CN110904093A - 一种鱼类肠道细菌群落基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，通过超低温冷冻肠道样品，以便于肠道内容物的收集和肠道粘膜的剥离，利于样品中的细菌收集；在细菌收集步骤中，通过低速离心除去样品中的组织碎片；超声波破碎收集的细菌，加入STE缓冲液除去细菌中的蛋白质和多聚糖，并加入酚氯仿溶液和氯仿异戊醇溶液进一步去除可溶性杂蛋白；最终通过异丙醇抽提获取鱼类肠道细菌群落基因组DNA。本发明提取方法采用常规实验试剂和设备，无特殊实验条件要求，可以在较短时间内获取鱼类肠道细菌群落基因组PCR扩增所需的DNA模板，操作步骤简便，重复性好，易于操作推广。该提取方法的成本低于商业化试剂盒，具有广泛的应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体是一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法。
背景技术
细菌群落基因组DNA的提取方法主要有细胞裂解后苯酚-氯仿抽提、异丙醇纯化以及SDS沉淀法，也有采用chelex-100或碱性裂解提取法等。目前提取肠道细菌群落基因组相对较为简便的方法是采用商业化粪便或者土壤细菌群落基因组DNA提取试剂盒。通过试剂盒提取获得的基因组DNA，通常去除原有细菌群落样本中的蛋白质和脂肪酸，再通过醇类沉淀去除加入的酚类等试剂，所得DNA质量较高，可满足多数实验需求。
肠道细菌群落基因组DNA是DGGE分析和建立有代表性的16S rRNA文库的基础，这些技术和方法广泛应用于多项研究和应用领域，例如对鱼类肠道细菌群落结构的多样性分析、细菌群落结构特征鉴定等。但现在没有针对鱼类肠道细菌群落基因组DNA提取的商业化试剂盒，而目前实验室培养方法只能分离纯化自然界约1％的微生物。采用分子生物学方法研究肠道环境中细菌群落，需要先克服肠道环境中细菌种类众多、成分复杂、干扰性物质影响下游实验操作等问题，因此，建立一种针对肠道环境的高效、快速的细菌群落基因组DNA提取方法是进行肠道样品细菌群落研究的基础。
鱼类肠道细菌群落基因组DNA提取的目标是获取高质量的基因组DNA，保证DNA的完整性，便于进一步建立DGGE分析方法和代表性的16S rRNA文库。但是鱼类肠道环境成分十分复杂，尤其在基因组DNA提取过程中难以去除脂类、酸性物质等有机物，直接影响下游的PCR扩增、酶切反应的效果。除此之外，个体较小鱼类肠道样品含有的细菌群落数量也较少，经过细胞破裂、蛋白质等去除、DNA纯化等多个步骤，最终获取的基因组DNA浓度或者纯度较低，不足以进行下游的实验操作，目前大多基因组DNA提取方法都存在这些问题。
为了解决提取鱼类肠道细菌群落基因组DNA存在的细菌裂解不完全、酶反应抑制物、DNA不完整等问题，需要一种适合鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中细菌裂解不完全、酶反应抑制物、DNA不完整等缺陷，提供一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，该提取方法操作步骤简便，重复性好，可获得纯度和浓度较高、完整的DNA，成本低于商业化试剂盒，具有广泛的应用价值和前景。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70～75％酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-70～-80℃保存24h；
(2)纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5～1mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；
(3)将步骤(2)中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10～20min，100～200g离心2～5min，将上清液转移至一个新的1.5mL的无菌Ep管中；
(4-1)将步骤(3)中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400～600mV，工作2～4s，间隔3～8s，共重复40～50次；
(4-2)将步骤(4-1)中无菌Ep管冰上冷却5～10min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400～600mV，工作2～4s，间隔3～8s，共重复40～50次，收集破碎产物；
(4-3)将步骤(4-2)收集的破碎产物，在4～8℃条件下2000～4000g离心5～8min，收集上清液，并得到沉淀；
(5)在步骤(4-3)得到的沉淀中加入0.5～1mL的STE缓冲液和50～80μL的浓度为20～50mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1℃水浴20～30min，得到混悬液；
(6)将步骤(5)得到的混悬液2000～4000g离心5～8min，收集上清液，并与步骤(4-3)收集的上清液混合；
(7-1)在步骤(6)混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000～12000g离心5～10min，收集上清液；
(7-2)在步骤(7-1)收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000～12000g离心5～10min，收集上清液；
(8-1)在步骤(7-2)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000～12000g离心5～10min，收集上清液；
(8-2)在步骤(8-1)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000～12000g离心5～10min，收集上清液；
(9)在步骤(8-2)收集的上清液中加入0.6～1.0倍体积的预冷的80％异丙醇，-18～-20℃冰冻10～20min后，10000～12000g离心5～10min，再用100％异丙醇洗两次沉淀；
