JPH03503481A

JPH03503481A - 核酸単離

Info

Publication number: JPH03503481A
Application number: JP50240489A
Authority: JP
Inventors: ミラー　シャーリー　エイ; ダイクス　デイル　ディー
Original assignee: メモリアル　ブラッド　センター　オヴ　ミネアポリス
Priority date: 1988-02-09
Filing date: 1989-02-09
Publication date: 1991-08-08
Also published as: WO1989007603A1; EP0403503A1; EP0403503A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】並」【」山隈ｍ口ｔ１本発明は生物学的組成物から核酸を単離、即ち分離する方法に関する。より詳しくいえば、本発明は、塩を使用した、核酸を含有する生物学的サンプルからのタンパクの分離に係る。このタンパクは該核酸の分離前に除去される。

ｌ米茨歪坐藍豊核酸、即ちＤＮＡおよびＲＮＡの細胞デブリからの単離はバイオテクノロジーの分野において重要かつ日常的な手続きである。

従って、様々な研究がこの単離法の単純花のために試みられている。核酸を分子の複雑な混合物、例えば細胞溶解物から精製する場合、一般にタンパク分解酵素、例えばプロナーゼ、ブロティナーゼに１キモトリプシン、トリプシン、ズブチリシン、カルボキシペプチダーゼなどまたはイオン性界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、サルコシル（５ａｒｋｏｓｙｌ　）などを用いて、存在する大部分のタンパクを分解または変性させている。

使用するタンパク分解酵素は、一般にタンパクの広いスペクトルに対して活性であるように選ばれ、かくして効率的にできる限りこれらを分解させる。このタンパクは核酸を単離する前に該細胞溶解物から分離または除去しなければならず、さもなくばタンパクが核酸と共に精製されてしまう二更に、このタンパクは制限酵素の作用および分離を妨害する恐れがある。また、低い分光々変針の読みを与える可能性がある。核酸からのタンパクの分離並びに後のタンパクの除去は核酸の単離における重要な工程である。

タンパクを分解した後、核酸は典型的ドは有機溶媒を用いて抽出される。

マーマー（Ｍａｒｍａｒ＋　Ｊ、　）の１微生物からのＤＮＡの単離法（ＡＰｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ｆｒｏｍＭｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　）　　”と題する論文（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　　１９６１　。

３、ｐｐ、２０Ｂ−２１８）には、微生物からの高分子量ＤＮＡの抽出手順が記載されている。この手順は今日のＤＮＡ抽出法の大部分の先駆的方法である。マーマーは細胞を崩壊させ、細胞デブリおよびタンパクを有機抽出および遠心により除去している。

ＲＮＡはＲＮアーゼの作用で分解され、イソプロパツールを用いたＤＮＡの分別沈殿によりＤＮＡと分離される。ＤＮＡの分解はキレート剤およびイオン性界面活性剤ＳＤＳの存在のために防止される。

現在、核酸を含む生物学的組成物から不活化または消化されたタンパクを除去するために最も一般的に利用される方法は、フェノールとクロロホルムとの組合せを用いることである。一般に、２種の異る有機溶媒が１種の有機溶媒よりも有効であると考えられている。核酸溶液をフェノールで一度、フェノールとクロロホルムの１１混合物で一度およびクロロホルムで一度夫々抽出する。クロロホルムまたは類似の化合物による最終的な抽出は、該核酸処方物から残留するあらゆる痕跡のフェノールを除去する。

このフェノール／クロロホルム抽出法は、１９８２年にコールドスプリングハーバ−ラボラトリ−から刊行された“アラポラトリーマニュアル（＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）　”中のマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｌ　Ｔ、等の６モレキエラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏ＋＋ｉｎｇ　）　　”に記載されている。マニアナイス等は“クロロホルム”をクロロホルムとイソアミルアルコールとの２４　＝　１　　（ｅ＋／ｖ）混合物として定義した。“フェノール°はバフファーで平衡化されたフェノールとして記載され、かつ０．１％のヒドロキシキノランと０．２％のβ−メルカプトエタノールとを含む。

該ＤＮＡ溶液からすべての残留フェノールまたはクロロホルムを除くのにエーテルが用いられる。勿論、エーテルは著しく揮発性でしかも、極めて発火性の高いものであり、爆発性防止用化学フード内で作業し、かつ保存する必要がある。

常法に従って、核酸を含む生物学的サンプル中に存在するタンパクを不活化した後、溶液状態で核酸を含む水性層は別の管に移され、該核酸は約２倍容の乾燥エタノールで沈殿させることにより単離される。この方法は約６７％の最終エタノール溶液を与える。次いで、沈殿した核酸を遠心または濾過により回収する。

