CN103013985B

CN103013985B - 一种白桦叶片基因组dna提取方法

Info

Publication number: CN103013985B
Application number: CN201310016274.5A
Authority: CN
Inventors: 魏志刚; 杨传平; 张力杰; 曲赞霜; 候聪
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2015-01-07
Anticipated expiration: 2033-01-17
Also published as: CN103013985A

Abstract

本发明公开了一种白桦叶片基因组DNA提取方法，改良了CTAB与STE溶液；采用常温下等体积的改良CTAB溶液和STE溶液洗涤充分研磨的材料2次；水浴裂解温度由65℃提高至70℃；在沉淀DNA时，采用无水乙醇:异丙醇(体积比为2:1)混合沉淀剂，低速离心，以降低杂质的沉淀。这种方法能分离出高质量的白桦叶片基因组DNA。

Description

一种白桦叶片基因组DNA提取方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及的是一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。

背景技术

高纯度基因组DNA是基因组测序、基因克隆、分子杂交、基因文库构建和分子标记等一系列分子生物学研究的前提。白桦叶片中酚类、多糖、萜类等次生物质含量较高，特别是生长在我国东北白桦，由于要适应东北地区较为严酷的地理及气候环境，体内各种次生物质种类更多、含量更高，会对DNA的提取造成更为严重的影响。因此，如何去除这些杂质以获得高质量的DNA是白桦叶片基因组DNA提取过程中面临的主要问题，也是对白桦进行分子生物学研究的前提条件。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种高质量白桦叶片基因组DNA提取方法。

本发明的技术方案如下：

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300μL改良STE溶液，300μL改良CTAB溶液（改良STE溶液和改良CTAB溶液等体积）和20μLβ—巯基乙醇，混合后震荡3min；改良CTAB溶液配方：2.5﹪（W/V）CTAB，150mmol/LTris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/L NaCl；改良SET溶液配方：150mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl；

②常温5000g离心5min,弃上清；向沉淀中加入加600μL改良CTAB溶液和20μLβ—巯基乙醇70℃水浴15min后16060g离心5min；

③取上清加入等体积氯仿充分混匀，16060g离心5min，重复此步骤1~2次；

④取上清加入等体积的无水乙醇:异丙醇混合液(体积比为2:1)，上下颠倒混合均匀后常温下静置3min，6080g离心3min；

⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2~3次，干燥后溶于50μL TE或去离子水中；

⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。

本发明的提取方法方法能提取出高质量白桦叶片基因组DNA，其核心技术包括以下几个内容：1、改良了CTAB与STE溶液；2、采用常温下等体积的改良CTAB溶液和STE溶液洗涤经充分研磨的材料2次；3、水浴裂解温度由65℃提高至70℃；4、在沉淀DNA时，采用无水乙醇:异丙醇(体积比为2:1)混合沉淀剂，低速离心，以降低杂质的沉淀。这种方法能分离出高质量的白桦叶片基因组DNA。

附图说明

图1为不同方法提取的白桦DNA电泳结果；1、2泳道：为CTAB法提取的DNA；3、4泳道：为SDS法提取的DNA；5、6泳道：方法Ⅲ提取的DNA电泳；7泳道：方法Ⅳ（STE洗涤1次）提取的DNA；8泳道：方法Ⅴ（CTAB洗涤1次）提取的DNA；

图2为方法Ⅳ提取的白桦DNA电泳结果；1.和2泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤1次后提取的白桦基因组DNA；3.和4泳道STE和CTAB洗涤混合液洗涤1次后提取的白桦基因组DNA；5.和6泳道为STE和CTAB洗涤混合液洗涤2次后提取的白桦基因组DNA；

图3为方法Ⅳ提取的白桦DNA EcoR I与MseI酶切电泳结果；1.为白桦叶片基因组DNA；2.白桦叶片基因组DNA被EcoR I酶切后电泳结果；3.白桦叶片基因组DNA被MseI酶电泳切结果；4.标准DNA分子量；5～7泳道为重复；

