CN104404031A - 一种同时提取高质量海带配子体dna/rna的方法 - Google Patents

Abstract

一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，属于分子生物学领域，它包括材料选择、材料多次研磨和裂解、抽取、沉淀和溶解、DNA/RNA的纯化；可以解决现有技术存在的材料用量大、须液氮研磨、DNA/RAN获取量少、DNA片段小、多糖污染率高等问题。本发明的目的在于提供一个简单易行的、适用于实验室常规同时制备海带配子体DNA/RNA的方法。

Description

一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法。 

背景技术

海带是日本、朝鲜和前苏联远东地区沿海的原产植物，1927年海带被首次引进到我国,并逐渐适应了我国的海洋环境。海带已经成为世界上重要的经济海藻，它的用途很广，在医药、食品、化工等方面都有广泛的应用。作为一种优良的蔬菜，我国生产的海带大部分是作为食品的。我国的海带除了食用外，还有一大部分作为工业原料提取碘、褐藻胶、甘露醇等产品。褐藻胶在纺织、印染、医药和食品等工业用途很广。它的衍生物也是重要的工业原料。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，分子生物学技术已应用到海带的起源与进化、遗传与变异、种质鉴定、系统发育、基因组解析等方面的研究中，相关的技术，诸如PCR，RT-PCR，qRT-PCR，microarray，cDNA l ibrary construction，SNP genotyping，DNA methylation profiling和next-generation sequencing等技术的实施都需要高质量的DNA或RNA。除了对纯度的要求外，特别是用于建库的DNA，要求基因组DNA的完整性的同时，其长度要达到建库的要求。目前，关于褐藻DNA制备方法的已有一些报道，在研磨样品时，多采用液氮研磨。使用液氮虽然有利于充分研磨样品，但是也会严重破坏DNA长链完整性，无法达到DNA测序的标准。同时，这些方法多数都需要价格高昂的试剂盒(如TRIzol reagent,Invi trogen,Carlsbad,CA,USA or RNeasy ki t,Qiagen,Valencia, CA,USA)，更重要的是这些试剂盒对于淀粉、多糖和多酚含量高的物种效果并不佳，而且使用的液氮研磨方法要么对遗传物质损伤、要么难以有效提取遗传物质。因而，对于问题物质(例如褐藻胶、多糖等)含量很高的褐藻来说，高质量DNA和RNA的提取一直以来就是一个很大的问题，特别是基因组测序种用于构建大片段库的DNA提取一直是个世界难题，这在很大程度上阻碍了褐藻生物学的发展。海带是一种典型的不等世代交替的海藻，它的生活史包括无性世代的孢子体和有性世代的配子体两个阶段。其中实验室用于常年保存、更具获得性的就是呈丝状体的配子体阶段。但由于配子体的生物量相对于孢子体较少，且在配子体生长阶段是与各种菌体共生的，材料选择不当就会出现由于杂菌干扰而难以提取高质量DNA/RNA的问题。因而，建立一种需要生物量少而遗传物质得率高、提取步骤简单快速、DNA片段长、同时获得高纯度DNA和RNA的方法，是目前从事褐藻分子生物学研究人员所渴求的。 

发明内容

本发明提供了一种海带配子体体DNA/RNA同时的制备方法，可以解决现有技术存在的材料用量大、须液氮研磨、DNA/RAN获取量少、DNA片段小、多糖污染率高等问题。本发明的目的在于提供一个简单易行的、适用于实验室常规同时制备海带配子体DNA/RNA的方法。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现： 

一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，它包括材料选择、材料多次研磨和裂解、抽取、沉淀和溶解、DNA/RNA的纯化； 

所述的材料选择为测定配子体叶绿素的荧光参数Fv/Fm值，选择Fv/Fm值在0.3-0.6的配子体； 

所述的材料多次研磨和裂解为取海带配子体清洗后，放在研钵中，加入CTAB 裂解缓冲液，研磨至组织溶解；将组织溶解液分装于Ep管中，加入钢珠，涡旋，在10℃环境中，使用组织研磨器进一步研磨；离心后，取上清，向沉淀中加入CTAB裂解缓冲液，涡旋，在10℃环境中，使用组织研磨器再次研磨；离心取上清； 

所述的抽提为(1)将研磨和裂解后得到的上清液混合，加入冷乙醇和3M KAc溶液，混合均匀，样品至于冰上8-10min；(2)再往上清液中加入氯仿-异戊醇的混合液，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，充分混合后，在冰上轻轻震荡20min；(3)将步骤(2)震荡后得到的溶液离心，取上清，加入乙醇和氯仿充分混合，样品至于冰上轻轻震荡20min； 

