５℃で処理を行っていた。この条件で溶菌処理を行った土壌試料から抽出されたＤＮＡを電気泳動したところ、図１１のレーン７に示した結果が得られた。
従来のＤＮＡ抽出方法においては、溶菌工程では、界面活性剤を添加した後、６５℃で処理を行っていた。この条件で溶菌処理を行った土壌試料から抽出されたＤＮＡを電気泳動したところ、図１１のレーン７に示した結果が得られた。
一方、上記第８特徴構成のように、前記溶菌工程において界面活性剤を添加し、処理温度を２５〜５５℃で行った土壌試料から抽出されたＤＮＡを電気泳動したところ、図１１のレーン２〜６に示した結果が得られた。
これらの結果を検討すると、レーン２〜７の各レーンには、約２１ｋｂの高分子ＤＮＡのバンドが存在することが確認された。しかし、ＤＮＡバンドの濃さから、レーン２〜６（処理温度：２５〜５５℃）においては、多量の高分子ＤＮＡが抽出されているが、レーン７（処理温度：６５℃）においては、ＤＮＡ抽出量はレーン２〜６に比べて少ないことが判った。
従って、溶菌工程において、界面活性剤を添加し、処理温度は従来の処理温度より低い温度（２５〜５５℃）で処理することにより、効率よく高分子ＤＮＡを抽出できるものと認められる。
従って、本発明のＤＮＡ抽出方法を採用すると、微生物由来のＤＮＡの回収率が高く、その結果、土壌における微生物叢そのものの性状についての情報が得られ易くなる。これにより、発明のＤＮＡ抽出方法は、微生物叢のモニタリング、有用微生物の探索等のための微生物由来ＤＮＡの解析に供するサンプルを調製するのに有効な方法となり、かつ、ＤＮＡ抽出後の解析（ＰＣＲ、制限酵素処理、核酸のハイブリダイゼーション等）において正確な結果を得やすい方法であると認められる。
（構成９）
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第９特徴構成は、上記第７又は８の特徴構成に加えて、前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である点にある。
本発明に係る環境中に存在する微生物由来ＤＮＡの抽出方法の第９特徴構成は、上記第７又は８の特徴構成に加えて、前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である点にある。
上記第９特徴構成によれば、界面活性剤として一般的なＳＤＳを使用して処理を行うことができるため、簡便に抽出処理を行うことができる。
以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
本発明に係る微生物由来ＤＮＡの抽出方法は、土壌から微生物由来のＤＮＡを回収する際に、（Ｉ）タンパク質を添加する方法、或いは、（ＩＩ）界面活性剤を添加して２５〜５５℃で処理する方法、がある。以下に、各方法について説明する。
本発明に係る微生物由来ＤＮＡの抽出方法は、土壌から微生物由来のＤＮＡを回収する際に、（Ｉ）タンパク質を添加する方法、或いは、（ＩＩ）界面活性剤を添加して２５〜５５℃で処理する方法、がある。以下に、各方法について説明する。
（Ｉ）タンパク質を添加する方法
この方法は、例えば、環境中から採取した土壌試料から直接微生物由来のＤＮＡを回収する方法（直接抽出法）に適用することができる。
図１に本発明の微生物由来ＤＮＡの抽出方法の概略を示す。
この方法は、例えば、環境中から採取した土壌試料から直接微生物由来のＤＮＡを回収する方法（直接抽出法）に適用することができる。
図１に本発明の微生物由来ＤＮＡの抽出方法の概略を示す。
（１）試料
土壌試料として、例えば、自然土壌（山土、田畑土、庭土等）、廃棄物等の夾雑物を含む土壌、汚泥等がある。
その他、環境中から採取した試料として、廃棄物処分場、山、田畑、庭からの滲出水、及び汚泥から分離した水分等の液体試料等がある。
土壌試料として、例えば、自然土壌（山土、田畑土、庭土等）、廃棄物等の夾雑物を含む土壌、汚泥等がある。
その他、環境中から採取した試料として、廃棄物処分場、山、田畑、庭からの滲出水、及び汚泥から分離した水分等の液体試料等がある。
本明細書で「廃棄物」とは、一般廃棄物、産業廃棄物の別を問わず、例えば、廃油、廃酸、廃アルカリ、紙くず、木くず、繊維くず、動植物性残渣、動物の糞尿、動植物死体、煤塵、燃えがら、汚泥、鉱さい等をいう。これら廃棄物は、自然土壌に含まれない夾雑物を含んでいたり、自然土壌に比べて非常に高い含有率で夾雑物を含んでいたりする。
この夾雑物の中には、微生物由来のＤＮＡを抽出する際に、ＤＮＡと挙動を共にする等してＤＮＡ抽出を阻害する物質（ＤＮＡ抽出阻害物質）が存在している。そして、このＤＮＡ抽出阻害物質は、ＤＮＡ抽出後の処理（ＰＣＲ、制限酵素処理、核酸のハイブリダイゼーション等）に悪影響を及ぼす虞がある。
このような廃棄物処分場から採取した土壌試料には、フミン質や、それ以外のＤＮＡ抽出阻害物質が存在すると考えられる。
この夾雑物の中には、微生物由来のＤＮＡを抽出する際に、ＤＮＡと挙動を共にする等してＤＮＡ抽出を阻害する物質（ＤＮＡ抽出阻害物質）が存在している。そして、このＤＮＡ抽出阻害物質は、ＤＮＡ抽出後の処理（ＰＣＲ、制限酵素処理、核酸のハイブリダイゼーション等）に悪影響を及ぼす虞がある。
このような廃棄物処分場から採取した土壌試料には、フミン質や、それ以外のＤＮＡ抽出阻害物質が存在すると考えられる。
（２）溶菌工程
上述した試料（例えば、廃棄物処分場から採取した土壌試料）に存在する微生物の細胞壁や細胞膜を破砕し、微生物由来のＤＮＡを菌体内から抽出する。そのため、溶菌液を前記土壌試料と接触させて菌体を溶菌させる。
上述した試料（例えば、廃棄物処分場から採取した土壌試料）に存在する微生物の細胞壁や細胞膜を破砕し、微生物由来のＤＮＡを菌体内から抽出する。そのため、溶菌液を前記土壌試料と接触させて菌体を溶菌させる。
前記溶菌液は、緩衝液に、微生物の細胞壁や細胞膜を破砕するタンパク質分解酵素、或いは、界面活性剤等が含まれたものが適用可能である。前記緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等、前記タンパク質分解酵素としては、プロテイナーゼＫ等、前記界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、イソオクチルフェノールポリエトキシアルコール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（商標））等が例示されるが、これに限られるものではない。
前記溶菌液に含まれるタンパク質分解酵素や界面活性剤の濃度は、特に制限はないが、その作用を発揮するのに十分な範囲としては、例えば、プロテイナーゼＫの場合は終濃度で２００μｇ/ｍＬ程度、ＳＤＳの場合は終濃度で２〜２０％程度となるように添加することができる。
