CN101307311A

CN101307311A - 一种猪粪样总dna的提取方法

Info

Publication number: CN101307311A
Application number: CNA2008100455340A
Authority: CN
Inventors: 王红宁; 唐俊妮; 曾志光; 樊汶樵; 谢波; 曾瑜虹; 杨鑫
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2008-07-14
Filing date: 2008-07-14
Publication date: 2008-11-19

Abstract

本发明涉及微生物学和分子生物学技术领域，是一种猪粪样总DNA的提取方法，本发明主要包括粪便样品的预处理、样品总DNA提取。以采集新鲜粪便样品或冻存的粪便样品为材料，先用PBS缓冲液、多聚甲醛溶液、无水乙醇等进行粪便样品的预处理，获得粪样菌悬液；再以CTAB溶液、β－巯基乙醇等共同裂解细胞释放DNA。本发明具有操作简单、快捷、高效、重复性好以及经济等特点，所提DNA浓度、纯度及得率高，无需纯化就能直接用于PCR扩增等后续分子生物学实验研究。

Description

一种猪粪样总DNA的提取方法

[发明领域]

本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及从猪粪便样品中提取总DNA的方法。

[背景技术]

哺乳动物肠道中存在约30个属500多种不同的细菌，约1×10¹⁴个活细菌，形成了复杂而动态平衡的微生态系统，对宿主营养物质的消化、吸收及免疫机制激活、生长发育等都起着十分重要的作用。若这种微生态平衡失调，则动物机体正常的生理功能就会发生紊乱，导致疾病的发生、流行，对畜牧养殖业尤其是规模化养殖产生了极大的潜在威胁。因而，近年来对肠道微生物区系结构及其多样性研究成为当前的热点，但由于肠道的特殊生存环境，使得肠道中有60％-80％的微生物是目前无法用传统的分离培养技术进行研究，从而阻碍了人们对肠道微生物结构及其多样性的客观认识。

随着现代分子生物学技术的发展及其在微生态学研究中的应用，人们能避开了传统菌的群分离培养过程，直接从DNA水平上对这些肠道菌群进行相关研究，因此，获得高质量、具有代表性的肠道菌群总DNA就成为这些研究的前提和重要技术手段。但由于粪便不但组成成分复杂(含有多聚糖、胆酸、胆盐、胆色素等PCR的强抑制物)，而且粪便中细菌类型数目繁多，而不同细菌因其各自独特的细胞壁成分和结构，又对不同的提取方法的敏感程度有所差异，从而导致了不同方法的提取效率不尽相同，进而使得肠道菌群多样性分析结果不尽如人意，甚至造成偏差(参见：刘健华等人.肠道菌群多样性梯度凝胶电泳分析法的建立，中国兽医科技，2005，35(6)：445-449)。目前粪便样品总DNA并没有标准、统一的提取方法，因而，选择较好的DNA提取方法对肠道微生态研究非常关键。

目前，国内外常用的DNA提取方法主要包括机械法，如硅珠法、冻融法等(参见：Schuurman T，Richard de Boer，Rachèl Patty，et al.Journal of Microbiological Methods，2007，71：238-245；刘健华等人.肠道菌群多样性梯度凝胶电泳分析法的建立，中国兽医科技，2005，35(6)：445-449)；化学法，如SDS法、苯酚法等(参见：Chris M，Denys B，Dietmar S.AnalyticalBiochemistry，2006，348：160-162；Burtscher MM，

KE，Sommer R，et al.Journalof Microbiological Methods，2006，67：281-293)；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等(参见：JoyceMS，Vance JM.，BryanAW，et al.Journal ofMicrobiological Methods，1999，36：167-179)和商业试剂盒法，如

Bio 101；C+T kit，Macherey-Nagal；Quantum

Genomic DNA isolation kit，Bio-Rad；

stool minikit，Qiagen等(参见：Alexandra L.M，Michelle J，Anthony R.B.Journal of MicrobiologicalMethods，2002，50：131-139；Pluske JR，Durmic Z，Payne HG et al.LivestockScience，2007，108：113-116)。这几种类型的DNA提取方法中，机械法、化学法及酶或其组合方法是实验室常规提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超声波或反复冻融来裂解细胞释放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、二氧化硅等进行DNA的抽提，最后无水乙醇沉淀。这几种常规的提取方法的优点是：原理清楚，便于分析及查找实验中出现的问题，而不足在于所提取的DNA纯度不高或者得率较低，常含有大量的PCR抑制物，需要进一步纯化处理才能用于后续的实验操作，如Savill等(参见：SavillM G，Murray S R，Scholes P，et al.Journal of Microbiological Methods，2001，47(3)：355-368)用蛋白酶K裂解粪便的同时还另外用十六烷基三甲基溴化铵来除去PCR反应抑制物，并且还用酚-氯仿进行了多次的抽提才得到较高纯度的总DNA；Ernest等(参见：Ernest HB，Penedo MC，May BP，et al.Molecular Ecology，2000，9：433-441)在用蛋白酶K提取粪便样品总DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子来纯化所得到的总DNA。试剂盒法虽然操作简单，但所提总DNA浓度、得率低，价格较昂贵、缺乏实验室通用性，不适于用于大规模粪便样品总DNA提取。另外由于专利等其它原因，试剂盒中具体成分及其含量不是很清楚，如果发生操作失败，很难分析找出实验失败原因(参见：哩申剑，张宝让，魏华等.三种粪便总DNA提取方法的比较.中国微生态学杂志，2008，20(1)：28-35)。