このフェノールとクロロホルムとの使用に係るいくつかの欠点がある。フェノールおよびクロロホルム両者共に有毒の化学試薬であり、その取扱いには保護衣、手袋右よび防煙フードの使用が必要とされる。フェノールは十分な量で皮膚を介して吸収された場合、中枢神経系に及ぼされる作用のために死に至ることがあり、また腎臓、肝臓、膵臓、膵臓および肺臓に損傷を与える可能性がある。低濃度のフェノール蒸気への定常的曝露は消化障害、神経疾患および皮膚炎を起こす恐れがある。慢性中毒は最終的に広範な腎または肝臓に損傷を与える可能性がある。フェノールまたはフェノール含有製品との接触によって生ずる皮膚炎は工業的にはかなり一般的にみられる。

また、フェノール酸化生成物がＤＮＡ損傷を誘発することも公知である。この点は長期に及ぶＤＮＡ貯蔵の際に考慮されねばならない。かくして、ＤＮＡ単離手順における次の工程を始める前に、フェノールを完全に除去することが重要である。

クロロホルムは発癌性物質であると考えられ、かつ腫瘍生長を生ずる能力を有している。クロロホルム蒸気への曝露は結膜炎および瞳孔拡張を生ずる可能性がある。長期に及ぶ吸入は麻痺を生じ、心臓呼吸性不全症および最終的な死を伴う、クロロホルムへの曝露は、また重度の毒血症をひき起こし、かつ肝臓、心臓および腎臓を損傷する可能性をもつ。

フェノールおよびクロロホルム抽出法は時間労費かつ面倒である。フェノール除去に必要とされるいくつかの再抽出およびフェノール−クロロホルム界面からの核酸上澄の注意深い除去の労働の必要性はこれら手順を時間のかかるものとする。

上記手順に係る諸点に鑑みて、他の様々な方法が報告されており、そこでは上記手順が改善されたかもしくは全（異る方法が使用されている。

ゴートロ（Ｇａｕｔｒｅａｕ　）、　　Ｃ，等は、その２つのヒト白血球からの高分子量ＤＮＡ単離法の比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｔｗｏ　Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　ｏｆＨｉｇｈ−ＭｏｌｅｃｕｌａｒＪｌｅｉｇｈｔ　　ＤＮＡ　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｆｒｏｍ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ）@　” と題する論文（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　　１９８３．　１３４＋ｐｐ、　　３２０−３２４＞において、プロテア−ゼにとＳＤＳとでタンパクを消化した後に脱タンパク化のためにフェノールとクロロホルムとを用いる２種のＤＮＡ抽出法を記載している。その一つの方法は０．０１Ｍナトリウムテトラボレートと０．　ＯＩ　Ｍ　［：［１ＴＡ（ｐＨ９，１）とによる長時間の透析でフェノールを除去する工程を含んでいる。第２の方法では、ＤＮＡが、０．１容の２０％酢酸ナトリウムを水性層に加え、次いで２．５容のエタノールを添加することにより該水性層から沈殿される。各方法において、細胞溶解前に白血球細胞を懸濁するために希薄な１．８％（ｗ／ｖ）ＮａＣｊ溶液を用いた。いずれの方法においても、細胞消化物からタンパクを除（ためにフェノールとクロロホルムとを使用した。

ロングマイヤ（Ｌｏｎｇｍｉｒｅ　）＋　　Ｊ、　Ｌ、等は１有機溶媒を用いることのない、高速かつ簡単な溶液中の高分子量細胞性かつクロモソームー特異的ＤＮＡ０単離法”と題する論文（Ｎｕｃｌｅｆｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　　１９８７　、上５．？＆１２．ｐ、８５９）において、ＳＤＳとプロテアーゼにとによる細胞溶解物の消化後の非毒性ＤＮＡ抽出法を開示している。ＳＤＳおよび消化生成物は、２０９４ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて６０分間、４回に亘り洗浄することによる透析により除去される。このサンプルの体積を減じ、かつ塩を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ８，０）　、１ｓＭ　　ＨＤＴＡ（ＴＥパンファー）で３０分間、２回に亘り洗浄することによる透析で除かれる。

リードン（Ｌｅａｄｏｎ　）、　Ｓ、　Ａ、等はその“哺乳類細胞からの高速かつ柔和なりＮＡの単離法９と題する論文（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１９８２．　２０．　ＰＰ、　　２８２−２８８）において、ＤＮＡの無害な単離法を開示している。細胞をポリカーボネートフィルタ上に置く、細胞溶解およびＳＤＳとプロテアーゼにとによる消化は該フィルタ上で行う、溶液は重力によりフィルタを通して流下する０次いで、ＤＮＡを、ＤＮアーゼと０．５ｓＪの水とで処理することにより該フィルタから除く、このＤＮＡは、また１０００〜１５００ｒａｄのＴ−線を照射し、次いで水性洗浄することによっても該フィルタから除去することができる。