前記溶菌液による処理温度は、従来法では、例えば６０℃以上の温度であったが、このような高い温度では、ＤＮＡが損傷して低分子化する虞があった。そのため、ＤＮＡの低分子化を抑制するために、室温程度の温度で処理を施すことが好ましい。
（３）タンパク質添加工程
上述したように、廃棄物処分場から採取した土壌試料には、複数のＤＮＡ抽出阻害物質が存在している。
本発明においては、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するために、前記土壌試料に、ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤としてタンパク質を添加する工程を有する。
上述したように、廃棄物処分場から採取した土壌試料には、複数のＤＮＡ抽出阻害物質が存在している。
本発明においては、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するために、前記土壌試料に、ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤としてタンパク質を添加する工程を有する。
このタンパク質（ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤）としては、例えば、リゾチーム、インシュリン、ウシ血清アルブミンをはじめとする種々のタンパク質を用いることができる。そして、その作用を発揮するのに十分な添加量の最適な範囲としては、例えば、終濃度で２．０〜１６．０ｍｇ/ｍＬ程度となるように添加することができる。
尚、溶菌工程とタンパク質添加工程の順序は、何れを先に行ってもよく、さらに、両工程同時に行うことも可能である。
このように、溶菌工程とタンパク質添加工程を行った後、微生物由来のＤＮＡが含まれる上澄み液（ＤＮＡ抽出液）を次の工程に供する。
（４）精製工程
ＤＮＡ抽出液から、タンパク質、脂質或いは多糖類等の夾雑物を除去して微生物由来のＤＮＡを精製する精製工程を行う。
この精製工程としては、例えば、フェノールやクロロホルム等を用いた有機溶媒による精製、或いは、限外濾過膜を用いた精製等を適用することが可能である。
ＤＮＡ抽出液から、タンパク質、脂質或いは多糖類等の夾雑物を除去して微生物由来のＤＮＡを精製する精製工程を行う。
この精製工程としては、例えば、フェノールやクロロホルム等を用いた有機溶媒による精製、或いは、限外濾過膜を用いた精製等を適用することが可能である。
廃棄物処分場から採取した土壌試料には、自然土壌に比べて多糖類やタンパク質等の夾雑物の混入が多い。そのため、エタノール沈殿のように、アルコールを用いてＤＮＡの濃縮を行うと、ＤＮＡと共に前記夾雑物も沈殿するため粗悪な純度の低い試料となり、ＰＣＲなどの後の処理に悪影響を及ぼす虞がある。
そのため、廃棄物処分場から採取した土壌試料から微生物由来のＤＮＡを回収する際には、例えば、限外濾過膜（半透膜等）を用いた限外濾過を行って夾雑物の除去やＤＮＡの濃縮を行うのが好ましい。この工程は、限外濾過フィルターカラム等を用いて行うことが可能である。
そのため、廃棄物処分場から採取した土壌試料から微生物由来のＤＮＡを回収する際には、例えば、限外濾過膜（半透膜等）を用いた限外濾過を行って夾雑物の除去やＤＮＡの濃縮を行うのが好ましい。この工程は、限外濾過フィルターカラム等を用いて行うことが可能である。
（５）電気泳動工程
精製工程により濃縮して得られたＤＮＡ濃縮液を電気泳動する。染色液によりＤＮＡを染色して微生物より抽出されたＤＮＡを確認する。
精製工程により濃縮して得られたＤＮＡ濃縮液を電気泳動する。染色液によりＤＮＡを染色して微生物より抽出されたＤＮＡを確認する。
（６）ＤＮＡ回収工程
電気泳動をアガロースゲル等により行った場合、目的のＤＮＡバンドをゲルから切り出すことによりＤＮＡの回収を行うことが可能である。ＤＮＡの回収には、ゲルから切り出したＤＮＡ含有ゲル片から電気溶出することによって行う方法や、ＤＮＡ含有ゲル片を溶解させた後に遠心または吸引することによりメンブレンに結合させることによって行う方法等、公知のＤＮＡ回収方法が適用可能である。
電気泳動をアガロースゲル等により行った場合、目的のＤＮＡバンドをゲルから切り出すことによりＤＮＡの回収を行うことが可能である。ＤＮＡの回収には、ゲルから切り出したＤＮＡ含有ゲル片から電気溶出することによって行う方法や、ＤＮＡ含有ゲル片を溶解させた後に遠心または吸引することによりメンブレンに結合させることによって行う方法等、公知のＤＮＡ回収方法が適用可能である。
（ＩＩ）界面活性剤を添加して２５〜５５℃で処理する方法
この方法は、例えば、環境中から採取した土壌試料から直接微生物由来のＤＮＡを回収する方法（直接抽出法）に適用することができる。
図２に本発明の微生物由来ＤＮＡの抽出方法の概略を示す。
この方法は、例えば、環境中から採取した土壌試料から直接微生物由来のＤＮＡを回収する方法（直接抽出法）に適用することができる。
図２に本発明の微生物由来ＤＮＡの抽出方法の概略を示す。
（１）試料
土壌試料としては、上記（Ｉ）で記載したものが適用可能である。
土壌試料としては、上記（Ｉ）で記載したものが適用可能である。
（２）溶菌工程
上記（Ｉ）で記載した方法において、前記溶菌液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等の溶液に界面活性剤が含まれたものを適用する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、イソオクチルフェノールポリエトキシアルコール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（商標））等が例示されるが、これに限られるものではない。
上記（Ｉ）で記載した方法において、前記溶菌液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液等の溶液に界面活性剤が含まれたものを適用する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、イソオクチルフェノールポリエトキシアルコール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（商標））等が例示されるが、これに限られるものではない。
処理温度は、例えば、２５〜５５℃とするのが好ましい。
このように、溶菌工程を行った後、微生物由来のＤＮＡが含まれる上澄み液（ＤＮＡ抽出液）を、上述した精製工程に供し、電気泳動工程、回収工程を順次行う。
以下に本発明に係る微生物由来ＤＮＡの抽出方法において、（Ｉ）タンパク質を添加する方法の実施例を説明する。
（１）試料
土壌試料として、以下の３種類の試料から微生物由来のＤＮＡの抽出を試みた。
（ａ）廃棄物処分場における廃棄物層近くの自然土、
（ｂ）廃棄物層の土（３．０ｍの深さに位置する土）、