针对上述问题，国内外许多研究者提出了各种不同的提取粪便总DNA的方法。如Walsh等(参见：Walsh P S，Metzger D A，Higuchi R.Bio Techniques，1991，10(4)：506-513)利用Chelex-100煮沸法成功地提取了人类DNA，该方法简便易行，其还能利用Chelex-100碱性多价金属离子螯合剂能与多种金属离子(包括维持DNA酶活性所必需的金属离子)结合的能力来有效地抑制DNA酶的活性，防止DNA进一步降解；但在提取过程中却会导致DNA分子的变性；而目前广泛应用的磁珠吸附法虽无需使用蛋白酶或有机萃取试剂，就能直接利用磁珠吸附来DNA，但从磁珠上洗脱DNA时，会损失大量的DNA，导致DNA产量相当地低(参见：Flagstad O，Roed K，Stacy JE，et al.Mol Ecol，1999，8(5)：879-883)。另外，杨德君等(参见：杨德君，吴襟，刘毅等.一种快速提取肠道微生物总DNA的方法，中国微生态学杂志，2006，18(2)：91-93)利用玻璃滤器与试剂盒法相结合来提取兔粪便样品中的DNA，该方法所提取DNA纯度很高，但却由于动物粪便组成成分相当复杂，要针对不同动物粪便选择出合适孔径大小的玻璃滤器却非常地困难，因此，该方法很难推广，并因要用到试剂盒，而使提取成本较高，不适于大规模实验提取。

综上所述，常规的方法及其改良方法，获得粪便总DNA需要进一步纯化处理才能用于后续实验操作，耗时较长，不利于大规模实验提取。而近年来发展的新方法虽然能克服常规方法的缺点，提高了所得DNA的纯度，但却带来了如DNA变性，操作繁琐等问题。因此，需要找到一种新得能快速、高质、高效、廉价及无害提取具有代表性的肠道菌群总DNA的方法。

[发明内容]

本发明目的在于克服现有方法存在的缺陷，建立一种操作简单、快速、高效、高质且价格经济能适于实验室大规模提取的新方法。本发明主要包括粪便样品的预处理、样品DNA提取、PCR及电泳。以采集新鲜粪便样品或冻存的粪便样品为材料，先用PBS缓冲液、多聚甲醛溶液、无水乙醇等对粪便样品进行预处理，以获得粪便样品菌悬液，再以CTAB溶液、β-巯基乙醇、PVP-40等共同裂解细胞释放DNA。该发明已进行了广泛的比较研究，通过分析所得粪便总DNA的浓度、纯度、得率及16S rDNA全长扩增结果表明，本发明所得的DNA片段较完整、大小约为23kb，浓度、纯度、得率高，所得DNA可直接作为PCR扩增的模板，以及粪便微生态学等方面的研究。

本发明通过以下技术方案实现：

本申请人发明了一种新的粪样总DNA提取方法，该方法以采集新鲜粪便样品或冻存的粪便样品为材料，先以PBS缓冲液、多聚甲醛溶液及无水乙醇等对粪便样品进行预处理，获得菌体沉淀后，再采用化学方法裂解细胞释放DNA(即十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、β-巯基乙醇、PVP-40等联用)。所得总DNA无需纯化处理即可进行后续实验。

