CN101302509B - 一种提取植物dna的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提取植物DNA的方法，它涉及一种提取DNA的方法。它解决了目前植物DNA提取方法都只对含有少量多糖的植物提取材料有效，对多糖含量高的植物或部位基本无效的问题。提取方法：一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后转入提取缓冲液I中进行水浴，再离心；二、取步骤一离心沉淀物转提取缓冲液II中进行水浴，之后加入氯仿离心；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后离心，再用乙醇洗涤离心沉淀，然后干燥，即得到植物提取材料的DNA。本发明方法是一种可以广泛使用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影响，在DNA提取过程中可将植物中的多糖彻底去除，提高了DNA提取的效率、纯度和质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取DNA的方法。
背景技术
DNA是分子生物学研究的主要对象之一，在进行分子生物学操作过程中，基因组DNA的质量好坏是影响其成败的关键因素。例如，在PCR过程中多糖、多酚和色素等都会严重的影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合导致扩增失败。
植物尤其是一些林木中含有大量的多糖物质，多糖是提取植物DNA的主要干扰物质，由于它与核酸的物理性质非常相似，在提取过程中多糖物质通常与DNA共沉淀下来，非常难与DNA分开，因此严重地影响了所提取的DNA的质量。目前，国内外在提取植物基因组DNA过程中，为了去除多糖采用以下几种方法：①用低浓度乙醇去除多糖法：在DNA提取液中加入无水乙醇至终浓度10％～30％，再通过酚/仿抽提去除多糖，或者是先用浓度为100mmol/L的NaAc溶解DNA沉淀，再用低浓度乙醇抽提分离出多糖；②CTAB法：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)比SDS(十二烷基硫酸钠)去除多糖类物质的效果好，适当地提高CTAB和β-巯基乙醇的含量(不低于1％)可有效地去除多糖等次生物质；但是此方法中如果CTAB浓度过高，在保温时提取材料与CTAB缓冲液难以充分混匀，这就需要延长保温时间，也同时增加了DNA降解的机率；③在去除多糖时采用先加不含CTAB的缓冲液抽提多糖，在通过离心除去多糖的方法；④高盐沉淀多糖法：认为缓冲液中含有高浓度的NaCl将有助于去除多糖。
但是目前的这几种去除多糖提取植物DNA的方法都只对含有少量多糖的植物提取材料有效，而对于多糖含量高的植物(如：白桦)或部位(如：老叶片)基本无效，因此目前尚未有一种普遍有效的去除植物材料中多糖，保证所提取DNA质量的DNA提取方法，特别是缺乏有效的、针对多糖含量高的植物的DNA提取方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前植物DNA提取方法都只对含有少量多糖的植物提取材料有效，对多糖含量高的植物或部位基本无效的问题，而提供的一种提取植物DNA的方法。
提取植物DNA按以下步骤进行：一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15～0.25g研磨粉末转入1mL提取缓冲液I中在温度为45±1℃的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min；二、取步骤一离心沉淀物转入0.5～1mL提取缓冲液II中在温度为65±1℃的条件下水浴10min，之后加入0.5～1mL氯仿在12000g的条件下离心5min；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000～12000g条件下离心10min，再用体积浓度为75％、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后室温气干，即得到植物提取材料的DNA；其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为0.16mol/L；步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为1mol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1mL/100mL。
本发明方法步骤一中在45±1℃的条件下进行水浴可以使多糖和RNA完全溶解在提取缓冲液I中，而DNA则与蛋白形成复合物DNP沉淀出来(DNP在提取缓冲液I中溶解度极低)，因此通过离心即可将DNA与多糖及RNA分开。本发明方法步骤二提取缓冲液II中CTAB的浓度提高到2.5g/100mL，同时还加入了另一种去污剂十二烷基肌氨酸钠(SLS)，促进DNA与蛋白质的分离，并提高了DNA在提取缓冲液II中的溶解。本发明方法是一种可以广泛使用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影响，在DNA提取过程中可将植物中的多糖彻底去除，提高了DNA提取的效率、纯度和质量。
附图说明
图1是具体实施方式六所提取的DNA的凝胶电泳图，图2是采用现有CTAB法所提取的DNA的凝胶电泳图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式提取植物DNA按以下步骤进行：一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15～0.25g研磨粉末转入1mL提取缓冲液I中在温度为45±1℃的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min；二、取步骤一离心沉淀物转入0.5～1mL提取缓冲液II中在温度为65±1℃的条件下水浴10min，之后加入0.5～1mL氯仿在12000g的条件下离心5min；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000～12000g条件下离心10min，再用体积浓度为75％、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后空气室温干燥，即得到植物提取材料的DNA；其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为0.16mol/L；步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为1mol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1mL/100mL。