图4为白桦不同个体叶片基因组DNA的RAPD扩增结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

材料：白桦叶片取自东北林业大学校园内已达开花结实的白桦，于8月未摘取的成熟叶片，叶片保存在-20℃冰箱。

试剂：

CTAB溶液：（2﹪（W/V）CTAB，100mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/LEDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）

STE溶液：（100mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），

改良CTAB溶液：（2.5﹪（W/V）CTAB，150mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）；

改良SET溶液：（150mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA（pH8.0），1.4mmol/LNaCl）；

其他试剂：40mmol/L巯基乙醇，100mmol/L Tris·HCI（pH8.0），20mmol/LEDTA，10%SDS，10mol/L LiCI（高压灭菌），氯仿/异戊醇（24：1），Tris饱和酚，5mol/L KAC，TE缓冲液。EcoRI和MseI酶购自纽英伦公司。其他均为常规国产试剂。

主要仪器和设备：凝胶成像系统(UVP)，MIKRO120微量台式高速离心机(Hettich)，-20℃超低温冰箱(Harris)，-40℃低温冰箱（海尔公司），超纯水仪(Milipore)；DYY-Ⅲ-12B型三恒多用电泳仪（六一仪器厂），可见紫外分光光度计(ABI)；涡旋振荡器GL-88B（江苏海门麒麟医用仪器厂）。

1．DNA提取方法

方法Ⅰ：常规的CTAB法参照王关林等的《植物基因工程》。

方法Ⅱ：SDS法参照顾洪雅的方法。

方法Ⅲ：

①向1.5μL的无菌离心管加600μLCTAB裂解液和20μLβ-巯基乙醇，65℃浴热5min。

②从-20℃取出材料后加液氮研磨至材料成灰白色，向步骤①中的每个离心管中加约0.04g材料，剧烈震荡混匀，65℃浴热10min。

③随后加入1/3体积5mol/L KAC（pH8.0），充分混匀。再加入200μLTris饱和酚(pH9.5)和300μL氯仿。轻轻震荡10min。

④常温16060g离心10min，取600μL上清液加入等体积的酚(同上)：氯仿（3：1），轻轻震荡5min。

⑤常温16060g离心10min，取600μL上清液加适量无水乙醇，再加入等体积氯仿后震荡5min。

⑥常温16060g离心10min，取上清加入2/3体积异丙醇，轻轻混匀3min。

⑦常温6080g离心5min，去上清液后加适量水溶解，加入1/10体积3mol/LNaAC和2.5倍体积乙醇-20℃沉淀30min。

⑧常温6080g离心10min，去上清液后用70%酒精洗涤2~3次，室温或真空干燥后加55μLTE溶解。电泳检测DNA的完整性，A_260/280测定DNA浓度和纯度。

方法Ⅳ：

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，向1.5μL的无菌离心管加600μLSTE和20μLβ—巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清;向下层沉淀中加入600μL CTAB后剧烈振荡混匀,65℃浴热10min;再加入400μL Tris饱和酚(pH9.5)和200μL氯仿,轻轻振荡10min。

②常温16060g离心10min，取600μL上清液加入等体积的酚(同上)：氯仿（3：1），轻轻震荡5min。

③常温16060g离心10min，取600μL上清液加适量无水乙醇，再加入等体积氯仿后震荡5min。

④常温16060g离心10min，取上清加入2/3体积异丙醇，轻轻混匀3min。

⑤常温6080g离心5min，去上清液后加适量水溶解，加入1/10体积3mol/LNaAC和2.5倍体积乙醇-20℃沉淀30min。

⑥常温6080g离心10min，去上清液后用70%酒精洗涤2~3次，室温或真空干燥后加55μLTE溶解。电泳检测DNA的完整性，A_260/280测定DNA浓度和纯度。

方法Ⅴ：

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，向1.5μL的无菌离心管加600μLCTAB溶液和20μLβ—巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清;向下层沉淀中加入600μL CTAB后剧烈振荡混匀,65℃浴热10min;再加入400μL Tris饱和酚(pH9.5)和200μL氯仿,轻轻振荡10min。