スミス（５ｗ１ｔｈ　）、に、　Ｃ，等は硫酸アンモニウム分画を利用してアミノ酸特異的ＲＮＡを分離することを提案した。彼等はタンパク除去のためのフェノール法を利用してモルモットの肝臓から抽出した転移ＲＮＡから始めた。

ヒルト（Ｈｉｒｔ）、　　Ｂ、　（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１９６７、　２６．　ｐｐ。

３６５−３６９）は、高分子量ＤＮＡおよびタンパクから低分子量核酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡを精製するための抽出法を開示している。この方法は緩衝された溶液に細胞を再懸濁し、ＳＯ３を加えて該細胞を溶解することにより実施される。この細胞溶解は室温または３７℃で１０〜３０分間行うことができる。該緩衝化溶液は通常１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）を含んでいて、２価のカチオンをキレート化する。この溶解法の別法では、直接細胞を１％ＳＤＳ、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）に再懸濁する。細胞溶解後、ＮａＣ１を添加し、最終濃度ＩＭとする。この溶液を氷上で３０〜６０分間インキエベートして、４℃に冷却する。４℃にて、高分子量ＤＮＡ、タンパクおよびＳＤＳは沈殿する。４℃でのインキエベーシッンの後、この溶液を１０．００Ｏｒｐｍにて２０〜３０分間４℃にて遠心処理して、生成沈殿をペレット化する０次に、上澄液をデカンテーションに付す、この上澄は該細胞からの大部分の低分子量ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでいる。この時点での該上澄の処理は該核酸の望む用途に応じて変化する。利用されている３種の該上澄の処理法がある。即ち、１）２〜２．５容のエタノールを上澄に加えて核酸を沈殿させ、かつ遠心により沈殿した核酸を回収する；２）バッファーに対して透析することによりＮａＣｌと残留ＳＤＳとを除去する；および３）フェノールおよび／またはクロロホルムを用いて該上澄を抽出して、エタノール沈殿または透析を行う前に残留タンパクおよび一３ＤＳを除去する。

かくして、公知技術は、核酸を単離もしくは分離する前に生物学的サンプルからタンパクを除去するためのより効果的な、単純な、しかも余り面倒でない方法を長い間捜し求めていた。フェノール−クロロホルム分離法で必要とされる時間、廃液投棄に係る経費およびこれら２種の化学試薬を扱うに必要とされる注意は、これら方法を、大規模抽出または小規模の実験室用途に適さないものとしている。

発ｍ本発明の目的の一つは、生物学的サンプル、例えば細胞消化物または細胞溶解物から核酸を単離するための高速かつ高効率の方法を開発することにある。

本発明のもう一つの目的は危険な化学薬品を使用せずに、かつ技術者に対する作業上の高い安全性を維持する、核酸の単離法を提供することにある。

本発明の更なる目的は、経済性のよいかつ便利な物質を使用する、生物学的サンプル中に存在するタンパクの沈殿法を提供することにある。

上記目的は生物学的サンプルから核酸を単離する以下の方法により達成され、該方法は核酸を含む生物学的サンプル中に存在するタンパクを分解（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ　）Ｌ／、十分な量の有機または無機塩を加えて該タンパクを沈殿させ、該塩を含む生物学的サンプルを、該サンプル全体に亘る十分な塩の分散を達成するのに十分な時間混合して、タンパク沈殿を得、該サンプルから該沈殿タンパクを分離し、最後に該生物学的サンプル中に残留している核酸を分離する各工程を包含する。

好ましい　　の　しい−己本発明の方法は、生物学的サンプルから核酸を単離または分離するのに通している０本発明で意図する生物学的サンプルとは、核酸を含有する任意のサンプルまたは組成物として定義される。

このようなサンプルは細胞溶解物、細胞消化物、白血球細胞含有サンプル、組織サンプル、尿サンプル、血液斑（ｂｌｏｏｄ　５ｔａｉｎ　）などを含む、適当なサンプルは膵臓、腎臓、心臓、筋肉、精子、腸、皮膚、血液などから得られ、これらは細胞が核酸を含む様々な生体、例えば哺乳類（ヒトなど）由来のものであり得る。適当なサンプルは、例えば細菌細胞などの微生物をも包含する。当業者は、核酸例えばＤＮＡおよびＲＮＡを抽出すべき適当な生物学的サンプルが何であるかを認識しているであろう。