（ｃ）自然土壌（山土）
これら試料の内、（ａ）及び（ｂ）の土にはフミン質やそれ以外のＤＮＡ抽出阻害物質が、（ｃ）の土にはフミン質が含まれていると考えられる。
（１）試料
土壌試料として、以下の３種類の試料から微生物由来のＤＮＡの抽出を試みた。
（ａ）廃棄物処分場における廃棄物層近くの自然土、
（ｂ）廃棄物層の土（３．０ｍの深さに位置する土）、
（ｃ）自然土壌（山土）
これら試料の内、（ａ）及び（ｂ）の土にはフミン質やそれ以外のＤＮＡ抽出阻害物質が、（ｃ）の土にはフミン質が含まれていると考えられる。
（２）溶菌工程
（ａ）〜（ｃ）それぞれの試料０．３ｇを、０．９ｍＬの溶菌液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、２％ ＳＤＳ、１％ ＰＶＰＰ、ｐＨ８．０）に懸濁し、室温（３０℃）で３０分振盪した。
ここで、ＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン）は、微生物由来のＤＮＡとフミン質とを効果的に分離する（フミン質を取り除く）物質として作用するとされている（非特許文献１）。
（ａ）〜（ｃ）それぞれの試料０．３ｇを、０．９ｍＬの溶菌液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、２％ ＳＤＳ、１％ ＰＶＰＰ、ｐＨ８．０）に懸濁し、室温（３０℃）で３０分振盪した。
ここで、ＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン）は、微生物由来のＤＮＡとフミン質とを効果的に分離する（フミン質を取り除く）物質として作用するとされている（非特許文献１）。
（３）タンパク質添加工程
タンパク質（ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤）として、終濃度が２.０ｍｇ/ｍＬになるようにリゾチームを添加した。室温（３０℃）で３０分振盪し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後の上澄み液を回収した。
更に、遠心分離後の沈殿物に、前記溶菌液０．９ｍＬに２.０ｍｇのリゾチームを加えた溶液を添加し、室温で３０分間振盪した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）を行って上澄み液を回収する操作を２回繰り返した。
このように３回の遠心分離によって回収された上澄み液を混合して、ＤＮＡ抽出液とした。
タンパク質（ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤）として、終濃度が２.０ｍｇ/ｍＬになるようにリゾチームを添加した。室温（３０℃）で３０分振盪し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後の上澄み液を回収した。
更に、遠心分離後の沈殿物に、前記溶菌液０．９ｍＬに２.０ｍｇのリゾチームを加えた溶液を添加し、室温で３０分間振盪した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）を行って上澄み液を回収する操作を２回繰り返した。
このように３回の遠心分離によって回収された上澄み液を混合して、ＤＮＡ抽出液とした。
（４）精製工程
前記ＤＮＡ抽出液に対してタンパク質等の夾雑物を除去する以下のフェノール抽出を行った。
前記ＤＮＡ抽出液と、前記ＤＮＡ抽出液の２／３容量のＰＣＩ溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）とを混合し、遠心分離（２０℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間）後の上層（水層）を回収した。この操作を２回繰り返した。
前記ＤＮＡ抽出液に対してタンパク質等の夾雑物を除去する以下のフェノール抽出を行った。
前記ＤＮＡ抽出液と、前記ＤＮＡ抽出液の２／３容量のＰＣＩ溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）とを混合し、遠心分離（２０℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間）後の上層（水層）を回収した。この操作を２回繰り返した。
フェノール抽出後のＤＮＡ抽出液４００μＬに対して、マイクロコンＰＣＲ（ミリポア社製）を用いて限外濾過処理を施し（実施手順は製造者の指示に従うものとする）、２５μＬにまで濃縮した。これをＤＮＡ濃縮液とした。
（５）電気泳動工程
各ＤＮＡ濃縮液から２５μＬをアガロースゲル電気泳動に供し、サイバーグリーンＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりＤＮＡを染色してＤＮＡ濃縮液に含まれるＤＮＡの量及び分子量を確認した。この結果を図３に示した。
図３において、レーン１〜３は、本発明のＤＮＡ抽出方法により抽出したＤＮＡ濃縮液、レーン４はマーカー、レーン５〜７は、従来のＤＮＡ抽出方法（フミン質を取り除く処理としてＣＴＡＢを添加：後述の比較例参照）により回収したＤＮＡ濃縮液、をそれぞれ電気泳動したものに対応する。
各ＤＮＡ濃縮液から２５μＬをアガロースゲル電気泳動に供し、サイバーグリーンＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりＤＮＡを染色してＤＮＡ濃縮液に含まれるＤＮＡの量及び分子量を確認した。この結果を図３に示した。
図３において、レーン１〜３は、本発明のＤＮＡ抽出方法により抽出したＤＮＡ濃縮液、レーン４はマーカー、レーン５〜７は、従来のＤＮＡ抽出方法（フミン質を取り除く処理としてＣＴＡＢを添加：後述の比較例参照）により回収したＤＮＡ濃縮液、をそれぞれ電気泳動したものに対応する。
レーン１〜３、及び、レーン５〜７の各レーンには、約２１ｋｂの高分子ＤＮＡのバンドが存在することが確認された。
レーン５〜７の結果より、（ｃ）自然土壌（レーン７）からは、ＣＴＡＢがフミン質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制していると考えられるため、多量の高分子ＤＮＡを抽出できるものの、（ａ）廃棄物層近くの自然土（レーン５）、及び、（ｂ）廃棄物層の土（レーン６）からのＤＮＡ抽出量は、（ｃ）自然土壌（レーン７）に比べて減少している。つまり、従来のＤＮＡ抽出方法によれば、廃棄物層およびその周縁の土壌からのＤＮＡ抽出効率は低下するものと認められる。
従って、廃棄物層およびその周縁の土壌には、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質が存在すると考えられる。