所述的沉淀和溶解为将所述抽提中步骤(3)震荡后的溶液离心，取上清，加入异丙醇和3M NaAc，混合均匀，-20℃环境中沉淀1h；离心，弃掉上清，加入冷75％乙醇洗涤核酸沉淀；离心，用移液枪吸出上层清液，至于超净工作台风干；风干后用无核酸酶的水溶解沉淀，得到核酸混合溶液； 

所述的DNA/RNA的纯化为测定核酸混合溶液的OD值，估算核酸浓度，每10～25μg核酸，加入RNase A和无核酸酶水或DNase I和10×DNase Reaction Buffer和无核酸酶水，使核酸溶液的最终体积为100μL，37℃下培养20min或30min后；再加入无核酸酶的水，使核酸溶液的最终体积为500μL；加入苯酚和氯仿-异戊醇混合液，所述的混合液中氯仿-异戊醇的体积比为24:1，混匀后，室温震荡10min；再次离心，取上清，加入氯仿-异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混匀后，室温震荡10min；然后重复所述沉淀和溶解的步骤，最后得到DNA或RNA的溶液。 

进一步，在所述的CTAB裂解缓冲液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二硫苏糖醇(DTT)，使其在CTAB裂解液中的终浓度分别为2％(质量比)和50mM。 

进一步，所述的CTAB裂解缓冲液的成分及其终浓度为100mM Tris，50mM EDTA，2M NaCl，2％CTAB(质量比),所述的CTAB裂解缓冲液pH>8。 

进一步，在使用组织研磨器研磨时，由于样品数量大，将样品分装于2ml Ep管中。 

进一步，所述加入的冷乙醇和3M KAc的量分别为相对于上清液体积的1/9倍和1/4倍。 

进一步，在所述抽提的步骤(2)中加入的氯仿-异戊醇混合液的体积与上清液的体积相等，氯仿、异戊醇的体积比为24:1。 

进一步，在所述抽提的步骤(3)中加入的乙醇和氯仿分别是0.2～0.3倍于上清液体积和1倍于上清液体积。 

进一步，在所述的沉淀和溶解步骤中加入的异丙醇和3M NaAc分别是0.8倍于上清液体积和0.1倍于上清液体积。 

进一步，在所述的DNA(RNA)的纯化步骤中，加入苯酚和氯仿-异戊醇混合液的体积分别为溶液体积的0.5倍和1倍，所述的溶液为需要加入苯酚和氯仿-异戊醇混合液的溶液。 

本发明与现有技术相比的有益效果 

本发明方法能够提取高质量的DNA，满足建库要求，同时本发明去掉液氮研磨的步骤，一方面能否得到大片段的DNA，同时节省了提取DNA的成本。 

本发明发明利用配子体提取DNA/RNA，在实验室培养阶段就能获得，取材方便，同时避免了利用孢子体提取是的褐藻胶或多糖的干扰，为获得高质量的DNA提供了保障。 

本发明通过对材料的选择，剔出杂菌含量高的材料，避免配子体中的杂菌含量太高而对DNA或RNA的提取结果进行干扰。 

附图说明

图1本发明方法提取的DNA在1％的琼脂糖凝胶电泳图谱：中M-1为Trans 2k plus，上样2μl，M-2为λDNA，上样4μl，标为标准品上样5μl(10ng/μl)，图中对应表1序列中1为原液稀释2倍上样1μl。 

图2RNA在1％的琼脂糖凝胶电泳图谱：中M为Trans 2K plus，图中对应表2序列，1和2为原液稀释10倍，上样量均为2μl。 

图3使用安捷伦2100检测图2中1号RNA样品质量的峰值和结果，原液稀释4倍，上样量为1μl。 

图4使用安捷伦2100检测图2中2号RNA样品质量的峰值和结果，原液稀释7倍，上样量为1μl。 

图5对照实施例方法提取的DNA在1％的琼脂糖凝胶电泳图谱：中M为λDNA，1为样品原液上样1μl。 

具体实施方式

实施例1 

一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，它包括材料选择、材料多次研磨和裂解、抽取、沉淀和溶解、DNA/RNA的纯化；具体操作如下： 

