CN102586234B

CN102586234B - 一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法

Info

Publication number: CN102586234B
Application number: CN201210062436.4A
Authority: CN
Inventors: 许波; 杨富亚; 黄遵锡; 杨云娟; 李俊俊; 唐湘华
Original assignee: Yunnan Normal University
Current assignee: Yunnan Normal University
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: CN102586234A

Abstract

本发明是一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法。包括样品处理、菌体细胞裂解和抽提DNA。用无菌PBS缓冲液溶解动物粪便样品，通过低速离心和过滤去除粪便中的食物残渣，收集菌体细胞，采用溶菌酶+消色肽酶+蛋白酶+SDS对菌体进行破壁，再经酚、氯仿、异戊醇混合液及氯仿、异戊醇混合液抽提，异丙醇及醋酸钠沉淀、洗涤干燥、溶解后用RNA酶消解RNA。本发明操作简单，提取的基因组DNA分子量达到40kb以上，可满足微生物分子生态多样性、分子鉴定、目的基因扩增及构建宏基因组文库等的研究。

Description

一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法

技术领域

本发明涉及微生物的分子生物学技术领域，具体是一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法。

背景技术

动物胃肠道内庞大多样的微生物群落与动物的食性、机体的免疫功能、疾病与健康等有着密切联系，越来越引起重视并成为研究热点。然而采用传统方法破环性的采集胃肠道样品对其进行研究受到很大制约，且对于野生保护动物并不可取，因此很多研究都以动物的粪便作为研究样品。

目前，分子生物学技术已成为研究和开发动物胃肠道微生物资源的核心技术，而从粪便样品中提取高质量、完整和有代表性的基因组DNA则是整个技术的基础。目前，研究者们常采用酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、微珠振荡法以及一些大型公司推出的商业试剂盒，如QIAamp? DNA Stool Mini Kit，Qiagen等从动物粪便中提取基因组。这些方法所提取的基因组DNA虽然可以满足微生物分子生态多样性研究、分子鉴定、目的基因扩增等研究的需要，但所得基因组DNA分子量一般难以达到40kb以上，因此无法用于大片段宏基因文库的构建。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、经济、简单且易于操作的从动物粪便中提取高分子量基因组的方法，用以从动物粪便样品中提取高分子量的微生物基因组DNA，满足微生物分子生态多样性、分子鉴定、目的基因扩增及构建宏基因组文库等研究的需要。

为实现这一目的，本发明的技术方案中，先通过离心和过滤去除粪便中的食物残渣，收集菌体细胞；然后分别采用溶菌酶和消色肽酶对菌体进行破壁，以使动物粪便中对溶菌酶有抗性的革兰氏阳性菌得以裂解，从而提高粪便样品中DNA的产率和种类数量；经过全方位的裂解细胞释放核酸，再利用酚、氯仿、异戊醇混合液及氯仿、异戊醇混合液提取；再加入异丙醇及醋酸钠沉淀，RNA酶去除RNA后得到微生物基因组DNA。为避免机械力对DNA造成损伤，在菌体细胞开始裂解以后的步骤中，均采用轻柔的动作进行操作，避免用枪头来回吹打，并且将吸取溶液的枪头尖剪成大口。

本发明的方法具体步骤包括：

（1）样品处理：用无菌PBS缓冲液溶解收集的动物粪便样品，彻底混匀后先低速离心去除大的食物残渣，然后依次用孔径为100μm、70μm、40μm的灭菌细胞过滤器进行过滤，并用PBS缓冲液对截留在滤网上的杂质进行多次冲洗；滤液置于离心机中离心，收集菌体；菌体依次用PBS缓冲液和TE缓冲液洗涤、离心收集菌体，用TE缓冲液悬浮菌体。

（2）菌体细胞裂解：向菌体悬浮液中加入高浓度的溶菌酶至终浓度15mg/ml，轻柔混匀后37℃水浴1h；加入消色肽酶至终浓度3mg/ml，轻柔混匀后37℃水浴30min；加入蛋白酶K至终浓度2mg/ml，轻柔混匀后55℃水浴5min；加入浓度为10%的SDS（中文），轻柔混匀后55℃水浴1h。

（3）抽提DNA：在上述处理后的细胞裂解液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液，轻柔混匀后离心收集上清液；加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，轻柔混匀后离心收集上清液；加入1倍体积异丙醇、1/10体积醋酸钠，轻柔混匀后室温沉淀30min以上；离心收集沉淀，用浓度为70%的乙醇洗涤沉淀，离心后收集沉淀；沉淀置于室温或真空干燥后，用TE或无菌去离子水溶解，并用RNA酶37℃水浴30min消解去除RNA，即为基因组DNA提取液；

所述PBS缓冲液为：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na₂HPO₄，2 mmol/L KH₂PO4，pH 7.4；

所述TE缓冲液为：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)；

所述酚/氯仿/异戊醇混合液的体积比为25:24:1；

所述氯仿/异戊醇混合液的体积比为24:1。

本发明方法简便，适合从各种动物粪便中提取微生物基因组DNA，得到的DNA分子量较大。本发明方法可用于微生物分子生态多样性、分子鉴定、目的基因扩增及构建宏基因组文库等的研究。