また、（ｃ）自然土壌から抽出されたＤＮＡは、レーン７の結果がスメア状になっていることから、ＤＮＡがデグラデーションを引き起こして微生物由来の高分子ＤＮＡの一部が壊れた状態で抽出されているものと考えられる。
従って、廃棄物層およびその周縁の土壌には、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質が存在すると考えられる。
また、（ｃ）自然土壌から抽出されたＤＮＡは、レーン７の結果がスメア状になっていることから、ＤＮＡがデグラデーションを引き起こして微生物由来の高分子ＤＮＡの一部が壊れた状態で抽出されているものと考えられる。
一方、レーン１〜３の結果より、土壌試料（ａ）〜（ｃ）からは、何れも同レベルで多量の高分子ＤＮＡを抽出可能であることが判明した。また、これらＤＮＡ試料の電気泳動結果はスメア状になっていないことから、高分子ＤＮＡの状態を維持しているものと考えられた。
つまり、本発明のＤＮＡ抽出方法によれば、採取した場所に拘らず、効率よく、かつ、高分子ＤＮＡを維持した状態で抽出できることが判明した。
従って、本発明のＤＮＡ抽出方法は、廃棄物層およびその周縁の土壌に存在すると考えられるフミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制できる方法であると認められる。
従って、本発明のＤＮＡ抽出方法は、廃棄物層およびその周縁の土壌に存在すると考えられるフミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制できる方法であると認められる。
（６）ＤＮＡ回収工程
アガロースゲル電気泳動して確認できた高分子ＤＮＡのバンドを回収するため、目的のＤＮＡバンドが位置するゲルをカッターナイフで切り出した。このとき切り出されたＤＮＡ含有ゲル片を、セントリリューター（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて電気溶出する（実施手順は製造者の指示に従うものとする）ことによってＤＮＡの回収を行った。
アガロースゲル電気泳動して確認できた高分子ＤＮＡのバンドを回収するため、目的のＤＮＡバンドが位置するゲルをカッターナイフで切り出した。このとき切り出されたＤＮＡ含有ゲル片を、セントリリューター（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて電気溶出する（実施手順は製造者の指示に従うものとする）ことによってＤＮＡの回収を行った。
本発明のＤＮＡ抽出方法により抽出して回収されたＤＮＡを定量したところ、（ａ）〜（ｃ）それぞれの０.３ｇの土壌試料から、２．２μｇ、３．５μｇ、４．１μｇのＤＮＡが回収できた。これは、１グラム当たりの土壌に換算すると、それぞれ、７．３ｇ/ｇ土壌、１１．６ｇ/ｇ土壌、１３．５ｇ/ｇ土壌となる。
一方、後述するように、従来のＤＮＡ抽出方法により抽出して回収されたＤＮＡを定量したところ、（ａ）〜（ｃ）それぞれの５．０ｇの土壌試料から、０．８〜３．３μｇ/ｇ土壌のＤＮＡが回収できた。
以上より、回収されたＤＮＡを定量した結果、本発明のＤＮＡ抽出方法は、従来のＤＮＡ抽出方法に比べて、多量の高分子ＤＮＡを抽出可能である。
このようにして回収された微生物由来のＤＮＡをＰＣＲに供した。
試料（ａ）〜（ｃ）から回収された微生物由来のＤＮＡを、１０〜１０００倍段階希釈したものをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ユニバーサルプライマーセットを用いて行った。ＰＣＲを行った後、ＰＣＲ反応液の一部を採取して電気泳動を行った。
この結果を図４（イ）に示した。
図４（イ）において、レーン１はネガティブコントロール、レーン２、７，１２はマーカーにそれぞれ対応し、レーン３〜６は試料（ａ）、レーン８〜１１は試料（ｂ）、レーン１３〜１６は試料（ｃ）から回収された微生物由来のＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲに供した結果にそれぞれ対応する。
これより、各試料（ａ）〜（ｃ）から回収された微生物由来のＤＮＡをテンプレートにすると、全てのサンプルにおいて約５８０ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。つまり、本発明のＤＮＡ抽出方法により抽出して回収されたＤＮＡは、ＰＣＲ等のその後の解析操作を遂行可能な品質を保持しているものと認められた。
試料（ａ）〜（ｃ）から回収された微生物由来のＤＮＡを、１０〜１０００倍段階希釈したものをテンプレートとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ユニバーサルプライマーセットを用いて行った。ＰＣＲを行った後、ＰＣＲ反応液の一部を採取して電気泳動を行った。
この結果を図４（イ）に示した。
図４（イ）において、レーン１はネガティブコントロール、レーン２、７，１２はマーカーにそれぞれ対応し、レーン３〜６は試料（ａ）、レーン８〜１１は試料（ｂ）、レーン１３〜１６は試料（ｃ）から回収された微生物由来のＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲに供した結果にそれぞれ対応する。
これより、各試料（ａ）〜（ｃ）から回収された微生物由来のＤＮＡをテンプレートにすると、全てのサンプルにおいて約５８０ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られた。つまり、本発明のＤＮＡ抽出方法により抽出して回収されたＤＮＡは、ＰＣＲ等のその後の解析操作を遂行可能な品質を保持しているものと認められた。
一方、従来のＤＮＡ抽出方法により回収したＤＮＡを、１０〜１０００倍段階希釈したものをテンプレートとしてＰＣＲを行った。この結果を図４（ロ）に示した。
この結果、殆どのサンプルで、ＰＣＲ産物を得ることはできなかった。つまり、従来のＤＮＡ抽出方法により抽出して回収されたＤＮＡは、ＰＣＲ等のその後の解析操作を遂行するに足る品質を保持していないと認められた。
この結果、殆どのサンプルで、ＰＣＲ産物を得ることはできなかった。つまり、従来のＤＮＡ抽出方法により抽出して回収されたＤＮＡは、ＰＣＲ等のその後の解析操作を遂行するに足る品質を保持していないと認められた。
実施例１において、フミン質を取り除くため、溶菌液にＰＶＰＰを添加したものを使用した。そこで、ＰＶＰＰの有無により、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用がどのように変化するかを確認する実験を行った。
実験は、溶菌液におけるＰＶＰＰの有無以外は実施例１に準じた方法により行った。結果を図５に示した。
図５において、レーン１，５はマーカー、レーン２〜４はＰＶＰＰ無し、レーン６〜８はＰＶＰＰ有り、のＤＮＡ濃縮液をそれぞれ電気泳動したものに対応する。
