JP2007124926A - Ｄｎａ抽出剤およびそれを用いるｄｎａ抽出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 農産物（穀類、野菜）、畜産物（肉類）、水産物（魚介類）、毛髪、体液、微生物等に含まれるＤＮＡを迅速、簡便且つ安価に多数の検体からも抽出できる技術を提供する。
【解決手段】 緩衝液、ＳＤＳおよびプロテナーゼＫを同時に添加、混合した水溶液から成るＤＮＡ抽出剤を用いる。このＤＮＡ抽出剤を検体に添加し加温処理した後、クロロホルム−イソアミルアルコール等を添加するという簡単な工程によりＤＮＡを抽出できる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、各種の検体（生物試料）からＤＮＡを簡便且つ迅速に抽出することのできるＤＮＡ抽出剤およびそれを用いるＤＮＡ抽出方法に関する。

ＤＮＡ分析は、学問の分野においてのみならず、産業上または社会的ないろいろな要求からも益々重要になっている。例えば、食品産業の分野においては、食品の偽装表示問題などに因り食品の原材料のＤＮＡ分析の必要性が高まっており、この要求を満たすとともに食品の流通を妨げないために迅速な分析結果が求められている。ＤＮＡの分析は、大略、ＤＮＡの抽出、ＤＮＡの増幅、および解析の各工程から成り、このうち、ＤＮＡの抽出に特に時間を要する。

ＤＮＡを抽出するための従来から知られている手法は、各種の酵素や試薬を用いる煩雑で多段階の工程から構成されている。例えば、米などの植物体からのＤＮＡ抽出には酵素法やＣＴＡＢ法が知られている（非特許文献１：「ＤＮＡ分析による稲品種の識別」独立行政法人食品総合研究所発行）が、このうち、酵素法は、ＤＮＡを抽出すべき検体を加熱処理する工程、その後に抽出バッファー（緩衝液）を加える工程、アミラーゼにより処理工程、更に、ＳＤＳとタンパク質分解酵素を加えて処理する工程を含む。また、ＣＴＡＢ法は、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）を添加して処理する工程、抽出バッファーにより処理、除タンパク質処理工程等を複数回繰り返す煩雑な工程から成るものである。そして、これらの酵素法やＣＴＡＢ法は、ＤＮＡ抽出に6〜24時間以上必要であった。

また、近年では磁気ビーズを使用した自動抽出装置（非特許文献２：「磁気ビーズを用いて行うＤＮＡ抽出」澤上 一美 Medical Technology, Vo.30, No.6, 623-624, 2002、非特許文献３：「磁性粒子を用いた小型自動核酸抽出装置」東條 百合子、小幡 公道 Medical
Science Digest, Vo.28(5), 48-51, 2002）が開発されている。約60分でＤＮＡを抽出できるが、同時に処理できる検体数が6〜8検体と非常に少なく、多検体のＤＮＡ抽出を行う場合には、抽出時間が倍々に増えるという難点があった。さらに検体の種類によって試薬の変更が必要であり、汎用性に問題があった。
「ＤＮＡ分析による稲品種の識別」独立行政法人食品総合研究所 「磁気ビーズを用いて行うＤＮＡ抽出」澤上 一美 Medical Technology, Vo.30, No.6, 623-624, 2002 「磁性粒子を用いた小型自動核酸抽出装置」東條 百合子、小幡 公道 Medical Science Digest, Vo.28(5), 48-51, 2002

本発明の目的は、上述したような問題を解決して、迅速、簡便且つ安価に多数の検体からＤＮＡを抽出することのできる新しい技術を提供することにある。

本発明に従えば、上記課題を解決するものとして、核酸抽出緩衝液に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびプロテナーゼＫを混合した水溶液から成ることを特徴とするＤＮＡ抽出剤が提供される。

さらに、本発明は、ＤＮＡを抽出しようとする検体に前記ＤＮＡ抽出剤を添加して50〜60℃の温度下で加温処理する工程、および前記加温処理後の検体からタンパク質を除去する工程を含むことを特徴とするＤＮＡの抽出方法も提供する。

本発明によれば、短時間で簡便かつ確実、安価に精製されたＤＮＡの抽出が可能である。本発明のＤＮＡ抽出剤を用いて本発明のＤＮＡ抽出方法を実施すれば、例えば、20検体のＤＮＡ抽出を約80分、40検体のＤＮＡ抽出を約100分で行うことができる。また、大量の検体からＤＮＡを抽出する場合においても、抽出工程が最小限であることから手間もかからず、検体の数に応じて抽出時間が倍々に増えるという難点も解消される。

背景技術の酵素法に関連した既述の説明から理解されるように、ＤＮＡを抽出するための従来の手法においては、緩衝液（抽出バッファー）、各種分解酵素、ＳＤＳを別々に順々に添加する作業を実施している。つまり緩衝液にＤＮＡを溶出させて、不純物を順番に除去する手法である。