(10)在步骤(9)中经100％异丙醇洗后的沉淀中加入50～100μL的TE缓冲液，室温放置2～5min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-70～-80℃保存备用。
本发明提取方法通过超低温冷冻肠道样品，以便于肠道内容物的收集和肠道粘膜的剥离，利于样品中的细菌收集；在细菌收集步骤中，通过低速离心除去样品中的组织碎片；超声波破碎收集的细菌，加入STE缓冲液除去细菌中的蛋白质和多聚糖，并加入酚氯仿溶液和氯仿异戊醇溶液进一步去除可溶性杂蛋白；最终通过异丙醇抽提获取鱼类肠道细菌群落基因组DNA。
作为优选，以1L的STE缓冲液体积计，步骤(2)和步骤(5)中所用STE缓冲液由50～100mmol/L的Tris-HCl、50～100mmol/L的EDTA·2Na、0.5～1％的CTAB和0.8～1mol/L的NaCl组成，用NaOH调节STE缓冲液的pH值至7.5～8.5。CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性；在高离子强度的溶液中(＞0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白和多聚糖形成复合物经离心除去，可有效提高下游PCR反应的灵敏性。本发明在所用STE缓冲液加入CTAB提取基因组DNA，无需蛋白酶K的消化作用，也不需要柱纯化系统；CTAB与蛋白、多糖形成复合物后可离心除去，不影响后续的酶反应。
作为优选，以1L的TE缓冲液体积计，步骤(10)中所用TE缓冲液由5～10mmol/L的Tris-HCl和5～10mmol/L的EDTA·2Na组成，用NaOH调节TE缓冲液的pH值至7.5～8.5。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明采用物理、化学结合的方法提取鱼类肠道细菌群落基因组DNA，适合于小体积样品中细菌群落基因组DNA的提取，可获得纯度和浓度较高、完整的DNA，并且对下游实验操作干扰少，便于后续的PCR或者酶切等反应。
(2)本发明提取方法采用常规实验试剂和设备，无特殊实验条件要求，可以在较短时间内获取鱼类肠道细菌群落基因组PCR扩增所需的DNA模板，操作步骤简便，重复性好，易于操作推广。该提取方法不会因为样本DNA的减少或丢失而影响细菌种群分析，成本低于商业化试剂盒，具有广泛的应用价值和前景。
附图说明
图1为本发明方法与现有细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的核酸电泳图对比；
图2为本发明方法与现有细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的16S rRNA PCR电泳图对比；
图3为本发明方法与现有细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的DGGE电泳图对比。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70％酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-80℃保存24h；
(2)纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；
(3)将步骤(2)中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10min，100g离心2min，将上清液转移至一个新的1.5mL的无菌Ep管中；
(4-1)将步骤(3)中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400mV，工作2s，间隔3s，共重复40次；
(4-2)将步骤(4-1)中无菌Ep管冰上冷却5min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400mV，工作2s，间隔3s，共重复40次，收集破碎产物；
(4-3)将步骤(4-2)收集的破碎产物，在4℃条件下2000g离心5min，收集上清液，并得到沉淀；
(5)在步骤(4-3)得到的沉淀中加入0.5mL的STE缓冲液和50μL的浓度为20mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1℃水浴20min，得到混悬液；
(6)将步骤(5)得到的混悬液4000g离心5min，收集上清液，并与步骤(4-3)收集的上清液混合；
(7-1)在步骤(6)混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后12000g离心5min，收集上清液；
(7-2)在步骤(7-1)收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后12000g离心5min，收集上清液；
(8-1)在步骤(7-2)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，12000g离心5min，收集上清液；
(8-2)在步骤(8-1)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，12000g离心5min，收集上清液；
(9)在步骤(8-2)收集的上清液中加入0.6倍体积的预冷的80％异丙醇，-20℃冰冻10min后，12000g离心5min，再用100％异丙醇洗两次沉淀；
(10)在步骤(9)中经100％异丙醇洗后的沉淀中加入50μL的TE缓冲液，室温放置2min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-80℃保存备用。
实施例2的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度75％酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-75℃保存24h；
(2)纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.75mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；