図５において、レーン１，５はマーカー、レーン２〜４はＰＶＰＰ無し、レーン６〜８はＰＶＰＰ有り、のＤＮＡ濃縮液をそれぞれ電気泳動したものに対応する。
レーン２〜４、及び、レーン６〜８の各レーンには、約２１ｋｂｐのＤＮＡのバンドが存在することが確認された。また、廃棄物層近くの自然土であるレーン２と６とを比較すると、ＤＮＡバンドの濃さがほぼ同等であることから、ほぼ同量のＤＮＡ抽出量であることが判明した。廃棄物層の土であるレーン３と７、自然土壌であるレーン４と８においても同様である。
つまり、本発明のＤＮＡ抽出方法は、従来、フミン質を取り除く処理に用いられていたＰＶＰＰの添加の有無に拘らず、効率よくＤＮＡを抽出できるものと認められる。これより、添加したタンパク質が、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制する効果を発揮していると考えられる。
実施例１において、タンパク質（ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤）として、リゾチームを添加した。これ以外のタンパク質で、ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制できるか否かを調べた。
タンパク質として、ウシ血清アルブミン或いはインシュリンをリゾチームに替えて添加したこと以外は実施例１に準じた方法により行った。結果を図６に示した。尚、土壌試料は、実施例１で記載した（ｂ）廃棄物層の土の試料を用いた。
この結果、ウシ血清アルブミン及びインシュリンを添加した場合においても、ＤＮＡバンドの濃さがほぼ同等であることから、ＤＮＡ回収効率はリゾチームと同等であることが判明した。つまり、ウシ血清アルブミン或いはインシュリンにおいても、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制する効果を有していると考えられる。
実施例１において、タンパク質（ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤）として、リゾチームを２.０ｍｇ/ｍＬになるように添加し、このとき、フミン質以外のＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制できる結果が得られた。
さらに、ＤＮＡ抽出阻害作用が効果的に発揮できるタンパク質の濃度範囲を調べるため、種々の濃度でタンパク質を添加した実験を行った。
さらに、ＤＮＡ抽出阻害作用が効果的に発揮できるタンパク質の濃度範囲を調べるため、種々の濃度でタンパク質を添加した実験を行った。
タンパク質はリゾチームを使用し、濃度範囲は終濃度が０.５〜４.０ｍｇ/ｍＬになるように添加したこと以外は実施例１に準じた方法により行った。結果を図７に示した。尚、土壌試料は、実施例１で記載した（ｂ）廃棄物層の土の試料を用いた。
この結果、０.５ｍｇ/ｍＬ以上リゾチームを添加した場合に、効率よくＤＮＡを抽出できることが判明した。
特に、終濃度が２.０〜４.０ｍｇ/ｍＬ（レーン５〜７）において、効率よくＤＮＡを抽出できると認められる。
特に、終濃度が２.０〜４.０ｍｇ/ｍＬ（レーン５〜７）において、効率よくＤＮＡを抽出できると認められる。
さらに、リゾチームを終濃度が８.０、１６.０ｍｇ/ｍＬになるように添加した場合の実験を行った。結果を図８に示した。
この結果、リゾチームの終濃度が８.０、１６.０ｍｇ/ｍＬの場合であっても効率よくＤＮＡを抽出できると認められた。
この結果、リゾチームの終濃度が８.０、１６.０ｍｇ/ｍＬの場合であっても効率よくＤＮＡを抽出できると認められた。
実施例１において、溶菌工程を行った後にタンパク質添加工程を行った。
ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するためには、どのタイミングでＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤であるタンパク質を土壌試料に添加するのが好ましいかを調べるため、溶菌工程とタンパク質添加工程との順番を入れ替えた実験を行った。
ＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するためには、どのタイミングでＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤であるタンパク質を土壌試料に添加するのが好ましいかを調べるため、溶菌工程とタンパク質添加工程との順番を入れ替えた実験を行った。
実験は、溶菌工程とタンパク質添加工程との順番を入れ替えたこと以外は実施例１に準じた方法により行った。結果を図９に示した。
図９において、レーン１，５はマーカー、レーン２〜４は溶菌工程、タンパク質添加工程の順番、レーン６〜８はタンパク質添加工程、溶菌工程の順番、でＤＮＡ抽出を行い、得られたＤＮＡ濃縮液をそれぞれ電気泳動したものに対応する。
図９において、レーン１，５はマーカー、レーン２〜４は溶菌工程、タンパク質添加工程の順番、レーン６〜８はタンパク質添加工程、溶菌工程の順番、でＤＮＡ抽出を行い、得られたＤＮＡ濃縮液をそれぞれ電気泳動したものに対応する。
レーン２〜４とレーン６〜８との結果を比較すると、レーン２と６、レーン３と７、及び、レーン４と９とはそれぞれＤＮＡバンドの濃さがほぼ同等であることから、両方法によってＤＮＡ抽出量に差は殆ど認められないことが判明した。
従って、ＤＮＡ抽出阻害作用抑制剤であるタンパク質を添加するタイミングは、溶菌工程の後先を問わないものと認められる。
ここで、溶菌工程を先に行う場合、タンパク質添加工程を行うまでの時間がどのようにＤＮＡ抽出に影響を及ぼすかを調べる実験を行った。
つまり、溶菌工程を行った後、０、１０、２０，３０、６０分後にタンパク質添加工程を行い、抽出されるＤＮＡの量を調べた。結果を図１０に示した。尚、土壌試料は、実施例１で記載した（ｂ）廃棄物層の土の試料を用いた。
図１０において、レーン１，７はマーカー、レーン２〜６は溶菌工程のみ、レーン８〜１２は、溶菌工程の後に上述した時間経過後にタンパク質添加工程を行った場合にそれぞれ相当する。
この結果、溶菌工程のみ（レーン２〜６）行った場合は、何れの場合も高分子ＤＮＡバンドは検出されていないが、溶菌工程を行った後０〜３０分経過後にタンパク質添加工程を行った場合（レーン８〜１１）に、約２１ｋｂの高分子ＤＮＡバンドが検出され、６０分経過後にタンパク質添加工程を行った場合（レーン１２）には、この高分子ＤＮＡバンドは殆ど検出されないことが確認された。つまり、溶菌工程を行った後、３０分以内にタンパク質添加工程を行うのが有効であることが判明した。
つまり、溶菌工程を行った後、０、１０、２０，３０、６０分後にタンパク質添加工程を行い、抽出されるＤＮＡの量を調べた。結果を図１０に示した。尚、土壌試料は、実施例１で記載した（ｂ）廃棄物層の土の試料を用いた。