用語１生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅ　）　　”は本発明を記載する際に好ましく使用される。というのは、バイオテクノロジーの分野の多数の技術が核酸の単離を必要とするからである。

典型的な用途は制限酵素消化、連結、クローニングなどを含む。

このような核酸単離に使用されるサンプルの型は変化し得る。

まず、該生物学的サンプル中に存在するタンパク含有核タンパクが分離される。

しばしば、変性（ｄｅｎａｔｕｒｉＢ　）なる用語がこの工程の記載のために使われる。この技術は当分野で周知である。

現在、ブロティナーゼにとＳＤＳの使用が上述の“ＭａｌｅｅｕｌａｒＣｌｏｎｔｎｇ　”に述べられているように、好ましい技術である。得られる生成物はしばしば細胞消化物と呼ばれる。

本発明の実施のためには、任意の型の塩が使用できる。明らかに、該塩は、該核酸の単離の際の他のあらゆる工程で使用する化合物の作用を妨害しないように選択されなければならない、適当な塩はあらゆる有機塩並びにあらゆる無機塩を包含する０代表的な塩の例は任意の標準的な化学のテキストを参照することにより１９８５、第１３版、ジッンＡ、ディーン（Ｊｏｈｎ　Ａ、　Ｄｅａｎ　）１！修であり、その全体を本明細書の参考文献とする。

最も簡単な用語で、塩とはカチオンとアニオンとの会合体と考えることができる０本発明の実施の際に推奨されるアニオンは、塩素、臭素、弗素およびヨウ素イオンボレートイオン、次亜臭素酸イオン、次亜塩素酸イオン、硝酸イオン、亜硝酸イオン、次亜硝酸イオン、硫酸イオン、ジクロメ−トイオン、亜硫酸イオン、スルホン酸イオン、燐酸イオン、ジホスフェートイオン、亜燐酸イオン、ホスホン酸イオン、ジホスホネートイオン、過塩素酸イオン、パークロライドイオン、オキサレートイオン、マロネートイオン、サクシネートイオン、ラクテートイオン、カルボネートイオン、アセテートイオン、ベンゾエートイオン、シトレートイオン、トシレートイオン、ベルマンガネートイオン、マンガネートイオン、プロパル−トイオン、プロパノエートイオン、エタンジオエートイオン、ブタノエートイオン、プロポキシドイオン、クロメートイオン、ジクロメートイオン、セレネートイオン、オルトシリケートイオン、メタシリケートイオン、ペルテクネテートイオン、テクネテートイオン、ジメタル−トイオン、ジメトキシトイオン、チオシアネートイオン、シアネートイオン、イソシアネートイオン、１．４− シクロヘキサンジチオレートイオン、オキシドブタノエートイオン、３−スルフィドシクロブタン−１−スルホネートイオン、２−　（２−カルボキシラドエチル）−シクロヘキサンカルボキシレートイオン、２−アミノ−４−（メチルチオ）−ブタノエートイオンなどを含むが、これらに制限されない。

推奨されるカチオ・ンはナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、アミロライド、アンモニウム、リチウム、ベリリウム、セシウム、亜鉛、クロム、銅、アルミニウム、バリウム、ストロンチうム、鉄、錫、ニッケル、バリウム、銀、プラチナ、パラジウム、チタンカチオンなどであるが、これらに制限されない。

好ましい塩は様々なファクタに依存し、例えばエタノールを最終抽出で使用する場合、該塩は好ましくはエタノール可溶性であって、最終的な単離の際に核酸と共に沈殿しないものであるべきである。硫酸塩は典型的にはエタノール不溶性である。また、該塩はｐＨを大巾に変化させず、あるいはＤＮＡを変性しないように中性であることが有利である。更に、タンパクの消化のためにＳＯ３を用いる場合、該塩のカチオンが、核酸消化物中に存在するかも知れないアニオン性ＳＤＳと反応しないことが好ましい。

というのは、この反応はスラッジを形成し、該スラッジが水性層の上部に浮遊する恐れがあるからである。ある条件下でかつある濃度において、重金属塩がホスホジエステル結合の開裂を起こして、核酸を損傷する恐れがある。従って、重金属塩を選ぶ場合には該生物学的サンプル中に存在するＤＮＡおよびＲＮＡを損わないように注意する必要がある。

上記の推奨されるカチオンおよびアニオンの群から明らかな如く、任意の無機または有機塩が本発明の生物学的サンプル中のタンパクを沈殿させるのに適している。好ましい無機塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムを含む、塩化ナトリウムがより好ましい、有機塩の中では酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、および安息香酸ナトリウムが好ましい、該無機並びに有機塩両者の中では酢酸アンモニウムが最も好ましい塩である。