③常温16060g离心10min，取600μL上清液加等体积氯仿后震荡5min。

⑥常温6080g离心10min，去上清液后用70%酒精洗涤2~3次，室温或真空干燥后加55μLTE溶解。电泳检测DNA的完整性，A_260/280测定DNA浓度和纯度。Ⅶ

方法Ⅵ：

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，分别用STE和CTAB溶液（等体积）与20μLβ-巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清。重复此步骤1~2次。

②常温5000g离心5min,弃上清。向沉淀中加入加600μL改良的CTAB溶液和20μLβ-巯基乙醇70℃水浴15min后16060g离心5min。

③取上清加入等体积氯仿充分混匀，16060g离心5min，重复此步骤1~2次。

④取上清加入等体积无水乙醇:异丙醇(体积比为2:1)，上下颠倒混合均匀后常温静置3min，6080g离心3min。

⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2~3次，干燥后溶于50μL TE或去离子水中。

⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。

方法Ⅶ：

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300μL改良STE溶液、300μL改良CTAB溶液（改良STE溶液和改良CTAB溶液等体积）和20μLβ—巯基乙醇，混合震荡3min。

②常温5000g离心5min,弃上清。向沉淀中加入加600μL改良的CTAB溶液和20μLβ—巯基乙醇70℃水浴15min后16060g离心5min。

④取上清加入等体积无水乙醇:异丙醇(体积比为2:1)，上下颠倒混合均匀后常温下静置3min，6080g离心3min。

⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。

方法Ⅷ

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，分别用改良STE和CTAB溶液（等体积）与20μLβ—巯基乙醇混合震荡3min。常温5000g离心5min,弃上清。重复此步骤1次。

⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。

2.DNA质量检测

2.1DNA完整性检测

在0.8%的琼脂糖凝胶中，于5V/cm电压下电泳，检测总DNA的完整性。

2.2DNA纯度检测

通过紫外分光光度测定260nm/280nm比值判断总DNA的纯度。

2.3DNA酶切检测

白桦叶片基因组DNA EcoRI单酶解，反应体积20μL：DNA800ng，酶2U，EcoR I Buffer 2μL。酶解条件：37℃，反应2h。

白桦叶片基因组DNA MseI单酶解,反应体积20μL：DNA800ng，酶2U，MseI Buffer 2μL。酶解条件：37℃，反应2h。

白桦叶片基因组DNA双酶切体系：2.9μL DNA(50ng/μL),5μL 10×Buffer，0.5μL100×BSA,0.8μL MseI(10U/μL),0.4μL EcoRI(20U/μL)，加离子水至50μL去。

酶解产物点样于1.5%的琼脂糖凝胶上电泳、观察并拍照。

2.4白桦叶片基因组DNA PCR扩增检测

扩增体系（20μL）：1.2μLMg²⁺（25mmol/L），0.4μLdNTPs（2.5mmol/L）,0.4μLRAPD引物（50pmol/μL），1μLTaq DNA聚合酶（1U/μL），1μ模板DNA（40ng/μL），2μL10×PCRbuffer。扩增程序：94℃4min，然后进入下列循环：94℃45s，56℃45s，72℃80s，35个循环；72℃7min。PCR仪为MJ-9600。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上120V电泳2h，UVP凝胶成像系统拍照。

3.结果与分析

3.1CTAB法、SDS法、方法Ⅲ、方法Ⅳ和方法Ⅴ提取的DNA电泳检测结果

分别取2μL DNA样品，在0.8%的琼脂糖凝胶上用高电场（5V/cm）电泳法检测其DNA的完整性。结果表明，常规CATB法（图1中1、2泳道）、SDS法（图1中3、4泳道），方法Ⅲ提取的DNA（图1中5、6泳道）；方法Ⅳ（STE溶液洗涤1次）提取的DNA（图1中7泳道），方法Ⅴ（CTAB溶液洗涤1次）提取的DNA（图1中8泳道）提取白桦基因组DNA时多糖污染严重，样孔中EB吸收明显，而且有大量的降解RNA的存在。此外，此图为电泳1:30h后的图谱，可以看出，DNA没有离开样孔，说明DNA已与多糖等次生物质相结合，在电场中无法迁移。因此，常规的CTAB、SDS法，方法Ⅲ、方法Ⅳ和方法Ⅴ和均不适应富含较高多糖和次生物质的白桦叶片基因组DNA提取。