(3)将步骤(2)中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡15min，200g离心3min，将上清液转移至一个新的1.5mL的无菌Ep管中；
(4-1)将步骤(3)中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压500mV，工作3s，间隔5s，共重复45次；
(4-2)将步骤(4-1)中无菌Ep管冰上冷却5min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压500mV，工作3s，间隔5s，共重复45次，收集破碎产物；
(4-3)将步骤(4-2)收集的破碎产物，在4℃条件下4000g离心8min，收集上清液，并得到沉淀；
(5)在步骤(4-3)得到的沉淀中加入0.75mL的STE缓冲液和70μL的浓度为65mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1℃水浴25min，得到混悬液；
(6)将步骤(5)得到的混悬液2000g离心7min，收集上清液，并与步骤(4-3)收集的上清液混合；
(7-1)在步骤(6)混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000g离心8min，收集上清液；
(7-2)在步骤(7-1)收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000g离心8min，收集上清液；
(8-1)在步骤(7-2)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000g离心10min，收集上清液；
(8-2)在步骤(8-1)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000g离心10min，收集上清液；
(9)在步骤(8-2)收集的上清液中加入0.8倍体积的预冷的80％异丙醇，-18℃冰冻15min后，10000g离心10min，再用100％异丙醇洗两次沉淀；
(10)在步骤(9)中经100％异丙醇洗后的沉淀中加入100μL的TE缓冲液，室温放置5min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-80℃保存备用。
实施例3的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70％酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-80℃保存24h；
(2)纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入1mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；
(3)将步骤(2)中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡15min，100g离心3min，将上清液转移至一个新的1.5mL的无菌Ep管中；
(4-1)将步骤(3)中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压600mV，工作4s，间隔8s，共重复50次；
(4-2)将步骤(4-1)中无菌Ep管冰上冷却5min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压500mV，工作3s，间隔5s，共重复45次，收集破碎产物；
(4-3)将步骤(4-2)收集的破碎产物，在4℃条件下3000g离心6min，收集上清液，并得到沉淀；
(5)在步骤(4-3)得到的沉淀中加入1mL的STE缓冲液和80μL的浓度为50mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1℃水浴30min，得到混悬液；
(6)将步骤(5)得到的混悬液3000g离心8min，收集上清液，并与步骤(4-3)收集的上清液混合；
(7-1)在步骤(6)混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后12000g离心6min，收集上清液；
(7-2)在步骤(7-1)收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后12000g离心6min，收集上清液；
(8-1)在步骤(7-2)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，11000g离心8min，收集上清液；
(8-2)在步骤(8-1)收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，11000g离心8min，收集上清液；
(9)在步骤(8-2)收集的上清液中加入0.7倍体积的预冷的80％异丙醇，-20℃冰冻10min后，12000g离心5min，再用100％异丙醇洗两次沉淀；
(10)在步骤(9)中经100％异丙醇洗后的沉淀中加入60μL的TE缓冲液，室温放置3min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-70℃保存备用。
以上实施例1～3中，以1L的STE缓冲液体积计，步骤(2)和步骤(5)中所用STE缓冲液由100mmol/L的Tris-HCl、100mmol/L的EDTA·2Na、1％的CTAB和1mol/L的NaCl组成，用NaOH调节STE缓冲液的pH值至8.0；以1L的TE缓冲液体积计，步骤(10)中所用TE缓冲液由10mmol/L的Tris-HCl和5mmol/L的EDTA·2Na组成，用NaOH调节TE缓冲液的pH值至8.0。
本发明提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的核酸电泳图见图1，16S rRNA PCR电泳图见图2，DGGE电泳图见图3。