この塩は該生物学的サンプルに存在する細胞性タンパクを脱水しかつ沈殿させると考えられる。従って、該塩は水に対する高い溶解度を有していて、十分な塩分子と水分子との結合を可能とし、かくして該タンパクを容易に脱水かつ沈殿させることが望ましい。

本発明を実施する上で必要な塩の量は生物学的サンプル中に含まれるタンパクを沈殿するのに十分な量である。上述のように、極めて多種の型の生物学的サンプルが本発明の実施に適している。

また、該サンプルの起源に依存して、存在するタンパクおよび核酸の量は変化する。更に、生物学的サンプルのいくつかは該核酸の単離前に実質的な浄化を行う必要がある。塩の量は該生物学的サンプルの全重量基準で約０．０１重量％〜約５００重量％の範囲であり得る。好ましくは、この範囲は約０．１〜約５０重量％である。該塩は飽和溶液として添加することが好ましいが、固体または＠薄溶液として添加してもよい０例えば、ＮａＣＩｔの場合、飽和溶液は約３５％（Ｗ／Ｖ）溶液である。

塩の添加後、生物学的サンプルは混合して、該サンプル全体に亘り該塩の所定の分配を達成する必要がある。多くの場合において、約１５秒間、該塩を含む生物学的サンプルを振盪することで十分である。しかし、該サンプルの大きさ、サンプルの型、選ばれた塩、混合法、環境温度などのファクタに依存して、混合時間は約３秒〜約２０分の間のいずれかの時間であり得る。正確な混合時間は特に限定されないが、塩を含む生物学的サンプルは、その全体に亘る塩の満足な分散を達成するのに十分な時間混合する必要がある。これによってタンパクの沈殿が得られる。

この混合工程の後、沈殿したタンパクは、当分野で公知の任意の方法により回収される核酸に冨む上澄および該生物学的サンプルから分離できる。このような技術の一つは生物学的サンプルおよび該タンパク沈殿の遠心分離である。−回の１５分間の遠心で一般には十分であり、核酸に冨む上澄が、かくして容易に該沈殿タンパクから分離される。また、該沈殿タンパク含有生物学的サンプルは単純に濾過して核酸に冨む液とすることができる。

次に、該核酸に冨む上澄中の核酸は、当分野で公知の任意の技術を用いて生物学的組成物から分離できる。核酸の一般的沈殿法はアルコール、例えばエタノール、インプロパツールなど、あるいはまたボリミン（ｐｏｌｙ■１ｎ）−Ｐ、ストレプトマイシン硫酸塩、金属例えば銅などの使用を含む、この後者の方法は、高分子量核酸の場合に特に有用である。

核酸の最も広範に使用されている濃縮法はエタノールによる沈殿法である。エタノールは周囲温度で使用できるが、本発明の実施においては広範囲の温度が適している。この温度は核酸の沈殿にとって十分な値でなければならない、明らかに、該サンプル中に存在するあらゆる他の物質が核酸と共に沈殿しないことも望ましいことである。この広範に利用されている方法での沈殿は遠心により回収され、適当なパンファー中に所定の濃度で再溶解される。この方法は迅速かつナノグラム程度の量の核酸に対してさえ定量的である。核酸サンプル中に存在する一価カチオンの濃度が極めて高い場合には、ＴＥ（ｐｉ（８，０）で希釈することができる。

塩の濃度が低すぎる場合には、適当な塩溶液を加えることができる。推奨される塩溶液は酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび酢酸アンモニウムを含む。

ＤＮＡおよび／またはＲＮＡが該生物学的サンプルから単離される。ＲＮＡを溶液から沈殿させるのに、ＤＮＡの場合よりもわずかに高濃度のエタノールを用いる必要がある。ＲＮＡは、一般に約２．５容のエタノールを必要とし、これは最終的エタノール濃度を７１％とする。しかし、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを得るための、当分野で公知の方法は多数あることは明らかである。核酸の濃縮または沈殿法の詳細な記載はマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）等の上記文献に示されている。この文献の全体を本明細書の参考文献とする。

次に、単離されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡは任意の標準的な分子生物学的応用面、例えば制限酵素消化、連結およびクローニングで用いることができる。更に、サンプルはＤＮアーゼおよび有機抽出を利用して更に処理してノーザンブロ７）分析に適したＲＮＡを得ることもできる。

本発明並びにその利点を更に説明するために、以下に特定の実施例を与えるが、これらは例示の目的でのみ与えられるものであり、本発明を限定するものではないと理解すべきである。