これに対して、本発明のＤＮＡ抽出剤は、緩衝液、ＳＤＳおよびプロテナーゼＫが同時に添加、混合されて成るこれまでにないユニークなＤＮＡ抽出剤である。すなわち、本発明のＤＮＡ抽出剤は、本来は不純物の除去に使用する分解酵素およびＳＤＳを検体の細胞を破砕する目的で使用して、単一の工程で専らＤＮＡの抽出収量および抽出速度が増加するよう構成されている。本発明に従うＤＮＡ抽出剤のこのような特徴は、緩衝液、分解酵素およびＳＤＳの混合物が作用する最適温度と時間を検討することにより実現されたものである。

上述したように、本発明のＤＮＡ抽出剤の特徴は、ＳＤＳおよび分解酵素（プロテナーゼＫ）を第一義的には細胞の破砕目的で使用することにある。かくして、本発明のＤＮＡ抽出剤を構成する水溶液中、安価で細胞の破砕能力の高いＳＤＳは、濃度10％のＳＤＳに換算して4〜8体積％含有される。これに対して、従来の手法におけるように主として不純物の除去に用いるＳＤＳの使用量（濃度）は、一般に、濃度2％のＳＤＳに換算して8体積％含有され、本発明における場合よりも低い。また、プロテナーゼＫは、通常、RNaseフリーのものが使用されるが、細胞破砕を第一義的目的とする本発明のＤＮＡ抽出剤においては、安価でタンパク質分解能力の高いプロテナーゼＫ（RNase等の不純物が精製されていないもの）で十分である。そして、本発明のＤＮＡ抽出剤におけるプロテナーゼＫは、一般に、濃度５mg/mlのプロテナーゼＫに換算して１〜３体積％含有されるようにするのが好ましい。

本発明のＤＮＡ抽出剤を構成する緩衝液については、特に限定されるものではなく、ＤＮＡの抽出や分離に従来より用いられている緩衝液（抽出バッファー）と同様のものが使用可能である。特に好ましい緩衝液としては、トリス塩酸バッファー、塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡから構成されるものがあり、例えば、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）、ＮａＣｌおよび0.5Ｍ ＥＤＴＡから成る系が挙げられる。

トリス塩酸バッファーの他に、トリシンバッファー等も使用可能であり、トリス塩酸バッファーに比べ、より生理的に近い環境を呈することができるが高価なことが難点である。ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）は、塩濃度や浸透圧を高めるのに使用されるものであり、ＫＣｌ（塩化カリウム）で代用可能であるが、一般的にはＮａＣｌが好ましい。ＥＤＴＡは、よく知られているように、重金属による影響を抑えたり酵素を不活化させたりする代表的なキレート試薬であるが、同様の作用をする他のキレート試薬で代用することも可能である。

本発明に従えば、如上の本発明のＤＮＡ抽出剤を検体に添加して50〜60℃の温度下で加温処理した後、検体からタンパク質を除去するという簡単な工程によりＤＮＡを抽出することができる。加温処理に要する時間は、一般に、10分〜15分と非常に短くてよい。

本発明のＤＮＡ抽出剤を用いる加温処理後のタンパク質の除去は、親水性が低く、タンパク質溶解性のある試薬を添加することによって行われるのが好ましい。この条件に適い本発明において用いられるのに特に好ましい試薬は、クロロホルム−イソアミルアルコール（例えば24：1）である。このクロロホルム−イソアミルアルコール混合溶媒に更にフェノールを加えて、クロロホルム−イソアミルアルコール−フェノール（例えば、24：1：25）混合溶媒でも代用可能である。
上述したようなＤＮＡ抽出処理の後は、当該技術分野において知られた精製操作（例えば、遠心分離、アルコールによる沈澱）を行えばよい。

本発明は、農産物（植物体、籾、玄米、精米、炊飯米、加工品）、畜産物（肉、加工品）、水産物（魚肉、加工品）、毛髪（毛根付き毛髪、毛幹）、さらには、体液（血液、精液など）、微生物（細菌など）等の各種検体（生物試料）からＤＮＡを抽出するのに適用することができるが、これらに限定されるものではない。本発明のＤＮＡ抽出に従えば、分解酵素及びＳＤＳにより細胞を破砕することにより農産物、畜産物、水産物、毛髪、体液、微生物のいずれの検体においても、試薬を変更することなく、その使用量を変更することによりＤＮＡ抽出が可能である。
以下、実施例により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（試薬の調製）
抽出バッファーは、下記のｉ〜ｖｉに示す試薬を調合して本発明に従うＤＮＡ抽出剤の１例を調製した。
ｉ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ２００ｍｌ
ｉｉ ＮａＣｌ １４．６ｇ
ｉｉｉ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５０ｍｌ
ｉｖ １０％ＳＤＳ ５０ｍｌ
ｖ Ｈ_２Ｏ ６５０ｍｌ
ｖｉ ５ｍｇ／ｍｌプロテナーゼＫ １０ｍｌ
また、ＤＮＡ抽出後に添加するタンパク質除去を目的とする試薬としてクロロホルム−イソアミルアルコール（24：1）を調製した。