本发明的具体步骤如下：

(1)称取适量的粪便样于一无菌的50ml离心管A中，加入10～20ml PBS缓冲液及无菌的玻璃珠一起涡漩混匀；

(2)在200～400xg下离心2～8min后，尽可能多的取出上层悬液于另一无菌的50ml离心管B中；

(3)将步骤(2)所得的沉淀再用适量的PBS缓冲液重洗一次，并于200～400xg下离心2～8min，取出上层悬液合并于离心管B中；

(4)加适量体积一定浓度的多聚甲醛溶液于离心管B中，并将其置于4℃孵育1～2h；

(5)然后，6000～10000xg离心5～10min，弃上清，所得菌体沉淀用适量的PBS缓冲液及无水乙醇重悬，混匀后，于-20℃下保存30min以上；

(6)在6000～10000xg离心5～10min后，弃上清，再用适量的PBS缓冲液对所得菌体沉淀重新洗涤，之后再离心，弃上清，收集菌体沉淀；

(7)所得的菌体沉淀用适量的TE缓冲液重悬，混匀后即得经预处理的粪便样品菌悬液；

(8)取适量上述预处理的粪便样品菌悬液于1.5或2ml离心管中，12,000rpm离心5～10min，弃上清；

(9)加入0.8～1.5ml经60～70℃预热的裂解液及适量的1％～3％(v/v)β-巯基乙醇，混匀后60～70℃水浴0.5～1h，每隔几分钟取出摇匀一次；

(10)12,000rpm离心5min，离心后，移出上清于另一1.5或2ml离心管中，弃沉淀；

(11)向上清中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，10,000rpm离心10min，取上清至另一1.5或2ml离心管中；

(12)加入等体积的氯仿，混匀后于10,000rpm离心10min，再取上清；

(13)向上清中加入0.1倍体积的3M NaAC，混匀后再加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置30min以上；

(14)12,000rpm离心5min，弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干；

(15)用75％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于100μl TE中，加RNase A至终浓度为20μg/ml，37℃消化30min，之后于-20℃保存，备用；

(16)以步骤(15)所得的DNA为模板，以16S rDNA特异性引物P0：

5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，和1492r：5’-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3’

(参见；Di Cello F，Bevivino A，Chiarini L，Fani R，Paffetti D，Tabacchioni S，andDalmastri C.Applied and Environmental Microbiology，1997，63(11)：4485-4493；HayashiH，Sakamoto M，BennoY..Microbiol Immunol，2002，46(8)：535-548)扩增出粪便16S rDNA特异性条带并进行电泳检测。

[附图说明]

图1：本发明提取的DNA电泳检测图。图中编号1-8为重复8次平行提取的粪便总DNA，上样量为5μl。其中M为λDNA-HindIII marker，分子量标准从上至下依次为23kb，94kb，6.5kb，4.3kb，2.3kb，2.0kb(注：1kb＝1000bp，bp为碱基对)。

图2：3种不同方法提取样品粪便总DNA的电泳检测图。图中编号1-3；4-6；7-9依次分别为本发明方法，常规方法和试剂盒方法提取DNA电泳图，上样量为8μl。其中M为λDNA-HindIII marker，分子量标准从上至下依次为23kb，94kb，6.5kb，4.3kb，2.3kb，2.0kb(注：1kb＝1000bp，bp为碱基对)。

图3：以3种不同方法提取粪便总DNA为模板进行PCR扩增产物的电泳检测图。1-3；4-6；7-9分别依次为本发明方法，常规方法和试剂盒法的16Sr DNA的PCR扩增图。上样量为8μl。其中M为DNA MarkerIII，分子量标准从上至下依次为4500bp，3000bp，2000bp，1200bp，800bp，500bp，200bp(bp：碱基对)；C为阴性对照(即不加DNA模板)。

本发明的积极效果(表1)：

表1：本发明方法与常规提取方法、试剂盒提取方法实施效果比较

[具体实施方式]

实施例1：本发明方法提取猪粪便样品总DNA。

实验所用样品为采集的荣昌猪的粪便，所采集的粪便样品于-20℃下保存，备用。具体步骤如下：

(14)12,000rpm离心5min，弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干；

申请人用本发明对同一猪粪便样品进行了多达8次的重复提取实验，如图1所示，结果表明本发明方法的多次重复提取的实验效果基本一致，这说明该发明方法非常地稳定，适用于猪粪便总DNA的大规模提取。

实施例2：本发明与常规方法、试剂盒法提取粪便总DNA的比较。

为了比较本发明与现有的常规方法和商业试剂盒提取法的平行效果，申请人同时进行了利用本发明方法、常规方法和试剂盒法提取的比较实验，利用常规法从粪便中提取总DNA：按照Rousselon等(参见：Rousselon N，Delgenès JP，Godon JJ.J Microbiol Methods，2004，59(1)：15-22)报道的方法进行。利用试剂盒法从粪便中提取总DNA：所用试剂盒购自QiaGen公司，试剂盒的商品名称为

DNA Stool Mini Kit。上述两种方法使用的粪便样品同本发明相同，所提取的DNA溶于100ml的TE缓冲液中。

采用本发明方法，常规法和试剂盒法分别从粪便中提取的总DNA结果有较大差别，如图2所示，本发明方法所提得的总DNA产量高，是常规方法的2.3倍、是试剂盒方法的17倍。