大嵐■土塩■±上ユユム抗凝集化処理した血液を含む管を約２０分間、２．ＯＯＯｒｐｍにて遠心して、血漿から細胞を分離した。白血球バフィーコートを１５−１容のポリプロピレン管に移した。約９−ｌの赤血球溶解バッフｙ−（０，１４４Ｍ　　ＮＨａＣｊｔ！、　０．０１　Ｍ　　ＮａＨＣＯｓ）をこのポリプロピレン管に加えて、赤血球細胞を溶解（血）した、このポリプロピレン管を数回転倒させ、かつ約２０分間室温に保った。

この管を１５分間２＋００Ｏｒｐｍにて回転し、白血球細胞を分離した。上澄を捨てた。白血球細胞ペレットが残された。

約３ｔａｌの核溶解バッフｙ−（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭＮａＣｊ！および２ｍＭ　Ｎａｇ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，２）を該白血球ペレットを再懸濁するために加えた。約０．２ｗｂｌｔの１０％ＳＤＳ溶液および０．５ｍＪのプロテアーゼに溶液（１％ＳＤＳおよび２ｍＭＮａ１ＥＤＴＡ溶液中にプロテアーゼｌ（ｌａｇ）を白血球懸濁液に加えて、該ヌクレアーゼを不可逆的に不活性化し、かつ核タンパクを分離した。この懸濁液を数回転倒させ、３７℃にて最小時間である３時間に亘り維持した。

約１＋ｗＪの飽和ＮａＣｌ溶液を該核酸消化物に加えて、該消化物中に存在するタンパクを沈殿かつ除去した。この混合物を激しく１５秒間振盪し、２．５０Ｏｒｐｍにて１５分間遠心処理した。

ＤＮＡに冨む上澄を１５曽ｊ！容量のポリプロピレン管に移した。

室温下にある約２容のエタノールを該ポリプロピレン管に加えて、ＤＮＡを沈殿させた。この量のエタノールではＲＮＡを沈殿させるには不十分であるから、ＲＮＡは溶液中に残される。この管を数回転倒させて、ＤＮＡストランドを形成し、がっ−緒に固着させる。ＤＮＡストランドはふわふわした白色の外観を呈した。このＤＮＡをプラスチックスパチュラを用いて、約１００〜２００μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ！および０．２ｍＭ　ＮａｔＥＤＴＡ　（ｐＨ７，５）を含む１．５＋ｗｊ！のマイクロ遠心管に移して、ＤＮＡを溶解した０次に、このＤＮＡを脱イオン水中に１＝１００に希釈し、分光々度肝で２６０／２８０ｎｓにて定量（ＤＮＡの定量／残留タンパク量）した、５回の別々の実験を、ＮａＣＩｔを用いて行い、以下のような２６０／２８０値が得られた：１．８．１．７７．１．９．１．７６および１．７８．１．５またはそれ以上の値が望ましいと考えられる。

スｍ１不ｄすＬ欠ム実施例２は実施例１と同様に行った。ただし、約１．ＯｓＪの飽和ＫＣ１溶液を細胞消化物に加えた。ふわふわした白色のＤＮＡストランドが得られた。

大血■１１■ヱｌ主之立ム約１．ＱｍＪの飽和Ｍｇ１１．溶液を細胞消化物に添加した点を除き、本例は実施例１と同様に行った。ふわふわした白色のＤＮＡストランドが得られた。

ス１１１１酢１フ」ｆＬｒム約１．０ｙａｌの酢酸ナトリウムの飽和溶液を細胞消化物に加えたことを除き、本例は実施例１と同様にして実施した。６種の別々の実験を、酢酸ナトリウムを用いて行い、以下の２６０／２８０値を得た：１．７６．１．８３．１．８．１．８２．１．８４および１．９゜皇旅班工酢鼠ヱｌ天王立人約１．ＱｍＪの酢酸アンモニウムの飽和溶液を細胞消化物に加えた点以外は実施例１と同様にして実施例５を実施した。白血球サンプルは以下の２６０／２８０値を与えた１、８７．１．８４．１．８６．１．８７．１．８７．１．８８．１．８７．１．８６．１．８７．１．８７．１．８８．１．８７．１．８６．１．８４．１．８８および１．８７゜１旌ＬＬ昆菫ヱヱ至王立ム酢酸アンモニウムを用いて実施例５と同様にして実施例６を行った。但し、実施例６の生物学的サンプルは組織由来のものであった。１．７７なる２　６０／２８０値が得られた。