図１０において、レーン１，７はマーカー、レーン２〜６は溶菌工程のみ、レーン８〜１２は、溶菌工程の後に上述した時間経過後にタンパク質添加工程を行った場合にそれぞれ相当する。
この結果、溶菌工程のみ（レーン２〜６）行った場合は、何れの場合も高分子ＤＮＡバンドは検出されていないが、溶菌工程を行った後０〜３０分経過後にタンパク質添加工程を行った場合（レーン８〜１１）に、約２１ｋｂの高分子ＤＮＡバンドが検出され、６０分経過後にタンパク質添加工程を行った場合（レーン１２）には、この高分子ＤＮＡバンドは殆ど検出されないことが確認された。つまり、溶菌工程を行った後、３０分以内にタンパク質添加工程を行うのが有効であることが判明した。
ここで、（ｂ）廃棄物層の土の試料中には、ＤＮＡを分解する何らかの物質が存在するため、溶菌により抽出されたＤＮＡは分解を受けると考えられる。しかし、溶菌処理時間が３０分程度であると未溶菌の菌体が存在し、このときタンパク質を添加すると、このタンパク質がＤＮＡ分解物質のＤＮＡ分解作用を阻害した状態で溶菌処理が進行すると考えられる。
つまり、タンパク質添加後に溶菌した菌から抽出されたＤＮＡは分解されずに高分子の状態で抽出される。
従って、溶菌工程を行った後、タンパク質添加工程を開始する時間は短いほうが好ましいと考えられる。
つまり、タンパク質添加後に溶菌した菌から抽出されたＤＮＡは分解されずに高分子の状態で抽出される。
従って、溶菌工程を行った後、タンパク質添加工程を開始する時間は短いほうが好ましいと考えられる。
特に、図１０の結果から、溶菌工程を行った後、０分経過後（レーン８）にタンパク質添加工程を行った場合において（つまり、溶菌工程とタンパク質添加工程とを同時に行う）、最も濃い高分子ＤＮＡバンドが確認されているのが判る。これより、溶菌工程とタンパク質添加工程とを同時に行うと、最も効率よくＤＮＡを抽出できるものと認められる。
以下に本発明に係る微生物由来ＤＮＡの抽出方法において、（ＩＩ）界面活性剤を添加して２５〜５５℃で処理する方法の実施例を説明する。
（１）試料
土壌試料は、実施例１で記載した（ｂ）廃棄物層の土（３．０ｍの深さに位置する土）の試料を用いた。
土壌試料は、実施例１で記載した（ｂ）廃棄物層の土（３．０ｍの深さに位置する土）の試料を用いた。
（２）溶菌工程
（ｂ）の試料０．３ｇを、界面活性剤としてＳＤＳを用いた溶菌液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、２％ ＳＤＳ、１％ ＰＶＰＰ、ｐＨ８．０）０．９ｍＬに懸濁し、各種温度（２５、３０、３７、４５、５５、６５℃）で３０分振盪した。この結果を図１１に示した。
（ｂ）の試料０．３ｇを、界面活性剤としてＳＤＳを用いた溶菌液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、２％ ＳＤＳ、１％ ＰＶＰＰ、ｐＨ８．０）０．９ｍＬに懸濁し、各種温度（２５、３０、３７、４５、５５、６５℃）で３０分振盪した。この結果を図１１に示した。
この結果、レーン２〜７の各レーンには、約２１ｋｂの高分子ＤＮＡのバンドが存在することが確認された。ＤＮＡバンドの濃さから、レーン２〜６（処理温度：２５〜５５℃）においては、多量の高分子ＤＮＡが抽出されているが、レーン７（処理温度：６５℃）においては、ＤＮＡ抽出量はレーン２〜６に比べて少ないことが判った。
従って、溶菌工程において、界面活性剤としてＳＤＳを用いた場合、処理温度は従来の処理温度より低い温度（２５〜５５℃）で処理することにより、効率よく高分子ＤＮＡを抽出できるものと認められる。
（比較例）
以下に、従来行われていた微生物由来ＤＮＡの抽出方法であって、フミン質を取り除く処理としてＣＴＡＢを添加する方法について概説する。
以下に、従来行われていた微生物由来ＤＮＡの抽出方法であって、フミン質を取り除く処理としてＣＴＡＢを添加する方法について概説する。
（１）試料
土壌試料は、実施例１で記載した（ａ）〜（ｃ）と同様の試料を用いた。
土壌試料は、実施例１で記載した（ａ）〜（ｃ）と同様の試料を用いた。
（２）溶菌工程
（ａ）〜（ｃ）それぞれの試料５ｇを、１３.５ｍＬの溶菌液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ、ｐＨ ８．０）に懸濁し、室温（３０℃）で０.５時間振盪した。
ここで、ＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）は、微生物由来のＤＮＡとフミン質とを効果的に分離する（フミン質を取り除く）物質として作用するとされている（非特許文献１）。
（ａ）〜（ｃ）それぞれの試料５ｇを、１３.５ｍＬの溶菌液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ、ｐＨ ８．０）に懸濁し、室温（３０℃）で０.５時間振盪した。
ここで、ＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）は、微生物由来のＤＮＡとフミン質とを効果的に分離する（フミン質を取り除く）物質として作用するとされている（非特許文献１）。
この後、２０％ＳＤＳを１．５ｍＬ添加して６５℃で２時間振盪し、遠心分離（６０００ｇ、１０分間）後の上澄み液を回収した。遠心分離後の沈殿物に、前記溶菌液に終濃度２０％となるようにＳＤＳを添加した溶液を４．５ｍＬ添加し、１０分間振盪した後、遠心分離（６０００ｇ、１０分間）を行い上澄み液を回収する操作を２回繰り返した。このように３回の遠心分離によって回収された上澄み液を混合して、ＤＮＡ抽出液とした。
（３）精製工程
前記ＤＮＡ抽出液と、前記ＤＮＡ抽出液と同量のＣＩ溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）とを混合し、遠心分離（２０℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間）後の上層（水層）を回収した。この水層に２倍量のエタノールを添加し、沈殿したＤＮＡを回収した。このＤＮＡを緩衝液に溶解させ、ＤＮＡ濃縮液を得た。
前記ＤＮＡ抽出液と、前記ＤＮＡ抽出液と同量のＣＩ溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）とを混合し、遠心分離（２０℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間）後の上層（水層）を回収した。この水層に２倍量のエタノールを添加し、沈殿したＤＮＡを回収した。このＤＮＡを緩衝液に溶解させ、ＤＮＡ濃縮液を得た。
（４）電気泳動工程