附图说明

图1 为本发明实施例中提取的倭蜂猴粪便微生物基因组DNA的普通电泳图。其中1为基因组DNA 1μl；2为基因组DNA 5μl ；Marker为lamda DNA-HindⅢ digest marker。

图2 为本发明实施例中提取的倭蜂猴粪便微生物基因组DNA的脉冲场电泳图；Marker为Low Range PFG Marker。

具体实施方式

实施例：

1、样品处理

（1）无菌条件下称取倭蜂猴粪便样品1g，移入体积为50ml的无菌带盖离心管中，加入15ml无菌PBS缓冲液，充分涡旋振荡后100g离心15min，弃沉淀；

（2）上清用孔径为100μm的灭菌细胞过滤器进行过滤，并用无菌PBS缓冲液多次冲洗截留在滤网上的杂质，收集滤液；

（3）滤液用孔径为70μm的灭菌细胞过滤器进行过滤，并用无菌PBS缓冲液多次冲洗截留在滤网上的杂质，收集滤液；

（4）滤液用孔径为40μm的灭菌细胞过滤器进行过滤，并用无菌PBS缓冲液多次冲洗截留在滤网上的杂质，收集滤液，以5000g离心10min，收集菌体沉淀；

（5）依次分别加入15 ml无菌PBS缓冲液和TE缓冲液洗涤、同上离心收集菌体，用3 ml TE缓冲液充分悬浮菌体，并将悬浮液均分于8个体积为1.5 ml的小离心管中。

2、菌体细胞裂解

（1）向每管菌体悬浮液中加入100mg/ml的溶菌酶至终浓度15mg/ml，轻柔混匀后37℃水浴1h，中间每隔10min混匀一次；

（2）加入50mg/ml的消色肽酶至终浓度3mg/ml，轻柔混匀后37℃水浴30min；

（3）加入20mg/ml蛋白酶K至终浓度2mg/ml，轻柔混匀后55℃水浴5min；

（4）加入浓度为10%的SDS 50μl，轻柔混匀后55℃水浴1h，中间每隔10min混匀一次。

3、抽提DNA

（1）在上述处理后的细胞裂解液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（V/V/V=25:24:1），轻柔混匀后12000g离心5min，收集上清液并转入新的离心管中；

（2）加入等体积的氯仿/异戊醇（V/V=24:1），轻柔混匀后12000g离心5min，收集上清液并转入新的离心管中；

（3）加入1倍体积异丙醇、1/10体积醋酸钠，轻柔混匀后室温沉淀30min以上；

（4）12000g离心15min，弃上清，收集沉淀，用浓度为70%的乙醇洗涤沉淀，同上离心后收集沉淀；

（5）沉淀置于室温或真空干燥后，用适量TE或无菌去离子水溶解，并加入10mg/ml RNA酶至终浓度1mg/ml，37℃水浴30min消解去除RNA，即为基因组DNA提取液。

所述PBS缓冲液为：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na₂HPO₄，2 mmol/L KH₂PO4，pH 7.4。

所述TE缓冲液为：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。

Claims

1.一种从动物粪便中提取高分子量基因组的方法，其特征在于按以下步骤进行：

（1）样品处理：用无菌PBS缓冲液溶解收集的动物粪便样品，彻底混匀后先低速离心去除大的食物残渣，然后依次用孔径为100μm、70μm、40μm的灭菌细胞过滤器进行过滤，并用PBS缓冲液对截留在滤网上的杂质进行多次冲洗；滤液置于离心机中离心，收集菌体；菌体依次用PBS缓冲液和TE缓冲液洗涤、离心收集菌体，用TE缓冲液悬浮菌体；

（2）菌体细胞裂解：向菌体悬浮液中加入高浓度的溶菌酶至终浓度15mg/mL，轻柔混匀后37℃水浴1h；加入消色肽酶至终浓度3mg/mL，轻柔混匀后37℃水浴30min；加入蛋白酶K至终浓度2mg/mL，轻柔混匀后55℃水浴5min；加入浓度为10%的SDS，SDS的终浓度为8.8mg/mL，轻柔混匀后55℃水浴1h；

（3）抽提DNA：在上述处理后的细胞裂解液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液，轻柔混匀后离心收集上清液；加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，轻柔混匀后离心收集上清液；加入1倍体积异丙醇、1/10体积醋酸钠，轻柔混匀后室温沉淀30min以上；离心收集沉淀，用浓度为70%的乙醇洗涤沉淀，离心后收集沉淀；沉淀置于室温或真空干燥后，用TE或无菌去离子水溶解，并用RNA酶37℃水浴30min消解去除RNA，即为基因组DNA提取液；所述酚/氯仿/异戊醇混合液的体积比为25:24:1；所述氯仿/异戊醇混合液的体积比为24:1。

2.根据权利要求1所述的从动物粪便中提取高分子量基因组的方法，其特征在于所述PBS缓冲液为：137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na₂HPO₄，2 mmol/L KH₂PO4，pH 7.4。

3.根据权利要求1所述的从动物粪便中提取高分子量基因组的方法，其特征在于所述TE缓冲液为：10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。