取新鲜海带配子体在过滤的海水中清洗后，测定配子体叶绿素的荧光参数Fv/Fm值，选择Fv/Fm值在0.3-0.6的配子体。 

将1g配子体放在研钵中，加入含有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二硫苏糖醇(DTT)CTAB裂解缓冲液10ml，PVP和DTT在CTAB裂解缓冲液中的终浓度分别为2％(质量比)和50mM。研磨至组织溶解；将组织溶解液分装于6个2ml Ep管中，在Ep管中分别加入2个3mm钢珠，涡旋，在10℃环境中，使用组织研磨器研磨20min；然后离心(45sec、8100×g)，将上清收集在50ml离心管中，将 离心管插在冰里；向2mL离心管(内容物有沉淀和玻璃珠)加入含有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和二硫苏糖醇(DTT)CTAB裂解缓冲液1.5ml，使用组织研磨器再次研磨20min；所述的CTAB裂解缓冲液的成分及其终浓度为100mM Tris，50mM EDTA，2M NaCl，2％CTAB(质量比),所述的CTAB裂解缓冲液pH>8。 

然后离心(45sec、8100×g)，将上清收集在上述50ml离心管中；向50ml离心管加入1/9倍于上清液体积的纯乙醇、1/4倍于上清液体积的3M醋酸钾(pH4.8)，混合均匀后，在冰上培养10min；然后加入等体积氯仿-异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24:1，v/v)，充分混合后，在冰上轻轻震荡20min；离心(14200×g、20min、4℃)，将上层清液收集在新的50ml离心管里，离心管插在冰里；向离心管加入0.3倍于溶液体积预冷的纯乙醇，震荡防止核酸析出；然后加入等体积氯仿，充分混合后，在冰上轻轻震荡20min；离心(14200×g、20min、4℃)，将上层清液收集在新的50ml离心管里，离心管插在冰里；向离心管加入0.8V异丙醇和0.1V 3M醋酸钠，混合均匀后，在-20℃环境中沉淀1h；然后离心(11300×g、30min、4℃)，弃掉上清液，使用与上清等量的预冷75％乙醇洗涤核酸沉淀；离心(11300×g、10min、4℃)，弃掉上清液，用移液枪吸出上层清液，至于超净工作台风干；核酸溶解于无核酸酶的水中，得到核酸混合溶液；使用nano2000，取1μl核酸样品，测得样品浓度为571.7ng/μl；使用2ml离心管，每10-25μg DNA，加入2μl RNase A(10mg/mL)和适量无核酸酶水，使核酸溶液最终体积为100μl，37℃金属浴培养20min；然后加入无核酸酶水，使核酸溶液最终体积为500μL；然后加入0.5倍体积苯酚和1倍体积氯仿-异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1，v/v)，混合均匀后，室温震荡10min；然后离心(12000×g、15min、4℃)，将上清液收集在新的1.5ml离心管里，加入等体积氯仿-异戊醇混合液(氯仿:异戊醇＝24:1，v/v)，混匀后，室温震荡10min；离 心(12000×g、15min、4℃)，将上清液收集在新的1.5ml离心管里；向离心管的上清液加入0.8V异丙醇和0.1V 3M醋酸钠，混合均匀后，在-20℃环境中沉淀30min；然后离心(11300×g、30min、4℃)，弃掉上清液，使用与上清等量的预冷75％乙醇洗涤核酸沉淀；离心(11300×g、10min、4℃)，弃掉上清液，用移液枪吸出上层清液，至于超净工作台风干；核酸溶解于无核酸酶的水中，得到纯化的DNA溶液；使用nano2000，取1μl核酸样品，测得样品浓度、纯度见表1；使用1％的琼脂糖胶和凝胶电泳，检测核酸样品质量，如图1，完全能够满足建库要求。 

本实施例中所有的提到的加入溶液的量是几倍体积时，均是指需要加入该种物质溶液的体积，例如向离心管的上清液加入0.8V异丙醇和0.1V 3M醋酸钠，是指加入的异丙醇的量为0.8倍于上清液的体积；3M醋酸钠的量为0.1倍于上清液的体积。 

在纯化RNA时，每10～25μg RNA中加入10μL DNase I(1U/μL)和5μL10×DNase Reaction Buffer，加入适量的无核酸水，使核酸溶液的最终体积100μL，其余步骤同DNA的提取方法。最终得到纯化的RNA溶液，使用1％的琼脂糖凝胶电泳，初步检测核酸样品质量，如图2。使用nano2000测得样品浓度、纯度见表2。使用安捷伦2100检测样品完整性，如图3、图4。 