实施例3：对实施例2提取的DNA进行16S rDNA的PCR扩增检测。

应用本实施例2提取的DNA作为模板，以设计的引物：正向引物P0为5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和反向引物1492r为5’-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3’，扩增粪便微生物16S rDNA(16S核糖核蛋白体RNA基因)。利用常规方法、试剂盒法和本发明的方法制备的粪便总DNA 1μl作PCR反应的模板分别扩增粪便微生物的16S rDNA。PCR反应体系如下(20μl)：10×PCR buffer，2μl；2.0mMMgCl2；200μM dNTP；0.5μM引物；1U Taq酶(TaKaRa)；DNA模板，1μl；加ddH20至20μl；PCR程序如下：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：58℃30s；延伸：72℃1.5min；最后延伸72℃8min；30个循环。

扩增后，取8μl在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，扩增的目的DNA片段大小为1560bp，如图3所示。1-3、4-6、7-9分别本发明方法、常规方法及试剂盒法，扩增结果表明，本发明方法PCR扩增的特异性条带完整，明亮，且较常规方法、试剂盒法更为清晰。

Claims

1.一种猪粪样总DNA的提取方法，其方法特征在于按如下步骤操作：

(1)取适量经过预处理的粪便样品菌悬液于1.5或2ml离心管中，12,000rpm离心5min，弃上清；

(2)加入0.8～1.5ml经60～70℃预热的裂解液及适量浓度的β-巯基乙醇溶液，混匀后60～70℃水浴0.5～1h，每隔几分钟取出摇匀一次；

(3)12,000rpm离心5min，离心后，移出上清于另一无菌1.5或2ml离心管中，弃沉淀；

(4)向上清中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，10,000rpm离心10min，取上清至另一无菌1.5或2ml离心管中；

(5)加入等体积的氯仿，混匀后于10,000rpm离心10min，再取上清；

(6)向上清中加入0.1倍体积的3M NaAC，混匀后再加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀后-20℃放置30min以上；

(7)12,000rpm离心5min，弃上清，所得DNA沉淀在室温下晾干；

(8)用75％的乙醇对DNA沉淀进行洗涤，干燥后沉淀溶于100μl TE中，加RNaseA至终浓度为20μg/ml，37℃消化30min，之后于-20℃保存，备用；

(9)以步骤(8)所得的DNA为模板，以16S rDNA特异性引物P0：

5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，和1492r：

5’-CGGCTTACCTTGTTACGACTT-3’扩增出粪便16S rDNA特异性条带并进行电泳检测。

2.权利要求1所述的粪样总DNA提取方法中，所述的裂解液的特征在于按以下配方配制：100mM Tris-HCl、1.4M NaCl、20mM EDTA、2％CTAB、1％～4％PVP-40，使用前须在60～70℃下预热。

3.权利要求1所述的粪样总DNA提取方法中，所述的β-巯基乙醇溶液的特征在于：其用裂解菌体时的浓度(v/v)范围为1％～3％，且需单独添加于菌悬液中。

4.权利要求1所述的粪样总DNA提取方法中，其所述的粪样预处理的特征在于按如下步骤操作：

(2)在200～400×g下离心2～8min后，尽可能多的取出上层悬液于另一无菌的50ml离心管B中；

(3)将步骤(2)所得的沉淀再用适量的PBS缓冲液重洗一次，并于200～400×g下离心2～8min，取出上层悬液合并于离心管B中；

(4)加适量体积的一定浓度的多聚甲醛溶液溶液于离心管B中，并将其置于4℃孵育1～2h；

(5)然后，6000～10000×g离心5～10min，弃上清，所得菌体沉淀用适量的预冷的P溶液重悬，混匀后，于-20℃下保存30min以上；

(6)在6000～10000×g离心5～10min后，弃上清，再用适量的PBS缓冲液对所得菌体沉淀重新洗涤，之后再离心，弃上清，收集菌体沉淀；

(7)所得的菌体沉淀用适量的TE缓冲液重悬，混匀后即得经预处理的粪便样品菌悬液，可用于总DNA的提取。

5.权利要求2所述的粪便样品预处理中，所述的多聚甲醛溶液的特征在于其按以下配方制备：取多聚甲醛1～6g，置于烧杯中，加入80ml 0.01mol/L PBS溶液后，55～65℃下磁力搅拌，使其完全溶解，并加入少许NaOH溶液至溶液清亮，用0.01mol/L PBS定容至100ml，于室温放置。

6.权利要求2所述的粪便样品预处理中，所述的P溶液的特征在于按以下方式配制：用等体积的PBS缓冲液及无水乙醇混合，并置于-20℃下保存，备用。