叉隻五よりＮＡサンプルを　いたＲＦＬＰ　　”本実施例７は実施例１と同様に実施した。但し、ＤＮＡを５種の異る固体由来の抗凝集化処理した血液から抽出した。抽出後、サンプルを定量し、各サンプル５μｇをＡｐａｌ　　８Ｕ／μｇで制限切断した。ＤＮＡを製造業者〔ニューイングランドバイオラブズ社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、）　）の指示に従ってインキユベートした。ＤＮＡをアガロースゲル中での電気泳動に付し、エチジウムブロマイドで染色して制限切断が完全であるか否かを確認し、かつサザンプロット検定した。

膜を、Ａρａｌ制限フ制限フラグメント性多形性ａ　ｆ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ＋ｍｓ）の検出に特異的なヒ）ＤＮＡプローブでハイブリッド化した。ダイクス（Ｄｙｋｅｓ　）等の“ザユースオブビオチニレーテッドＤＮＡブローブズフォーディテクティングシングルコピーヒューマンレストリクションフラグメントレングスポリモルフイズムズセパレーテッドバイエレクトロフォーレシス（Ｔｈｅ　［Ｊｓｅ　ｏｒ　［３ｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ口ＮＡ　　Ｆ’ｒｏｂｅｓ　　ｆｏｒ　　Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　　Ｓｉｎｇｌｅ　　Ｃｏｐｙ　　ｆｌｕｓａｎ　　ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏ１ｙ＋＊ｏｒｐｈｉ＊ｓ　５ｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　Ｂｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）Ｃ［１ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、　　１９８６．　７．　ＰＰ、　　２７８−２８２］に記載されたような非−同位体型検出系を用いてバンドを検出した。

観測されたパターンは部分的制限切断はないことを示した。このことは、この塩析抽出法が制限酵素を妨害しないことを立証している。

本実施例８は実施例７と同様に実施した。尚、抽出ＤＮＡサンプルは６Ｕ／μｇのＴａｇｌおよび９Ｕ／ｌｔｇのＭｓｐＩで別々に制限切断した。ハイブリダイゼーション後に観測されたノインドおよび非同位体検出は完全な制限切断を立証した。

実施例９ＤＮＡサンプルを用いたＲＦＬＰ研究本研究側実施例９例７と同様に実施した。尚、抽出ＤＮＡサンプルはｌ０ＬＩ／ μｇのＲｓａｌで制限切断した。）％イブリッド化後のバンドおよび非同位体検出により完全な制限切断が立証された。

以上、本発明を好ましい様々な態様によって記載してきたが、当業者には、本発明の精神から逸脱することなしに、様々な改良、置換、省略並びに変更をなし得ることを理解するであろう、即ち、本発明の範囲は以下の請求の範囲によってのみ制限されるものである。

特許庁長官　　植　松　　　敏　　殿１、特許出願の表示　　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００４６３２、発明の名称　　　　核　　酸　　単　　離３、特許出願人４、代理人（１）補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　１　通浄書（内容に変更なし）請求の範囲１゜ａ）　核酸含有生物学的サンプル中に存在するタンパクを分解し、ｂ）室温にて、十分な量の有機または無機塩を加えて、該タンパクを沈殿させ、Ｃ）液塩を含有する該生物学的サンプルを室温にて３秒乃至２０分間振盪し、て、該生物学的サンプル全体に亘り液塩を十分に分散させ、かつタンパクの沈殿を得、ｄ）　　ｔｉｔ生物学的サンプルから該沈殿したタンパクを分離し、およびｅ）該生物学的サンプル中に残留する該核酸を分離する各工程を含む生物学的サンプルから核酸を分離する方法。

２、該タンパクを、タンパク分解酵素またはイオン性界面活性剤を用いて上記工程ａ）で分解する請求の範囲第１項記載の方法。

３、該タンパクを、ブロティナーゼにとドデシル硫酸ナトリウムとを用いて、上記工程ａ）で分解する請求の範囲第２項記載の方法。

４、液塩が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムまたは安息香酸ナトリウムである請求の範囲第１項記載の方法。