（精米のＤＮＡ抽出）
精米50ｇをミルサーにより粉砕し、粉砕物から1.5mlチューブにスパーテルにて検体として0.1ｇ採取した。この検体に、実施例１で調製したＤＮＡ抽出バッファーを1000μl加えて攪拌後、60℃において10分加温した。その後、実施例１で調製したクロロホルム−イソアミルアルコールを500μl添加後、1分間転倒攪拌した。
次いで、遠心操作（16000g、10分）に供し、上澄み液を別の1.5mlチューブに300μl採取して２−プロパノールを200μl加えて攪拌した。5分静置後に遠心操作（16000g、20分）にかけ、上澄みを廃棄して沈殿物を乾燥した。これに70％エタノールを200μl添加後、すぐに廃棄した。エタノールを気化させた後、1×ＴＥ（Tris-EDTA）10μlを加えて冷蔵庫にて保管した。
その後、0.8％アガロースゲルによる電気泳動にてＤＮＡを確認した。図１に電気泳動図を示しており、精米のＤＮＡの存在が同定できた。

（毛髪のＤＮＡ抽出）
毛髪を解剖用ハサミにより1〜1.5ｃｍ程度に切断し、1.5mlチューブにピンセットにて検体として全量採取した。この検体に、実施例１で調製したＤＮＡ抽出バッファーを500μlとプロテナーゼKを追加で100μｌ加えた。さらに解剖用のハサミで5ｍｍ以下の切片に切断した。攪拌後、60℃において30分加温した。その後、実施例１で調製したクロロホルム−イソアミルアルコールを500μl添加後、５分間転倒攪拌した。
次いで、遠心操作（16000g、10分）に供し、上澄み液を別の1.5mlチューブに500μl採取して２−プロパノールを400μl加えて攪拌した。5分静置後に遠心操作（16000g、20分）にかけ、上澄みを廃棄して沈殿物を乾燥した。これに70％エタノールを200μl添加後、すぐに廃棄した。エタノールを気化させた後、1×ＴＥ（Tris-EDTA）20μlを加えて冷蔵庫にて保管した。
通常であれば0.8％アガロースゲルによる電気泳動にてＤＮＡを確認するが、毛髪に含まれるＤＮＡ量は微量であり、ＤＮＡの存在を同定する為にＤＮＡを使用してしまうと検査に必要な十分量が確保できないため、確認作業は行わないものとする。

（精肉のＤＮＡ抽出）
精肉50ｇを冷凍後にミルサーにより粉砕し、粉砕物から1.5mlチューブにスパーテルにて検体として0.1ｇ採取した。この検体に、実施例１で調製したＤＮＡ抽出バッファーを1000μl加えて攪拌後、60℃において10分加温した。その後、実施例１で調製したクロロホルム−イソアミルアルコールを500μl添加後、５分間転倒攪拌した。その後、遠心操作（16000g、10分）に供し、上澄み液を別の1.5mlチューブに800μl採取して、再度クロロホルム−イソアミルアルコールを500μl添加後、５分間転倒攪拌した。次いで遠心操作（16000g、10分）に供し、上澄み液を別の1.5mlチューブに500μl採取して、２−プロパノールを400μl加えて攪拌した。5分静置後に遠心操作（16000g、20分）にかけ、上澄みを廃棄して沈殿物を乾燥した。これに70％エタノールを200μl添加後、すぐに廃棄した。エタノールを気化させた後、1×ＴＥ（Tris-EDTA）10μlを加えて冷蔵庫にて保管した。
その後、0.8％アガロースゲルによる電気泳動にてＤＮＡを確認した。図２に電気泳動図を示しており、精肉のＤＮＡの存在が同定できた。

本発明に従って抽出された精米のＤＮＡの存在を示す電気泳動図である。 本発明に従って抽出された精肉のＤＮＡの存在を示す電気泳動図である。

Claims (5)

1. 緩衝液に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびプロテナーゼＫを混合した水溶液から成ることを特徴とするＤＮＡ抽出剤。
2. 濃度10％のＳＤＳに換算して4〜8体積％のＳＤＳを含有し、濃度5mg/mlのプロテナーゼＫに換算して1〜3体積％のプロテナーゼＫを含有する水溶液から成ることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ抽出剤。
3. 前記緩衝液が、トリス塩酸バッファー、塩化ナトリウムおよびＥＤＴＡから構成されるものであることを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ抽出剤。
4. ＤＮＡを抽出しようとする検体に請求項１〜３のいずれかのＤＮＡ抽出剤を添加して50〜60℃の温度下で加温処理する工程、および前記加温処理後の検体からタンパク質を除去する工程を含むことを特徴とするＤＮＡの抽出方法。
5. 前記タンパク質除去工程が、クロロホルム−イソアミルアルコールを添加することによって行われることを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡの抽出方法。