图1中，M代表DL 5,000marker，1代表本发明方法提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的核酸电泳图，2代表进口细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的核酸电泳图，3代表国产细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的核酸电泳图。从图1可见，本发明方法提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的浓度较高且完整，无明显受损。
图2中，1代表国产细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的16SrRNAPCR电泳图，2代表进口细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的16SrRNA PCR电泳图，3代表本发明方法提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的16S rRNAPCR电泳图。从图2可见，本发明方法提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA，经定量模板DNA后16S rRNA PCR扩增效率高，无非特异性扩增，进一步说明本发明方法提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA不影响后续酶反应并且结构完整。
图3中，1代表本发明方法提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的DGGE电泳图，2代表进口细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的DGGE电泳图，3代表国产细菌DNA提取试剂盒提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA的DGGE电泳图。从图3可见，本发明方法提取的鱼类肠道细菌群落基因组DNA，经定量模板DNA后16S rRNA和DGGE PCR扩增效率高，相比商业化试剂盒的结果，更为全面反映鱼类肠道细菌群落结构，更为准确分析鱼类肠道细菌群落特征。
Claims (3)
1.一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）鱼体表面用灭菌水清洗后，再用浓度70~75 %酒精棉擦拭三次，无菌剖开鱼体腹腔，取出完整鱼肠道置于无菌离心管中，再将无菌离心管迅速置于-70~-80 ℃保存24 h；
（2）纵向剖开鱼肠道，收集肠道内容物，刮取肠黏膜至肠道壁呈半透明状，并将肠道内容物和肠黏膜置于1.5 mL的无菌Ep管中，再向该无菌Ep管内加入0.5~1 mL的STE缓冲液，浸没肠道内容物和肠黏膜；
（3）将步骤（2）中装有肠道内容物和肠黏膜的无菌Ep管涡旋震荡10~20 min，100~200 g离心2~5 min，将上清液转移至一个新的1.5 mL的无菌Ep管中；
（4-1）将步骤（3）中装有上清液的无菌Ep管置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600 mV，工作2~4 s，间隔3~8 s，共重复40~50次；
（4-2）将步骤（4-1）中无菌Ep管冰上冷却5~10 min，再置于冰上超声波破碎细菌，超声波破碎仪的工作条件为：工作电压400~600 mV，工作2~4 s，间隔3~8 s，共重复40~50次，收集破碎产物；
（4-3）将步骤（4-2）收集的破碎产物，在4~8 ℃条件下2000~4000 g离心5~8 min，收集上清液，并得到沉淀；
（5）在步骤（4-3）得到的沉淀中加入0.5~1 mL的STE缓冲液和50~80 μL的浓度为20~50mg/mL的溶菌酶，充分混匀后置于37±1 ℃水浴20~30 min，得到混悬液；
（6）将步骤（5）得到的混悬液2000~4000 g离心5~8 min，收集上清液，并与步骤（4-3）收集的上清液混合；
（7-1）在步骤（6）混合后的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；
（7-2）在步骤（7-1）收集的上清液中加入同等体积的由苯酚、氯仿和异戊醇以25∶24∶1的体积比混合而成的酚氯仿溶液，剧烈震荡后10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；
（8-1）在步骤（7-2）收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；
（8-2）在步骤（8-1）收集的上清液中加入同等体积的由氯仿和异戊醇以24∶1的体积比混合而成的氯仿异戊醇溶液，10000~12000 g离心5~10 min，收集上清液；
（9）在步骤（8-2）收集的上清液中加入0.6~1.0倍体积的预冷的80%异丙醇，-18~-20 ℃冰冻10~20 min后，10000~12000 g离心5~10 min，再用100%异丙醇洗两次沉淀；
（10）在步骤（9）中经100%异丙醇洗后的沉淀中加入50~100 μL的TE缓冲液，室温放置2~5 min，获得鱼类肠道细菌群落基因组DNA，-70~-80 ℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，以1 L的STE缓冲液体积计，步骤（2）和步骤（5）中所用STE缓冲液由50~100 mmol/L的Tris-HCl、50~100 mmol/L的EDTA•2Na、0.5~1 %的CTAB和0.8~1 mol/L的NaCl组成，用NaOH调节STE缓冲液的pH值至7.5~8.5。
3.根据权利要求1所述的一种鱼类肠道细菌群落基因组DNA的提取方法，其特征在于，以1 L的TE缓冲液体积计，步骤（10）中所用TE缓冲液由5~10 mmol/L的Tris-HCl和5~10mmol/L的EDTA•2Na组成，用NaOH调节TE缓冲液的pH值至7.5~8.5。
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