表1、纯化后DNA溶液的浓度和纯度。 

DNA	浓度(ng/ul)	体积(ul)	总量(ug)	OD260/280	OD260/230
						1	370	15	5.55	1.898	1.848

表2、纯化后RNA溶液的浓度和纯度。 

实施例2 

本实施例采用常规的液氮研磨的方法来提取配子体中的DNA，其余步骤完全与实施例2相同，最后得到DNA溶液，使用1％的琼脂糖凝胶电泳，检测核酸样品质量，如图5。 

Claims (9)

1.一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于它包括材料选择、材料多次研磨和裂解、抽取、沉淀和溶解、DNA/RNA的纯化；

所述的材料选择为测定配子体叶绿素的荧光参数Fv/Fm值，选择Fv/Fm值在0.3-0.6的配子体；

所述的材料多次研磨和裂解为取海带配子体清洗后，放在研钵中，加入CTAB裂解缓冲液，研磨至组织溶解；将组织溶解液分装于Ep管中，加入钢珠，涡旋，在10℃环境中，使用组织研磨器进一步研磨；离心后，取上清，向沉淀中加入CTAB裂解缓冲液，涡旋，在10℃环境中，使用组织研磨器再次研磨；离心取上清；

所述的抽提为(1)将研磨和裂解后得到的上清液混合，加入冷乙醇和3M KAc溶液，混合均匀，样品至于冰上8-10min；(2)再往上清液中加入氯仿-异戊醇的混合液，氯仿与异戊醇的体积比为24:1，充分混合后，在冰上轻轻震荡20min；(3)将步骤(2)震荡后得到的溶液离心，取上清，加入乙醇和氯仿充分混合，样品至于冰上轻轻震荡20min；

所述的沉淀和溶解为将所述抽提中步骤(3)震荡后的溶液离心，取上清，加入异丙醇和3M NaAc，混合均匀，-20℃环境中沉淀1h；离心，弃掉上清，加入冷75％乙醇洗涤核酸沉淀；离心，用移液枪吸出上层清液，至于超净工作台风干；风干后用无核酸酶的水溶解沉淀，得到核酸混合溶液；

所述的DNA/RNA的纯化为测定核酸混合溶液的OD值，估算核酸浓度，每10～25μg核酸，加入RNase A和无核酸酶水或加入DNase I和10×DNase React ionBuffer和无核酸酶水，使核酸溶液的最终体积为100μL，37℃下培养20min或30min后；再加入无核酸酶的水，使核酸溶液的最终体积为500μL；加入苯酚和氯仿-异戊醇混合液，所述的混合液中氯仿-异戊醇的体积比为24:1，混匀后，室温震荡10min；再次离心，取上清，加入氯仿-异戊醇混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混匀后，室温震荡10min；然后重复所述沉淀和溶解的步骤，最后得到DNA或RNA的溶液。

2.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于在所述的CTAB裂解缓冲液中加入聚乙烯吡咯烷酮和二硫苏糖醇，聚乙烯吡咯烷酮和二硫苏糖醇在CTAB裂解缓冲液中的终浓度分别为2％(质量比)和50mM。

3.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于所述的CTAB裂解缓冲液的成分及其终浓度为100mM Tris，50mM EDTA，2M NaCl，2％CTAB(质量比),所述的CTAB裂解缓冲液pH>8。

4.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于在使用组织研磨器研磨时，由于样品数量大，将样品分装于2ml Ep管中。

5.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于所述加入的冷乙醇和3M KAc的量分别为相对于上清液体积的1/9倍和1/4倍。

6.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于在所述抽提的步骤(2)中加入的氯仿-异戊醇混合液的体积与上清液的体积相等，氯仿、异戊醇的体积比为24:1。

7.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于在所述抽提的步骤(3)中加入的乙醇和氯仿分别是0.2～0.3倍于上清液体积和1倍于上清液体积。

8.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于在所述的沉淀和溶解步骤中加入的异丙醇和3M NaAc分别是0.8倍于上清液体积和0.1倍于上清液体积。

9.根据权利要求1所述的一种同时提取高质量海带配子体DNA/RNA的方法，其特征在于在所述的DNA或RNA的纯化步骤中，加入苯酚和氯仿-异戊醇混合液的体积分别为溶液体积的0.5倍和1倍，所述的溶液为需要加入苯酚和氯仿-异戊醇混合液的溶液。