５、液塩が酢酸アンモニウムである請求の範囲第４項記載の方法。

６、液塩が該生物学的サンプル全重量の約０．０１ｗｔ％乃至約５００ｗｔ％の範囲の量で存在する請求の範囲第１項記載の方法。

７、該沈殿タンパクを遠心により分離する請求の範囲第１項記載の方法。

８、該沈殿タンパクを濾過により分離する請求の範囲第１項記載の方法。

９、該核酸を、核酸の沈殿を得るのに十分な量のアルコールの添加により、上記工程ｅ）で分離する請求の範囲第１項記載の方法。

１０、十分な量のアルコールを添加して、主としてＤＮＡを沈殿させる請求の範囲第９項記載の方法。

１１、十分な量のアルコールを添加して、主としてＲＮＡを沈殿させる請求の範囲第９項記載の方法。

１２、ａ）　Ｄ　Ｎ　Ａ含有生物学的サンプル中に存在するタンパクを分解し、ｂ）　塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムおよび安息香酸ナトリウムからなる群から選ばれる塩の十分な量を室温にて添加して、該タンパクを沈殿させ、ｃ）該塩含有生物学的サンプルを室温にて３秒乃至２０分間振盪して、該生物学的サンプル全体に亘り液塩を十分に分散せしめて、タンパク沈殿を得、ｄ）該生物学的サンプルから該沈殿タンパクを分離し、およびｅ）該生物学的サンプル中に残留する該ＤＮＡを分離する各工程を含む、生物学的サンプルからＤＮＡを単離する方法。

１３、該タンパクを、プロティナーゼにとドデシル硫酸ナトリウムとを用いて、上記工程ａ）にて分解する請求の範囲第１２項記載の方法。

１４、液塩が酢酸アンモニウムである請求の範囲第１２項記載の方法。

１５、！ｆＤＮＡを、十分な量のアルコールを添加してＤＮＡを沈殿させることにより上記工程ｅ）にて分離する請求の範囲第１２項記載の方法。

１６、該アルコールがエタノールである請求の範囲第１５項記載の方法。

１７、該エタノールが室温にて添加される請求の範囲第１６項記載の方法。

手続補正書（方式）％式％２、発明の名称　　　　核　　酸　　単　離３、補正をする者事件との関係　　出願人４、代理人５、補正命令の日付　　自　　　発１、事件の表示　　　ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００４６３２、発明の名称　　　　核　　酸　単　離３、補正をする者事件との関係　　出願人４、代理人５ｏ補正命令の日付　　°平成３年４月１６１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）核酸を含む生物学的サンプル中に存在するタンパクを分解し、ｂ）十分な量の有機または無機塩を加えて該タンパクを沈殿させ、ｃ）十分な時間該塩を含む該生物学的サンプルを混合して、該生物学的サンプル全体に亘り酸塩を十分に分散せしめ、かつタンパクの沈殿を得、ｄ）該沈殿タンパクを該生物学的サンプルから分離し、およびｅ）該生物学的サンプル中に残留する該核酸を分離する、各工程を含む生物学的サンプルから該酸を単離する方法。
２．該タンパクがタンパク分解酵素またはイオン性界面活性剤を用いて上記工程ａ）で分解される請求の範囲第１項記載の方法。
３．プロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウムとを用いて、該タンパクを上記工程ａ）で分解する請求の範囲第２項記載の方法。
４．上記塩が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムまたは安息香酸ナトリウムである請求の範囲第１項記載の方法。
５．該塩が酢酸アンモニウムである請求の範囲第４項記載の方法。
６．該塩が該生物学的サンプルの全重量基準で、約０．０１ｗｔ％乃至約５００ｗｔ％の範囲の量で存在する請求の範囲第１項記載の方法。
７．該沈殿タンパクを遠心により分離する請求の範囲第１項記載の方法。
８．該沈殿タンパクを濾過により分離する請求の範囲第１項記載の方法。
９．核酸を沈殿させるのに十分な量のアルコールを添加することにより上記工程ｅ）で該核酸を分離する請求の範囲第１項記載の方法。
１０．十分な量のアルコールを加えて、主としてＤＮＡを沈殿させる請求の範囲第９項記載の方法。
１１．十分な量のアルコールを加えて、主としてＲＮＡを沈殿させる請求の範囲第９項記載の方法。
１２．ａ）ＤＮＡ含有生物学的サンプル中に存在するタンパクを分解し、ｂ）塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、および安息香酸ナトリウムからなる群から選ばれる塩の十分な量を加えて、該タンパクを沈殿させ、ｃ）該塩含有生物学的サンプルを十分な時間混合し、該生物学的サンプル全体に亘る該塩の十分な分散を達放して、タンパク沈殿を得、ｄ）該生物学的サンプルから該沈殿したタソバクを分離し、およびｅ）該生物学的サンプル中に残されたＤＮＡを分離する各工程を含む生物学的サンプルからＤＮＡを単離する方法。
１３．該タンパクがプロティナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウムを用いて、該工程ａ）で分解される請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．該塩が酢酸アンモニウムである請求の範囲第１２項記載の方法。
１５．該ＤＮＡを、十分な量のアルコールを添加してＤＮＡを沈殿させることにより該工程ｅ）において分離する請求の範囲第１２項記載の方法。
１６．該アルコールがエタノールである請求の範囲第１５項記載の方法。
１７．該エタノールを周囲温度にて添加する請求の範囲第１６項記載の方法。