3.2方法Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ的白桦DNA完整性和纯度的检测

图2中1和2泳道为方法Ⅵ提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果，其DNA仍然在点样孔附近，说明DNA中仍含有多糖或其也次生代谢物质。图2中3和4泳道为方法Ⅶ提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果，其电泳后DNA条带正齐，说明提以的DNA完整、无降解，而且将叶片中的RNA已完合去除，但点样孔仍然有发亮的现象，说明提取的DNA中仍含有少量的多糖或次生代谢物质。图2中5和6泳道为方法Ⅷ提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果，其电泳后DNA条带正齐，说明提以的DNA完整、无降解，而且将叶片中的RNA已完合去除，而且点样孔非常干净，说明提取的DNA中已完全去除了多糖或次生代谢物质。

方法Ⅳ提取的白桦叶片基因组DNA电泳结果如图2中5~6泳道所示，点样孔较干净，说明方法Ⅳ中用SET多次洗涤对于去除多糖效果明显。同时，也可以明显看出，方法Ⅷ提取的DNA电泳条带亮度较弱，说明有SET多次洗涤时，也造成了DNA的大量丢失。5~6泳道对应DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀分别为1.82和1.84,表明提取的DNA中没有蛋白质或其他物质的污染，符合分子生物学研究所要求的质量标准，说明改造后的方法较为适合提取富含多糖的白桦叶片基因组DNA。

3.3方法Ⅷ的提取的DNA的酶切验证

为了进一步验证图2中5、6泳道对应的方法提取的DNA的质量，进行了EcoR和MseI单酶切和双酶切实验，酶切后电泳结果如图3所示。结果表明，不论是单酶切还是双酶切，酶切后的DNA均呈弥散状，酶切效果较好，说明DNA纯度较高，完全可以进行后续的分子生的学操作。

3.4方法Ⅷ的提取的DNA的RAPD扩增验证

以方法Ⅵ提取不同纤维长度的白桦个体叶片基因组DNA材料，用筛选出的多态性高的引物进行扩增分析，扩增产物电泳结果如图4，结果表明，不同纤维长度个体扩增结果均较好，说明提取的DNA分子完全可来进行分子标记等分子生物实验研究。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种白桦叶片基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

①叶片在加液氮的研钵中研磨至细末后，加入300 μL改良STE溶液，300 μL改良CTAB溶液和20 μL β-巯基乙醇，混合后震荡3min；改良CTAB溶液配方：2.5%(W/V) CTAB，150 mmol/L Tris-Cl pH8.0，20 mmol/L EDTA pH8.0，1.4 mmol/L NaCl；改良SET溶液配方：150 mmol/L Tris-Cl pH8. 0，20mmol/L EDTA pH8. 0，1.4 mmol/L NaCl；

②常温5000g离心5min，弃上清；向沉淀中加入600 μL改良CTAB溶液和20μL β-巯基乙醇70℃水浴15min后16060g离心5min；

③取上清加入等体积氯仿充分混匀，16060g离心5min，重复此步骤l~2次；

④取上清加入等体积的无水乙醇:异丙醇混合液，无水乙醇:异丙醇的体积比为2:1，上下颠倒混合均匀后常温下静置3min，6080g离心3min；

⑤倒掉上清液，用70%预冷的乙醇洗涤2~3次，干燥后溶于50 μL TE或去离子水中；

⑥电泳检测DNA的完整性，A260/280测定DNA浓度和纯度。