各ＤＮＡ濃縮液から２５μＬをアガロースゲル電気泳動に供し、サイバーグリーンＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりＤＮＡを染色してＤＮＡ濃縮液に含まれるＤＮＡの量及び分子量を確認した。この結果を図３（レーン５〜７）に示した。
各ＤＮＡ濃縮液から２５μＬをアガロースゲル電気泳動に供し、サイバーグリーンＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）によりＤＮＡを染色してＤＮＡ濃縮液に含まれるＤＮＡの量及び分子量を確認した。この結果を図３（レーン５〜７）に示した。
（５）ＤＮＡ回収工程
アガロースゲル電気泳動して確認できた高分子ＤＮＡのバンドを回収するため、本発明のＤＮＡ抽出方法の際に適用した方法と同様の方法でＤＮＡを回収した。
アガロースゲル電気泳動して確認できた高分子ＤＮＡのバンドを回収するため、本発明のＤＮＡ抽出方法の際に適用した方法と同様の方法でＤＮＡを回収した。
この回収されたＤＮＡを定量したところ、（ａ）〜（ｃ）それぞれの５．０ｇの土壌試料から、１．４μｇ/ｇ土壌、０．８μｇ/ｇ土壌、３．３μｇ/ｇ土壌のＤＮＡが回収できた。
回収されたＤＮＡをテンプレートとし、ユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。この結果を図４（ロ）に示した。
回収されたＤＮＡをテンプレートとし、ユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。この結果を図４（ロ）に示した。
本発明は、環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出に利用され、例えば、廃棄物処分場等の土壌から抽出された微生物由来のＤＮＡは、土壌中に含まれる微生物のモニタリングや有用微生物の探索等の解析に利用可能である。
Claims (9)
- 環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、
前記環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程と、
前記試料に含まれるＤＮＡ抽出阻害物質のＤＮＡ抽出阻害作用を抑制するタンパク質を添加するタンパク質添加工程とを有する微生物由来のＤＮＡ抽出方法。 - 前記溶菌工程と前記タンパク質添加工程とを同時に行う請求項１に記載の微生物由来のＤＮＡ抽出方法。
- 前記溶菌工程を行った後、３０分以内に前記タンパク質添加工程を行う請求項１に記載の微生物由来のＤＮＡ抽出方法。
- 前記溶菌工程及び前記タンパク質添加工程を行った後に、前記試料中の夾雑物を除去する精製工程を行う請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物由来のＤＮＡ抽出方法。
- 前記タンパク質が、リゾチーム、インシュリン、ウシ血清アルブミンからなる群から選択される１種以上のタンパク質である請求項１〜４の何れか一項に記載の微生物由来のＤＮＡ抽出方法。
- 前記タンパク質添加工程において、タンパク質を終濃度２.０〜１６．０ｍｇ/ｍＬとなるように添加する請求項１〜５の何れか一項に記載の微生物由来のＤＮＡ抽出方法。
- 前記溶菌工程において、界面活性剤を添加し、室温で処理する請求項１〜６の何れか一項に記載の微生物由来のＤＮＡ抽出方法。
- 環境中に存在する微生物由来のＤＮＡ抽出方法であって、
前記環境中から採取した試料に含まれる微生物を破砕する溶菌工程を有し、
前記溶菌工程において界面活性剤を添加し、処理温度が２５〜５５℃である微生物由来のＤＮＡ抽出方法。 - 前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である請求項７又は８に記載の微生物由来のＤＮＡ抽出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003310259A JP2005073643A (ja) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 微生物由来ｄｎａの抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003310259A JP2005073643A (ja) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 微生物由来ｄｎａの抽出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005073643A true JP2005073643A (ja) | 2005-03-24 |
Family
ID=34412184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003310259A Pending JP2005073643A (ja) | 2003-09-02 | 2003-09-02 | 微生物由来ｄｎａの抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2005073643A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005073377A1 (ja) * | 2004-01-28 | 2008-01-10 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | 環境サンプルからのｄｎａの回収方法 |
| CN100410377C (zh) * | 2006-08-29 | 2008-08-13 | 中国科学院南海海洋研究所 | 从土壤中提取微生物基因组dna的试剂盒及方法 |
| JP2008289376A (ja) * | 2007-05-22 | 2008-12-04 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸回収試薬およびそれを用いた核酸増幅試薬キット、ならびに核酸回収方法およびそれを用いた核酸増幅方法 |
| JP2009034073A (ja) * | 2007-08-03 | 2009-02-19 | Japan Organo Co Ltd | 微生物の培養方法及び汚染土壌、地下水の浄化方法 |
| CN102031252A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-04-27 | 盎亿泰地质微生物技术（北京）有限公司 | 一种快速提取土壤总dna的方法 |
-
2003
- 2003-09-02 JP JP2003310259A patent/JP2005073643A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005073377A1 (ja) * | 2004-01-28 | 2008-01-10 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | 環境サンプルからのｄｎａの回収方法 |