本实施方式在提取过程中采用低浓度NaCl溶液去除多糖，效果显著，克服了本领域技术人员的偏见。
本实施方式方法特别适用于多糖含量高的植物材料提取DNA。
本实施方式方法操作简单，易于掌握，步骤少，可有效的提高植物DNA提取效率。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二水浴过程中将装有提取缓冲液II和离心沉淀物的离心管颠倒3～10次。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式可以保证反应均匀且充分，提高植物DNA的提取质量。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中加入的异丙醇的温度为0～4℃(预冷)。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式可以有效的沉淀DNA，提高植物DNA的得率。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中加入氯仿后用振荡器震荡2～3min，然后再进行离心。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式可以保证氯仿作用充分，有效去除杂蛋白，提高植物DNA的质量。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：将提取得到的植物DNA置于TE缓冲液中保藏。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式提取白桦成熟叶片DNA按以下步骤进行：一、白桦成熟叶片用液氮研磨成粉末，然后取0.2g研磨粉末转入1mL提取缓冲液I中在温度为45℃的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min；二、取步骤一离心沉淀物转入0.6mL提取缓冲液II中在温度为65℃的条件下水浴10min，之后加入0.6mL氯仿在12000g的条件下离心5min；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在12000g条件下离心10min，再用体积浓度为75％、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后空气室温干燥，即得到白桦成熟叶片的DNA；其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为0.16mol/L；步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为1mol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1mL/100mL。
白桦的组织细胞中含有大量的多糖、多酚，本实施方式提取缓冲液I作用后的上清成粘稠状，说明溶解了大量的多糖；步骤一沉淀呈白色，说明大量的多糖已经在步骤一中去除了。本实施方式所提取的DNA的凝胶电泳图如图1所示。
现有CTAB法提取相同的白桦成熟叶片：取白桦成熟叶片在研钵中加入-196℃的液氮，将植物组织迅速研磨成粉末，把粉末转入65℃预热的含2mLCTAB的提取缓冲液的离心管中(提取缓冲液中Tris的浓度为100mmol/L；EDTA的浓度为20mmol/L；NaCl的浓度为1.4mol/L；CTAB的浓度为2.0g/100mL；巯基乙醇的浓度为2～5mL/100mL)，使之充分混匀，于65℃水浴保温30min，期间缓慢颠倒离心管数次，保温30min后，使之冷却至室温(室温应大于15℃，否则CTAB-核酸复合物会发生沉淀)，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)进行抽提，缓慢颠倒离心管混匀10min，再12000rpm室温离心10min，将上清液转入另一离心管中，弃沉淀；(重复抽提2次)在上清液中加入等体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混合均匀，室温放置10～20min，沉淀DNA12000rpm室温离心10min，弃上清液，用0.5ml的75％乙醇洗涤2次以除去残留的盐；空气干燥后，将沉淀物溶于200μL灭菌去离子水中。
CTAB法所得沉淀较多，呈淡黄色，加入的TE缓冲液溶解较困难，呈粘稠状；提取的DNA的凝胶电泳图如图2所示。
图1和图2凝胶电泳结果进行比较，可以清楚的看出本实施方式提取的DNA条带明亮、整齐，其带型无降解拖尾现象，DNA得率高，说明本实施方式所提取的DNA比采用现有CTAB法提取的DNA的质量更为优异。
Claims (1)
1.一种提取白桦成熟叶片DNA的方法，其特征在于提取白桦成熟叶片DNA的方法按以下步骤进行：一、白桦成熟叶片用液氮研磨成粉末，然后取0.2g研磨粉末转入1mL提取缓冲液I中在温度为45℃的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min；二、取步骤一离心沉淀物转入0.6mL提取缓冲液II中在温度为65℃的条件下水浴10min，之后加入0.6mL氯仿在12000g的条件下离心5min；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在12000g条件下离心10min，再用体积浓度为75％、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后空气室温干燥，即得到白桦成熟叶片的DNA；其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸、NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为0.16mol/L；步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸、NaCl、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基肌氨酸钠、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、NaCl的浓度为1mol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1mL/100mL。
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