| JP4665124B2 (ja) * | 2004-01-28 | 2011-04-06 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | 環境サンプルからのｄｎａの回収方法 |
| JP2013135681A (ja) * | 2004-01-28 | 2013-07-11 | Toudai Tlo Ltd | 環境サンプルからのｄｎａの回収方法 |
| CN100410377C (zh) * | 2006-08-29 | 2008-08-13 | 中国科学院南海海洋研究所 | 从土壤中提取微生物基因组dna的试剂盒及方法 |
| JP2008289376A (ja) * | 2007-05-22 | 2008-12-04 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸回収試薬およびそれを用いた核酸増幅試薬キット、ならびに核酸回収方法およびそれを用いた核酸増幅方法 |
| JP2009034073A (ja) * | 2007-08-03 | 2009-02-19 | Japan Organo Co Ltd | 微生物の培養方法及び汚染土壌、地下水の浄化方法 |
| CN102031252A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-04-27 | 盎亿泰地质微生物技术（北京）有限公司 | 一种快速提取土壤总dna的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK1756136T3 (en) | KIT AND METHODS FOR REMOVING IMPURITIES FROM nucleic acids in ENVIRONMENTAL AND BIOLOGICAL SAMPLES | |
| Rajendhran et al. | Strategies for accessing soil metagenome for desired applications | |
| Mahuku | A simple extraction method suitable for PCR-based analysis of plant, fungal, and bacterial DNA | |
| DE102005009479A1 (de) | Verwendung von Nukleasen zum Abbau von Nukleinsäure in Gegenwart von chaotropen Agenzien und/oder Tensiden | |
| CN102586234B (zh) | 一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法 | |
| Clegg et al. | Direct extraction of microbial community DNA from humified upland soils | |
| Zammit et al. | The recovery of nucleic acid from biomining and acid mine drainage microorganisms | |
| CN105802957A (zh) | 一种从煤层水样中提取微生物总dna的方法 | |
| CN103320425B (zh) | 一种用于大规模、高通量基因分型的贝类dna快速提取方法 | |
| Capo et al. | Lake Sedimentary DNA Research on Past Terrestrial and Aquatic Biodiversity: Overview and Recommendations. Quaternary 2021, 4, 6 | |
| CN101712953A (zh) | 用于评价动物肠道微生物群落多样性的dna提取方法 | |
| US20140051847A1 (en) | Method for isolating dna | |
| Verma et al. | Direct lysis glass milk method of genomic DNA extraction reveals greater archaeal diversity in anaerobic biodigester slurry as assessed through Denaturing Gradient Gel Electrophoresis. | |
| CN102206630A (zh) | 一种土壤和沉积物总dna提取方法及提取试剂盒 | |
| JP3491938B2 (ja) | Ｄｎａの回収方法 | |
| WO2014165769A1 (en) | Kits and methods for isolating protein from biological and environmental samples | |
| JP2005073643A (ja) | 微生物由来ｄｎａの抽出方法 | |
| US7074565B2 (en) | Preparation of DNA-containing extract for PCR amplification | |
| JP4665124B2 (ja) | 環境サンプルからのｄｎａの回収方法 | |
| CN107475243A (zh) | 一种改良酚抽提总rna的方法 | |
| JPH03503481A (ja) | 核酸単離 | |
| CN103333883B (zh) | 一种高效提取用于pcr扩增的地下水微生物dna的方法 | |
| CN108841820B (zh) | 高效提取植物基因组dna的无毒提取液组合gpr.1及提取方法 | |
| Nur et al. | Methods to maximize environmental DNA (eDNA) for detection the presence of Alligator Gar (Atractosteus spatula) | |
| CN104178482A (zh) | 从浓香型大曲中提取微生物总dna的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060322 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20081218 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090409 |